彭 璐 楊健華 王 巍 王 琦

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林長春130118）

柳生金針菇（Flammulina rossica）隸屬擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌目、金針菇屬，是一種食用菌[1]，首次發(fā)現(xiàn)在俄羅斯東部[2]。研究組利用形態(tài)和分子系統(tǒng)發(fā)育方法，對世界上現(xiàn)知的冬菇屬種類進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)我國有4種，柳生金針菇為我國的新記錄種[3]。朱宴妍等研究發(fā)現(xiàn)，柳生金針菇胞外粗多糖具有免疫及抗腫瘤活性，其胞外多糖對肝癌小鼠的免疫網(wǎng)絡(luò)有廣泛的影響，但發(fā)揮藥理作用的機(jī)制尚不明確[4]。筆者對柳生金針菇深層發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化及對菌絲體多糖提取工藝進(jìn)行研究，以期篩選出能提高柳生金針菇多糖產(chǎn)量的液體培養(yǎng)條件，為柳生金針菇深層發(fā)酵的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為后續(xù)研究菌絲體多糖結(jié)構(gòu)及其生物活性提供充足的原料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株柳生金針菇菌株：分離于采自四川省稻城縣香格里拉鄉(xiāng)亞丁村（地理坐標(biāo)：100°16′E，28°13′N）的柳生金針菇子實(shí)體（編號：T23093）。菌種保藏于食藥用菌教育部工程研究中心菌種庫。

1.2 培養(yǎng)基（1）平板培養(yǎng)基（PDA綜合培養(yǎng)基）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.75 g，VB10.1 g、瓊脂 20 g，水 1 L，pH 自然[5]。（2）液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母浸粉2 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.75 g，VB110 mg、水1 L，pH自然[6]。（3）液體培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，蛋白胨 2 g，酵母浸粉 2 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.75 g，VB110 mg，水1 L，pH自然[7，8]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柳生金針菇菌種ITS鑒定 采用CTAB法提取柳生金針菇菌絲rDNA并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測同時(shí)對所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’）和ITS4（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）。PCR采用50 μL擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s；72℃延伸2 min，共計(jì)30個(gè)循環(huán)，72℃溫浴10 min。

1.3.2 制備母種 將在4℃條件下保存的柳生金針菇菌種取出，放于24℃恒溫培養(yǎng)箱中活化一天。然后制備PDA培養(yǎng)基，取一小塊活化后的菌種，于無菌條件下接種于該P(yáng)DA培養(yǎng)基上，后將其放在24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，選擇菌絲潔白、生長速度快的菌種作為母種。

1.3.3 液體菌種培養(yǎng) 將已活化好的柳生金針菇菌種（0.5 cm大小2塊）在無菌條件下接入100 mL液體種子培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶），23℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5～7 d，制得一級種子液。

1.3.4 液體發(fā)酵條件篩選

1.3.4.1 裝液量篩選 配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入250 mL三角瓶，裝液量分別為60 mL、90 mL、120 mL、150 mL、180 mL，121℃高壓滅菌25 min，滅菌后于無菌室無菌操作臺接種10%液體柳生金針菇菌種，23℃、150 r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)，設(shè)三次重復(fù)。一周后測定菌絲體干重，發(fā)酵液多糖含量，篩選最適裝液量。

1.3.4.2 接種量篩選 接種量分別為5%、10%、15%、20%和25%。培養(yǎng)方法等同1.3.4.1，篩選最適接種量。

1.3.4.3 最適溫度篩選 培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為17℃、20℃、23℃、26℃和29℃。培養(yǎng)方法等同1.3.4.1，篩選最適溫度。

1.3.4.4 搖床轉(zhuǎn)速篩選 搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min和180 r/min，培養(yǎng)方法等同1.3.4.1，篩選最適轉(zhuǎn)速。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 選擇裝液量、接種量、最適溫度、搖床轉(zhuǎn)速4個(gè)因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素三個(gè)水平，測定菌絲體干重及發(fā)酵液多糖產(chǎn)量，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

1.3.6 熱水浸提法提取多糖工藝 選取對菌絲體多糖提取有較大影響的3個(gè)因素，即浸提時(shí)間、液料比和浸提溫度，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)[8]，以菌絲體多糖提取率為指標(biāo)，確定菌絲體多糖提取的最佳工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（33）見表2。提取工藝：將抽濾得到的菌絲體用蒸餾水洗滌至洗滌液無色，放置45℃烘箱中恒溫干燥，準(zhǔn)確稱取1.0000 g烘干菌絲體，研磨成粉末，按照表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)，提取菌絲體多糖。每組提取3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用4倍體積無水乙醇4℃冰箱沉淀過夜，3500 r/min離心，分離收集沉淀，乙醇液回收再利用，沉淀于-80℃冷凍過夜，真空冷凍干燥機(jī)干燥，稱重，溶解粗多糖，棄沉淀，再次醇沉過夜，收集沉淀，-80℃預(yù)冷過夜，真空冷凍干燥，稱重并計(jì)算提取率。

