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(徐州醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院,江蘇徐州 221004)

食品香辛料和調味品中克羅諾桿菌的分離與鑒定

李遠宏,姜華,焦陽,徐灣,鄒小倩,裴尚飛

(徐州醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院,江蘇徐州 221004)

利用生理生化鑒定方法和分子生物學方法對從湖南、湖北、江蘇和上海等地的8個地區(qū)采集的64份干制食品香辛料和調味品樣品進行了克羅諾桿菌分離與鑒定,結果從19份樣品中檢出了克羅諾桿菌,污染率為29.7%,其中檢出率較高的樣品為白胡椒粉、花椒粉和紅辣椒粉,污染率分別為62.5%、50.0%和33.3%。本研究從采樣的7個地區(qū)的樣品中檢出了克羅諾桿菌,其中檢出率最高的地區(qū)為湖南永州,其次為上海市和湖北赤壁,檢出率分別為50.0%、37.5%和33.3%。利用基于fusA基因序列分析的方法對克羅諾桿菌分離株進行了種的水平的鑒定,結果將本研究分離得到的克羅諾桿菌鑒定為5個種,其中9株(47.4%)被鑒定為阪崎克羅諾桿菌(C.sakazakii),4株(21.0%)為蘇黎世克羅諾桿菌(C.turicensis),3株(15.8%)為都柏林克羅諾桿菌(C.dublinensis),2株(10.5%)為丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌(C.malonaticus),1株(5.3%)為尤尼沃斯克羅諾桿菌(C.universalis)。研究結果表明市售干制食品香辛料和調味品中存在克羅諾桿菌的污染,應該加強對該類食品中克羅諾桿菌的流行病學監(jiān)測。

克羅諾桿菌,食品香辛料和調味品,分離,鑒定

克羅諾桿菌(Cronobacterspp.),原稱阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii),是一種重要的食源性條件致病菌,能引起新生兒及嬰幼兒腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結腸炎等疾病,死亡率高達20%～50%[1]。目前,該菌已經被劃分為7個種,包括C.sakazakii、C.malonaticus、C.dublinensis、C.turicensis、C.universalis、C.muytjensii(穆汀斯克羅諾桿菌)和C.condiment(康迪蒙提克羅諾桿菌)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)能夠導致嬰幼兒感染的克羅諾桿菌主要為C.sakazakii、C.malonaticus和C.turicensis,尤其是C.sakazakii序列型ST4與嬰幼兒與新生兒感染密切相關[4-5]。

長期以來,食品微生物學者對克羅諾桿菌監(jiān)測的主要對象是嬰幼兒配方食品,尤其是嬰幼兒配方奶粉[6-7]。然而研究表明克羅諾桿菌在自然界中分布廣泛,該菌不僅存在于嬰幼兒配方食品中,而且在水果、蔬菜、谷類食品、水產品、豆類制品和肉制品等食品以及食品加工環(huán)境樣本中也有檢出[8-11]。由于克羅諾桿菌引起的感染具有發(fā)病急、致死率高、難以治愈等特點,而且該菌的傳播途徑和致病機制依然不是十分清楚[12]。因此,關于克羅諾桿菌預防與監(jiān)控的研究已引起了國內外越來越多的重視,現(xiàn)已成為食品致病微生物研究領域的一個研究熱點。

表1 不同地區(qū)樣品采集情況及克羅諾桿菌檢出情況Table 1 Details of sample collection and prevalence of Cronobacter spp. in different regions

作為一種重要的食源性條件致病菌,研究發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌不僅能感染新生兒及嬰幼兒,而且還能導致成年人,特別是老年人及免疫力低下的人群致病,因此了解各類食品中克羅諾桿菌的污染情況顯得十分必要。干制食品香辛料及調味品是食品加工過程中使用的重要的食品輔料,也在人們日常烹調中經常使用,污染了克羅諾桿菌的干制食品香辛料及調味品將導致巨大的食品安全隱患,威脅人類健康。本研究主要研究了干制食品香辛料和調味品中克羅諾桿菌的污染情況,并利用生理生化鑒定、特異性PCR鑒定和基于保守基因fusA序列分析的方法對克羅諾桿菌分離株進行了分類與鑒定,將有助于人們進一步闡明該菌在食品中的分布情況、流行特征,為該菌的監(jiān)控、暴發(fā)流行的檢測及污染源追溯提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

