,,, ,,

(1.暨南大學中藥學博士后流動站,廣東廣州 510632;2.廣西藥用植物研究所,中藥學博士后工作站,廣西南寧 530023;3.廣西中醫(yī)藥大學藥學院,廣西南寧 530001;4.廣西科學院廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室培育基,廣西南寧 530007;5.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

無瓣海桑果實乙醇提取物及其不同極性萃取物抗氧化活性

易湘茜1,2,3,李家怡4,5,高程海4,張卿5,周文紅5,鄧家剛2,3,*

(1.暨南大學中藥學博士后流動站,廣東廣州 510632;2.廣西藥用植物研究所,中藥學博士后工作站,廣西南寧 530023;3.廣西中醫(yī)藥大學藥學院,廣西南寧 530001;4.廣西科學院廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室培育基,廣西南寧 530007;5.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

研究了無瓣海桑果實乙醇提取物及其不同極性萃取物的抗氧化活性。無瓣海桑果實采用95%乙醇浸提后經(jīng)減壓濃縮得到乙醇提取物,然后依次采用乙酸乙酯、正丁醇等有機溶劑進行萃取并收集剩余液體得到乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相殘留物。在超氧陰離子自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基清除能力和還原能力的抗氧化活性測試體系中,無瓣海桑果實乙醇提物及不同極性萃取物均具有一定的抗氧化活性,并且呈明顯的量效關系。乙醇提取物在DPPH自由基清除和還原能力測定中表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。乙酸乙酯相萃取物在4種測定體系中均表現(xiàn)出很好的抗氧化活性,且其DPPH自由基清除活性(IC50=1.69 μg·mL-1)明顯強于陽性對照VE(IC50=6.06 μg·mL-1),超氧陰離子自由基清除活力(IC50=0.35 mg·mL-1)與陽性對照VC(IC50=0.30 mg·mL-1)相近。

無瓣海桑果實,超氧陰離子自由基,DPPH自由基,ABTS+自由基,還原能力,抗氧化活性

無瓣海桑(Sonneratiaapetala)為真紅樹植物,原產(chǎn)于孟加拉國,在我國海南島、廣西、廣東、福建和臺灣均有引種[1]。無瓣海桑果實呈球形或橢圓形,成熟果實在印度、孟加拉國用于釀酒[2]。無瓣海桑在廣西主要分布在茅尾海灘涂,面積約1萬畝,年產(chǎn)果實1～5萬公斤。由于加工利用研究缺乏,大量成熟果實被直接遺棄在灘涂上,造成了資源浪費和環(huán)境污染。研究表明,無瓣海桑果實營養(yǎng)豐富,富含總酚、氨基酸、粗纖維、可溶性縮合單寧等[3-4]。Patra J K和Hossain S J等研究進一步表明,無瓣海桑果實還富含黃酮類、多酚類、花青素和維生素C,它們大多具有抗氧化功能,有作為天然抗氧化劑資源開發(fā)的利用價值[5-6]。目前使用的抗氧化劑有TBHQ、BHT和BHA等均為人工合成抗氧化劑,其能有效阻斷自由基參與的不良反應,但是其對機體存在潛在的毒副作用[7]。因此,從植物中尋找高效安全的天然抗氧化劑日益成為研究熱點。本研究以無瓣海桑果實乙醇提取物及不同極性萃取物為研究對象,測定比較其對超氧陰離子自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基的清除能力和還原能力,為無瓣海桑果實的抗氧化領域開發(fā)應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮無瓣海桑果實 采自廣西茅尾海自治區(qū)級紅樹林自然保護區(qū),經(jīng)廣西北部灣海洋研究中心許銘本工程師鑒別為海?？坪Ｉ贌o瓣海桑(Sonneratiaapetala)果實;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;焦性沒食子酸(鄰苯三酚) Solarbio公司;ABTS+(2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) Solarbio公司;生育酚 Sigma公司;其他試劑 國產(chǎn)分析純。

Cary 100紫外分光光度計 美國瓦里安公司;XS105電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;N1100-VW旋轉蒸發(fā)儀 日本東京理化株式會社;Alpha 1-4冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.2實驗方法