表2 熱水浸提法L9（33）正交試驗(yàn)因素及水平

提取率（%）=（菌絲體粗多糖總量/菌絲體干重）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 柳生金針菇序列分析試驗(yàn)以ITS1和ITS4為引物，對柳生金針菇rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將測定結(jié)果應(yīng)用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行同源相似性比較，結(jié)果表明：與KF179735.1的同源相似性達(dá)到98%，表明試驗(yàn)所用的柳生金針菇與GenBank數(shù)據(jù)庫中的柳生金針菇為同種。

2.2 液體發(fā)酵條件篩選

2.2.1 裝液量對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響 食用菌在液體發(fā)酵過程中需要一定的氧氣供應(yīng)，裝液量的多少直接影響培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣含量，其他培養(yǎng)條件一致的情況下，裝液量越多，瓶內(nèi)氧氣越少，溶氧量大小直接影響菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量。由圖1看出在裝液量為120 mL/250 mL時(shí)柳生金針菇菌絲體干重，多糖含量均達(dá)到最大值。因此，確定柳生金針菇液體發(fā)酵搖瓶實(shí)驗(yàn)裝液量為120 mL/250 mL。

2.2.2 不同接種量對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響 液體培養(yǎng)過程中，接種量的多少對菌種培養(yǎng)周期的長短、生物量的多少直接影響，接種量過多，發(fā)酵液營養(yǎng)不夠用，菌絲體有效多糖積累量少；接種量過少，菌絲體生物量少，培養(yǎng)周期長。由圖2看出接種量為10%～15%時(shí)，柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖均達(dá)到最大值。接種量超過15%，菌絲體生長受到抑制，多糖產(chǎn)量不會增加，污染幾率大。

2.2.3 不同培養(yǎng)溫度對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響 培養(yǎng)溫度過高或過低都會導(dǎo)致菌絲體生長緩慢，甚至停止生長，而且溫度高易染細(xì)菌。由圖3看出，柳生金針菇菌絲最適生長溫度為23℃。此溫度下，菌絲體干重及發(fā)酵液多糖含量均達(dá)到最大值，分別為0.39 g/100 mL和0.55 g/100 mL。溫度為26℃，柳生金針菇菌絲體在培養(yǎng)液中的呼吸作用加快，分解速率大于合成速率，菌絲體處于過度消耗狀態(tài)。溫度達(dá)到29℃時(shí)，菌絲體生長緩慢，菌絲球表面發(fā)黃，色澤暗淡，活力衰退，各種代謝活動不能正常進(jìn)行。

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響 搖床轉(zhuǎn)速影響培養(yǎng)瓶與外界通氣量的大小，進(jìn)而影響發(fā)酵液溶氧量的多少；搖床轉(zhuǎn)速不同，菌絲球的大小也不同，進(jìn)而菌絲體生物量也不同。由圖4得出，菌絲體及發(fā)酵液多糖都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)，發(fā)酵液多糖及菌絲體生物量達(dá)到0.59 g/100 mL和0.37 g/100 mL，為最大值。轉(zhuǎn)速過低，菌絲球相對較大，但生長速度出現(xiàn)先快后慢的趨勢；轉(zhuǎn)速過高，菌絲球相對較小，生長速度慢，搖瓶內(nèi)出現(xiàn)氣泡，影響菌絲體換氣。

圖1 裝液量對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響

圖2 接種量對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響

圖3 培養(yǎng)溫度對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響

2.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取影響因子合適區(qū)間值進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表3。由表3可以分析出4個(gè)因素對柳生金針菇菌絲體干重的影響程度由大到小為：A（裝液量）＞B（接種量）＞D（搖床轉(zhuǎn)速）＞C（培養(yǎng)溫度），對柳生金針菇發(fā)酵液多糖產(chǎn)量的影響程度由大到小為：B（接種量）＞D（搖床轉(zhuǎn)速）＞C（培養(yǎng)溫度）＞A（裝液量）；由表3可以看出積累菌絲體生物量最多的最優(yōu)組合為A2B1C2D3，即裝液量120 mL，接種量10%，培養(yǎng)溫度23℃，150 r/min；獲得發(fā)酵液多糖產(chǎn)量最多的最優(yōu)組合為A2B1C2D3，綜合菌絲生物量及多糖產(chǎn)量兩個(gè)指標(biāo)，最終確定柳生金針菇發(fā)酵培養(yǎng)的最佳組合為：A2B1C2D3，此條件下菌絲體干重及發(fā)酵液多糖產(chǎn)量均能得最大值。