克羅諾桿菌參考菌株C.sakazakiiCICC 21560和C.muytjensiiCICC 21563 由南京農業(yè)大學食品科技學院酶工程實驗室饋贈。緩沖蛋白胨水肉湯(buffered peptone water,BPW)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(modified lauryl sulfate tryptose broth,mLST)、萬古霉素溶液(vancomycin,Vm)和胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticase soy agar,TSA) 北京陸橋技術有限責任公司;克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基HiCromeTMCronobacterspp. agar(配方:酪蛋白15.0 g/L,大豆蛋白胨5.0 g/L,顯色混合物10.17 g/L,氯化鈉5.0 g/L,瓊脂15.0 g/L) sigma公司;克羅諾桿菌生化鑒定管 杭州微生物試劑有限公司;細菌總基因組DNA提取試劑盒 美國Omega公司。2×Taq Master Mix 南京諾唯贊生物科技有限公司。DL2000 DNA Marker 大連Takara公司。引物 由上海生工生物工程有限公司合成。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州安泰;DNP9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏;5418型小型高速離心機 德國Eppendorf;Veriti 96 PCR儀 美國ABI;DYY-8C型凝膠電泳儀 北京六一;GelDoc XR Biorad型凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD。

1.2實驗方法

1.2.1 樣品采集 從2014年9月至2015年6月,本次實驗從湖南、湖北、上海和江蘇等地的8個地區(qū)的超市采集了64份干制食品香辛料和調味品樣品,包括花椒粉10份,紅辣椒粉(皮)9份,白胡椒粉8份,八角茴香(粉)6份,五香粉、小茴香和黑胡椒粉各5份,桂皮、香葉、生姜粉和孜然粉各4份(表1)。樣品運回實驗室后立即進行檢測。

1.2.2 克羅諾桿菌分離與鑒定 參考GB 4789.40-2010《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗》對克羅諾桿菌進行分離鑒定[13]。具體操作方法如下:在無菌操作條件下稱取10.0 g干制食品香辛料或調味品樣品加入裝有90 mL BPW的錐形瓶中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18 h。然后移取1 mL培養(yǎng)液轉接于10 mL MLST-vm肉湯,44 ℃培養(yǎng)24 h?；靹騧LST-Vm肉湯培養(yǎng)物,分別取增菌培養(yǎng)液劃線接種于克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)平板,37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取1～3個藍綠色疑似菌落劃線接種于TSA平板上,于25 ℃培養(yǎng) 48 h。將在顯色平板上呈藍綠色且能夠在TSA平板上產生黃色素的疑似菌株初步鑒定為疑似克羅諾桿菌分離株。

1.2.3 生理生化實驗 利用克羅諾桿菌生化鑒定管對疑似克羅諾桿菌分離株進行生化鑒定。主要的鑒定指標有:黃色素產生、氧化酶實驗、L-賴氨酸脫羧酶、L-鳥氨酸脫羧酶、L-精氨酸雙水解酶、檸檬酸水解和糖發(fā)酵實驗(D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙)。

1.2.4 基因組DNA提取 將經分離純化的疑似菌株接種于LB培養(yǎng)基,采用基因組DNA提取試劑盒(Omega,USA)提取細菌基因組總DNA,具體操作流程按操作說明進行。