1.2.1 無瓣海桑果實乙醇提取物及其不同極性萃取物樣品制備 將采集到的新鮮無瓣海桑果實切碎,浸泡于95%乙醇中,提取3次,每次7 d,真空濃縮得到乙醇提取物(EE)。將部分乙醇提取物依次用乙酸乙酯和正丁醇等有機溶劑進行萃取,萃取液真空濃縮后分別得到乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物以及水相殘留物。采用真空冷凍干燥得到乙醇提取物樣品(EE)、乙酸乙酯相萃取物樣品(EAE)、正丁醇相萃取物樣品(BE)和水相萃取物樣品(WE)。將乙醇提取物和不同極性極性萃取部位分別用無水乙醇溶解成不同濃度梯度溶液,-4 ℃封口冷藏備用。

1.2.2 無瓣海桑果實乙醇提取物及其不同極性萃取物抗氧化性能測定

1.2.2.1 超氧陰離子自由基清除作用的測定 參照鄰苯三酚自氧化法[8],并有所改動。向比色管中加入1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液(pH7.5)5 mL,于20 ℃水浴中保溫20 min,分別加入0.5 mL不同濃度的無瓣海桑果實乙醇提取物或不同極性萃取部位溶液和3 mmol·L-1的鄰苯三酚0.1 mL后混勻,于25 ℃水浴中反應3 min,在320 nm處測定吸光度,每30 s測定1組數(shù)據(jù)。測定鄰苯三酚自氧化的吸光度并計算氧化速率(ΔA0/Δt),測定添加測試樣品后與鄰苯三酚反應體系的吸光度并計算氧化速率(ΔAi/Δt),并以同等濃度的VC為陽性對照,計算各測試樣品對超氧陰離子自由基清除率[9]:

超氧陰離子自由基清除率(%)=(ΔA0/Δt-ΔAi/Δt)/(ΔA0/Δt)×100

式中:ΔA0/Δt表示鄰苯三酚自氧化反應速率,ΔAi/Δt表示加入待測樣品后鄰苯三酚自氧化反應速率。

1.2.2.2 DPPH自由基清除作用的測定 精密稱取16.0 mg DPPH固體,用無水乙醇溶解并定容至200 mL棕色容量瓶中,得濃度為0.2 mmol·L-1的DPPH儲備液,避光保存,備用。取DPPH儲備液,將其濃度分別稀釋為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mmol·L-1,于516 nm波長測定其吸光度,以吸光度為縱坐標(Y)對濃度(X)作線性擬合,得到標準曲線:Y=9.0459X+0.0509,R2=0.9993。最佳試劑濃度范圍為0.02～0.12 mmol·L-1。

取不同濃度無瓣海桑果實乙醇提取物和不同極性萃取物的樣品溶液2.0 mL置小試管中,加入2.0 mL 0.10 mmol·L-1的DPPH溶液,充分混合后室溫避光反應30 min,于516 nm波長處測定吸光度A,同時測定2.0 mL無水乙醇和2.0 mL DPPH混合溶液的吸光度為A1,測定2.0 mL樣品溶液和2.0 mL無水乙醇的混合液吸光度A0,并以同濃度的VE為陽性對照。按照下式計算清除率,清除率越大,表示抗氧化能力越強。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A-A0)/A1]×100

1.2.2.3 ABTS+自由基清除作用的測定 20 mL的7 mmol·L-1ABTS和352 μL的140 nmol·L-1過硫酸鉀混合,室溫暗處放置12～16 h,配制成ABTS+·測定溶液。使用前將ABTS+貯備液用無水乙醇稀釋,至734 nm 處測其吸光度值為0.70±0. 02時使用[10]。

于比色管中依次加入不同濃度無瓣海桑果實乙醇提取物和不同極性萃取物樣品0.5 mL及ABTS+·工作液5.0 mL,以去離子水作為空白對照,6 min室溫避光反應后于734 nm處測定吸光值A1,測定樣品的吸光值為A2,ABTS+·溶液的吸光值為A0,以VC為陽性對照。

按照下式計算各個組的清除率:

ABTS+·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]× 100

1.2.2.4 還原能力的測定 參照普魯士藍法[11]。將2.0 mL不同濃度的無瓣海桑果實乙醇提取物和不同極性萃取物樣品與5.0 mL的0.2 mol·L-1磷酸緩沖溶液(pH6.6)、5.0 mL的1%鐵氰化鉀溶液混勻,40 ℃條件下水浴30 min,再加入10%三氯乙酸溶液5 mL,混勻后在4000 r·min-1離心20 min,取上清液10 mL與同體積去離子水混合,再加入1%三氯化鐵溶液2 mL,在740 nm處測定吸光度。