表3 正交試驗(yàn)L9（34）結(jié)果極差分析

2.3 熱水浸提法最佳工藝確定由表4看出，B（液料比）是影響柳生金針菇菌絲體多糖提取率3個(gè)因素中最主要的因素，其他依次為浸提溫度（C）和浸提時(shí)間（A）。熱水浸提的最佳提取工藝為A1B2C2，即浸提時(shí)間2 h，液料比50∶1，浸提溫度90℃，此條件下多糖的提取率為74.39%。

表4 正交試驗(yàn)L9（33）結(jié)果極差分析

3 小結(jié)與討論

食用真菌多糖是國際公認(rèn)的天然免疫增強(qiáng)劑，它可參與細(xì)胞識別、抗原呈遞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答及新陳代謝等，真菌多糖通常與TLRs協(xié)同激活機(jī)體細(xì)胞，經(jīng)過多條通路啟動機(jī)體細(xì)胞的吞噬活性、ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞因子的合成釋放[10-13]。其中金針菇多糖主要作用于腹腔滲出細(xì)胞膜上的TLR4，從而激活P38MAPK信號通路，活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κβ，后者啟動TNF-α基因轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致TNF-α的合成與分泌增加。金針菇具有增智菇的說法，鄒宇曉等得出金針菇多糖可有效改善氫溴酸東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶障礙模型小鼠、大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并且治療效果優(yōu)于腦復(fù)興[14]。金針菇發(fā)酵液還具有抗衰老的作用，研究發(fā)現(xiàn)金針菇發(fā)酵液能夠極顯著降低腦中MAO-B的活性，對肝MAO-B活性無顯著影響，能使肝中LPO含量降低，血中SOD活性增加，皮膚中Hyp（Hydroxyproline）含量上升，表明其具有提高機(jī)體內(nèi)膠原蛋白的作用[15，16]。作為新紀(jì)錄菌種，朱宴妍等研究發(fā)現(xiàn)，柳生金針菇多糖對肝癌H-22細(xì)胞有針對性抑制的同時(shí)，對機(jī)體也具有調(diào)高免疫和調(diào)解平衡的作用[4]。因此，為進(jìn)一步探討柳生金針菇發(fā)揮生物活性的作用機(jī)制，開發(fā)以柳生金針菇多糖為原料的醫(yī)藥產(chǎn)品及功能食品，大量培育柳生金針菇成為了重中之重。

為適應(yīng)市場發(fā)展，獲得高產(chǎn)菌株及代謝產(chǎn)物，發(fā)酵工程技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其培育時(shí)間短，產(chǎn)量高，受外界影響少，故能大批量生產(chǎn)其活性成分，有利于菌物醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展。根據(jù)不同菌種適應(yīng)生長條件不同，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)條件篩選優(yōu)化，選取最佳提取工藝路線。

試驗(yàn)對柳生金針菇進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，篩選最佳多糖提取工藝，為高效、快速開發(fā)柳生金針菇相關(guān)產(chǎn)品提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。試驗(yàn)篩選出柳生金針菇液體發(fā)酵最適培養(yǎng)條件為：裝液量120 mL/250 mL，接種量10%，培養(yǎng)溫度23℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。多糖產(chǎn)量往往受到提取方法及條件不同的影響，目前多糖的提取方法包括熱水提法、稀酸稀堿提取法以及微波、酶、膜處理、超聲波等輔助提取法。試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的熱水浸提法優(yōu)化多糖提取工藝，避免了稀堿或稀酸浸提法等對多糖糖苷鍵的破壞，從而造成多糖的損失，另外，由于柳生金針菇菌絲體及發(fā)酵液中均含有較多不溶性多糖，故采取多糖復(fù)溶措施，兩次醇沉干燥，提高可溶性多糖提取率，為后續(xù)藥理實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)得到的柳生金針菇菌絲體多糖最佳提取工藝為：浸提時(shí)間2 h，液料比50∶1，浸提溫度90℃，兩次醇沉，此條件下多糖提取率為74.39%。