1.2.5 特異性PCR鑒定 以克羅諾桿菌分離株總DNA為模板,利用正向引物ESSF:5′-GGA TTTAACCGTGAACTTTTCC-3′;反向引物:ESSR 5′-CGCCAGCGATGTTAGAAGA-3′進行PCR擴增OmpA基因特異性片段[14],PCR產物長度為469 bp。PCR反應體系:2×Taq Master Mix 25 μL,引物ESSF和ESSR各2 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性 30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸50 s,35個循環(huán);72 ℃ 延伸7 min。取反應產物5 μL上樣,1%瓊脂糖凝膠電泳,于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結果。

1.2.6fusA基因擴增及測序 以克羅諾桿菌分離株的總DNA為模板,利用引物fusA-SF:5′-GAAACCGTATGGCGTCAG-3′和fusA-SR:5′-AGAACCGAAGTGCAGACG-3′進行PCR擴增,獲得長度為2114 bp的DNA片段[15]。PCR反應體系:2×Taq Master Mix 25 μL,引物fusA-SF和fusA-SR各2 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件:96 ℃預變性1 min;96 ℃變性 1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃ 延伸5 min。fusA基因的測序由南京金思瑞生物科技有限公司完成。測序引物序列為fusA-sf:5′-GCTGG ATGCGGTAATTGA-3′,fusA-sr:5′-CCCATACCAG CGATGATG-3′[15]。測序后獲得fusA等位基因片段長度為438 bp。

1.2.7fusA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析 將fusA基因序列在NCBI中進行Blast比對分析,對疑似菌株分離株進行初步鑒定。同時利用克羅諾桿菌MLST分型數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/cronobacter/)分析分離株的fusA序列獲得其等位基因編號,然后再利用基于fusA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析方法對克羅諾桿菌分離株進行聚類分析[16]。方法如下:在MLST分型數(shù)據(jù)庫中查詢克羅諾桿菌參考菌株C.sakazakiiATCC 29544、C.malonaticusLMG23826、C.dublinensisLMG23823、C.turicensisLMG23827、C.muytjensiiATCC 51329、C.universalisNCTC9529和C.condimentiLMG26250的fusA基因的等位基因號,然后依據(jù)等位基因號下載參考菌株對應的fusA基因序列,再通過 Clustalx 2.0 軟件對參考菌株及分離株的fusA基因序列進行多重比較,利用MEGA 4.0 軟件以鄰近法(Neighbour-joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹分析克羅諾桿菌的種屬關系。

2 結果與分析

2.1克羅諾桿菌檢出情況

依據(jù)GB 4789.40-2010《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗》對干制食品香辛料和調味品中克羅諾桿菌進行分離。將分離株在顯色平板上呈藍綠色且在TSA平板上培養(yǎng)48 h后產生黃色素的菌落初步確定為疑似克羅諾桿菌。利用克羅諾桿菌生化鑒定管對可疑分離株進行了生理生化鑒定,結果表明本研究分離的克羅諾桿菌分離株的生理生化反應特征均符合國家標準GB 4789.40-2010中對阪崎腸桿菌的描述(表2)。研究結果表明本研究從19份干制香辛料和調味品樣品中檢出了克羅諾桿菌,總檢出率為29.7%,其中污染率較高的樣品為白胡椒粉、花椒粉和紅辣椒皮,污染率分別達到62.5%、50.0%和33.3%,而生姜粉和五香粉樣品中未檢出克羅諾桿菌(表3)。在研究采樣的8地區(qū)中,除了來自湖北襄陽的樣本未檢出克羅諾桿菌之外,其他地區(qū)的樣品均檢出了克羅諾桿菌,其中污染率最高的地區(qū)為湖南永州(5/10,50%),其次為上海市(3/8,37.5%)和湖北赤壁(3/9,33.3%)(表1)。

表2 克羅諾桿菌分離株生理生化反應特征Table 2 Physiological and biochemicalcharacteristics of Cronobacter isolates

表3 不同干制食品香辛料和調味品中克羅諾桿菌的污染率Table 3 Prevalence of Cronobacter isolates recoveredfrom dried spices and condiments