2 結果與討論

2.1無瓣海桑果實乙醇提取物和不同極性萃取物對超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子自由基是機體內壽命最長的自由基,通常是自由基鏈式反應的誘發(fā)劑,會產(chǎn)生活性更強的自由基。無瓣海桑果實的乙醇提取物及其不同極性部位在體外清除鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子能力,結果見圖1所示。

圖1 無瓣海桑果實的乙醇提取物及不同極性萃取物對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.1 Superoxide anion radical scavenging ablity of alcoholextracts and three polarity extractants of S. apetala fruits

由圖1可知,無瓣海桑果實乙醇提取物及3個極性萃取物均具有清除超氧陰離子自由基的能力。隨著濃度的增加,各個測試樣品對超氧陰離子自由基的清除作用逐漸增強,并且呈現(xiàn)一定的劑量對應關系。IC50值大小依次為維生素C(0.30 mg·mL-1)<水相殘留物(0.34 mg·mL-1)<乙酸乙酯相萃取物(0.35 mg·mL-1)<正丁醇相萃取物(0.43 mg·mL-1)<乙醇提取物(0.49 mg·mL-1)。

2.2無瓣海桑果實乙醇提取物和不同極性萃取物對DPPH自由基的清除作用

當向DPPH自由基溶液中加入自由基清除劑,孤對電子被配對,深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H非自由基形式,其褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關系,因而可以通過吸光度的變化進行定量分析測試樣品對DPPH自由基的清除能力。

由圖2可知,無瓣海桑果實的乙醇提取物及不同極性部位均具有較強的DPPH自由基清除能力,總體趨勢是隨著樣品濃度的增加而增大,表明清除自由基能力與濃度呈明顯的量效關系。乙酸乙酯相萃取物活性最強,在濃度為2.5 μg·mL-1時,其清除率便可達到60.38%(IC50=1.69 μg·mL-1),優(yōu)于陽性對照VE。對比各個樣品DPPH清除率的IC50發(fā)現(xiàn),無瓣海桑果實的乙醇提物及不同極性萃取物清除DPPH自由基的IC50均小于陽性對照VE(IC50=6.06 μg·mL-1)。無瓣海桑果實中含有較多清除DPPH自由基的物質,乙酸乙酯萃取相是主要清除DPPH自由基的活性部位。

圖2 無瓣海桑果實的乙醇提取物及不同極性部位對DPPH自由基的清除作用Fig.2 DPPH scavenging rate of alcohol extractsand different polarity extractants of S. apetala fruits

2.3無瓣海桑果實乙醇提取物和不同極性萃取物對ABTS+自由基的清除作用

ABTS是一種人工合成的水溶性的顯色劑,但可被活性氧或自由基氧化,生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+,在734 nm處有最大吸收,當加入自由基清除劑時,溶液顏色變淺,最大吸收波長處的吸收減弱。因此,可以通過測定受試物與ABTS+反應使ABTS+顏色變淺程度,反映該物質清除自由基的能力[12]。

由圖3可知,無瓣海桑果實的乙醇提取物及不同極性部位均對ABTS+有清除作用,隨著濃度的加大,清除能力增強。清除能力大小順序為乙酸乙酯相>水相>乙醇提取物>正丁醇相。比較各測試樣品的IC50值發(fā)現(xiàn),乙酸乙酯萃取相的IC50值最小為8.13 μg·mL-1,其清除ABTS+自由基能力最強,優(yōu)于陽性對照維生素C(IC50=11.00 μg·mL-1)。

圖3 無瓣海桑果實的乙醇提取物及不同極性部位對ABTS+自由基的清除作用Fig.3 ABTS+·scavenging rate of alcohol extractsand different polarity extractants of S.apetala fruits

2.4無瓣海桑果實乙醇提取物和不同極性萃取物的還原能力

當反應體系中存在還原性物質時,鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀,亞鐵氰化鉀在酸性條件下與三氯化鐵反應,生成普魯士藍,在700 nm處有最大吸收峰。故吸光值越大,反映樣品還原能力越強。由圖4可知,無瓣海桑果實的乙醇提取物及不同極性部位均具有一定的還原能力。在所有的測試樣品中,乙酸乙酯萃取相展現(xiàn)出最強的還原能力,且在測定范圍內,隨著質量濃度的增加,還原能力逐漸增強,還原能力大小為乙酸乙酯萃取相>乙醇提取物>正丁醇萃取相>水相殘留物。