注:a,基于fusA基因等位基因號及系統(tǒng)發(fā)育分析結果;b,ND:未檢出。

2.2可疑克羅諾桿菌分離株PCR驗證

利用克羅諾桿菌屬特異性引物分別對19株疑似分離株進行PCR檢測。經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,結果顯示19株分離株均在500 bp附近擴增出了與預期片段大小(469 bp)相符的目的條帶,因而證實了PCR檢測結果均呈陽性,進一步證實了全部分離株均為Cronobacterspp.(圖1)。

圖1 疑似陽性菌株特異性 PCR 檢測結果Fig.1 Detection of Cronobacter isolates from dried spicesand condiments by genus-specific PCR注:M為DL2000 DNA ladder marker;1為陽性對照(C. sakazakii CICC 21560);2為陽性對照(C. muytjensii CICC 21563);3為陰性對照;4～22:疑似克羅諾桿菌分離株。

2.3fusA基因序列分析

將測序獲得的fusA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對分析,結果表明19株可疑分離株均為Cronobacterspp.,其中9株分離株(XZCRO002、XZCRO003、XZCRO004、XZCRO006、XZCRO007、XZCRO012、XZCRO039、XZCRO040和XZCRO042)被初步鑒定為C.sakazakii;4株分離株(XZCRO008、XZCRO009、XZCRO010和XZCRO0015)被初步鑒定為C.turicensis;3株分離株(XZCRO001、XZCRO005和XZCRO013)被初步鑒定為C.dublinensis;2株(XZCRO011和XZCRO041)被初步鑒定為C.malonaticus;1株(XZCRO0014)被初步鑒定為C.universalis(表4)。

2.4分離株系統(tǒng)發(fā)育分析

注:+,陽性。

利用克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫對克羅諾桿菌分離株的fusA基因序列進行比對分析,獲得了克羅諾桿菌分離株fusA基因的等位基因號(圖2),結果表明將9株(47.4%)分離株鑒定為C.sakazakii,4株(21.0%)為C.turicensis,3株(15.8%)為C.dublinensis,2株(10.5%)為C.malonaticus,1株(5.3%)為C.universalis。利用MEGA 4.0軟件對19株克羅諾桿菌分離株和7株參考菌株的fusA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析,其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。由圖2可知,19株克羅諾桿菌分離株的fusA基因被分為5個簇,其中XZCRO002、XZCRO003、XZCRO004、XZCRO006、XZCRO007、XZCRO012、XZCRO039、XZCRO040和XZCRO042與參考株C.sakazakiiATCC29544位于一簇,被鑒定為C.sakazakii。同理,XZCRO011和XZCRO041被鑒定為C.malonaticus;XZCRO008、XZCRO009、XZCRO010和XZCRO0015被鑒定為C.turicensis;XZCRO0014被鑒定為C.universalis;XZCRO001、XZCRO005、XZCRO013被鑒定為C.dublinensis。分離株系統(tǒng)發(fā)育分析結果與Genbank數(shù)據(jù)庫中BLAST比對分析結果一致。

圖2 基于fusA基因序列的克羅諾桿菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred by Neighbor-joining method based on the fusA gene sequences

3 結論與討論

本研究通過生理生化實驗、特異性PCR鑒定實驗、fusA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析等方法對食品香辛料和調味品中克羅諾桿菌的污染情況進行了調查分析,結果從19份樣品中分離出了可疑克羅諾桿菌分離株,總檢出率為29.7%。除了生姜粉和五香粉樣品中未檢出克羅諾桿菌之外,其他樣品均在不同程度上檢出了克羅諾桿菌,污染率約為16.7%～62.5%。不同樣品間克羅諾桿菌污染狀況的差異可能是由于這些樣品的生產加工環(huán)境中的衛(wèi)生狀況差異所導致的。Reich和Lou等[17-18]的研究結果表明食品加工環(huán)境中存在的克羅諾桿菌能夠轉移至食品中,是導致食品污染克羅諾桿菌的重要原因之一。在本研究采樣的8個地區(qū)中有7個地區(qū)的樣品檢出了克羅諾桿菌污染,其中克羅諾桿菌污染率最高的地區(qū)為湖南永州(50%),其次為上海市(37.5%)和湖北赤壁(33.3%)。不同地區(qū)樣品中的克羅諾桿菌的污染狀況有所差異,其原因可能是由于本研究采集的樣品數(shù)量不足而導致的誤差或其加工環(huán)境中衛(wèi)生狀況差異等因素造成的。

將分離株鑒定到種的水平有助于人們盡快找出污染源、切斷傳播途徑,從而制定更加迅速有效的控制措施以預防病原菌的擴散?；诒Ｊ鼗蛐蛄蟹治龅姆椒ㄊ且环N常規(guī)的細菌分類學鑒定方法,目前已經建立一些基于16S rDNA、OmpA、rpoB和fusA基因的序列分析方法,然而由于克羅諾桿菌屬內不同種間菌株親緣關系非常接近,研究表明基于16S rDNA、OmpA和rpoB的序列分析方法無法準確將其區(qū)分到種的水平[19-21]。相比較而言,基于fusA基因的序列分析方法更加準確可靠,已被用于克羅諾桿菌不同菌株的種鑒定[16,22-24]。通過基于fusA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析方法進一步證實19株可疑分離株鑒定為Cronobacterspp.,其中9株被鑒定為C.sakazakii,4株為C.turicensis,3株為C.dublinensis,2株為C.malonaticus,1株為C.universalis。研究結果表明市售食品香辛料和調味品中存在克羅諾桿菌污染,C.sakazakii是其優(yōu)勢菌種,該結論與國內外其他食品中克羅諾桿菌污染情況一致[22,25-26]。本研究結果表明干制食品香辛料和調味品是克羅諾桿菌的一個重要污染源,應該加強對該類食品中克羅諾桿菌污染狀況的調查和流行病學監(jiān)測以進一步了解克羅諾桿菌在食品及環(huán)境中的存在狀況。

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IsolationandidentificationofCronobacterspp.fromdriedspicesandcondiments

LIYuan-hong,JIANGHua,JIAOYang,XUWan,ZOUXiao-qian,PEIShang-fei

(School of Public Health,Xuzhou Medical University,Xuzhou 221004,China)

A total of sixty-four dried spices and condiments,collected from retail markets in 8 cities of Hunan,Hubei and Jiangsu province,as well as Shanghai,were analyzed for the presence ofCronobacterspp. In total,19(29.7%)of 64 dried spices and condiments were positive forCronobacterspp.,with the highest percentage(62.5%)coming from white pepper powder,followed by Chinese prickly ash powder(50.0%)and red chilli powder(33.3%). Dried spices and condiments samples from 7 cities were found to be contaminated withCronobacterspp.,with highest detection rate for Yongzhou,Hunan(50%),followed by Shanghai(37.5%)and Chibi,Hubei(33.3%). Based on the fusA gene sequence analysis,Cronobacterisolates were divided into 5Cronobacterspecies. Most of theCronobacterisolates were identified as C. sakazakii(9/19,47.4%),followed byC.turicensis(4/19,21.0%),C.dublinensis(3/19,15.8%)andC.malonaticus(2/19,10.5%),while the remaining isolate(1/19,5.3%)was identified asC.universalis. The results indicated that commercially available dried spices and condiments were possible reservoir ofCronobacterspp.,and therefore the epidemiological surveillance ofCronobacterspp. should be strengthened in dried spices and condiments.

Cronobacterspp.;spices and condiments;isolation;identification

TS207.4

A

1002-0306(2017)19-0125-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.024

2017-03-06

李遠宏(1984-)，男，博士，講師，研究方向：食品微生物與生物技術，E-mail:lyh@xhzmu.edu.cn。

國家自然科學基金青年科學基金項目(31401595)；徐州醫(yī)學院校級科研課題資助項目(D2014002，2014KJ01)。