圖4 無瓣海桑果實的乙醇提取物及不同極性部位的還原能力Fig.4 Reduction abilities of alcohol extractsand different polarity extractants of S. apetala fruits

3 結論與討論

對無瓣海桑果實使用95%的乙醇浸泡得到粗提物,依次用乙酸乙酯、正丁醇溶液對粗提物進行萃取,獲得不同極性部位樣品,通過體外對超氧陰離子自由基清除、DPPH自由基清除、ABTS+自由基清除和還原能力4種方法測定,評價了各個提取物的抗氧化活性。研究表明乙醇提取物及其三種不同極性部位均具有一定的抗氧化活性,并且呈明顯的量效關系。在4種抗氧化活性研究中,我們發(fā)現(xiàn)不同提取物抗氧化能力排序不完全一致,可能是由于不同極性部位中含有的主要抗氧化成分種類和構效關系不同,以及不同抗氧化活性的作用機理不同導致[13]。在對DPPH自由基、ABTS+自由基清除和還原能力測試中,乙酸乙酯萃取相均表現(xiàn)出較強的清除作用和還原能力,其DPPH自由基清除能力優(yōu)于陽性對照VE,ABTS+自由基清除能力優(yōu)于陽性對照VC,表明乙酸乙酯萃取相是無瓣海桑果實抗氧化的主要活性部位。鐘雪蓮等對瑤山梭羅果實不同提取部位的抗氧化活性研究中發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取相具有較高的體外抗氧化能力,乙酸乙酯萃取相的抗氧化活性是正丁醇萃取相的1.4倍[14],鄭朋朋對拐棗不同提取物的體外抗氧化作用研究中發(fā)現(xiàn),拐棗乙酸乙酯萃取相的抗氧化能力最強,在濃度為200 μg·mL-1時對ABTS+自由基清除率最高達到98.57%[15]。由于無瓣海桑果實乙醇提取物及其不同極性部位中含有化學結構成具有明顯的多樣性,因此,有必要對活性物質分離純化及其構效關系進一步研究。

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AntioxidantactivityofalcoholextractanddifferentpolarpartsofSonneratiaapetalafruits

YIXiang-xi1,2,3,LIJia-yi4,5,GAOCheng-hai4,ZHANGQing5,ZHOUWen-hong5,DENGJia-gang2,3,*

(1.The Post-Doctoral Research Station of Chinese Medicine,Jinan University,Guangzhou 510632,China;2.Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants,Nanning 530023,China;3.School of Pharmaceutical Sciences,Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,China;4.Guangxi Key Laboratory of Marine Natural Products and CombinatorialBiosynethesis Chemistry,Guangxi Academy of Sciences,Nanning 530007,China;5.Light Industry and Food Engineering College,Guangxi University,Nanning 530004,China)

The antioxidant activities of alcohol extract and different polar parts ofSonneratiaapetalafruits were studied. The ethanol extract was obtained by the addition of ethanol,and then successively extract by ethyl acetateand,butanol and the remaining liquid was collected to obtain n-butanol phase,ethyl acetate phase and aqueous phase residue. The antioxidant activity of all extracts were evaluated by superoxide anion radical,DPPH free radical,ABTS+free radical scavenging ability and reducing ability. The results showed that all test samples had antioxidant activities and showed significant dose-effect relationship. Alcohol extraction showed medium antioxidant activity in the determination of DPPH radical scavenging and reducing ability. The ethyl acetate phase exhibited strong antioxidant activity in DPPH free radical,ABTS+free radical scavenging and reducing ability,its DPPH free radical scavenging activity(IC50=1.69 μg·mL-1)was obviously stronger than positive control vitamin E(IC50=6.06 μg·mL-1),and its superoxide anion radical scavenging activity(IC50=0.35 mg·mL-1)showed no difference from control(IC50=0.30 mg·mL-1).

Sonneratiaapetalafruits;superoxide anion radical;DPPH radical;ABTS+free radical;reducing ability;antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306(2017)19-0027-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.005

2017-04-11

易湘茜(1981-)，女，博士后，副教授，主要從事海洋生物資源開發(fā)與利用方面的研究，E-mail:42672960@qq.com。

*通訊作者:鄧家剛(1953-)，男，教授，博士后合作導師，主要從事海洋中藥理論與應用方面研究，E-mail:dengjg53@126.com。

廣西自然科學基金項目(2015GXNSFBA139195)；廣西高?？茖W技術研究項目(KY2015YB146)；廣西中藥藥效研究重點實驗室建設項目(16-380-29)；中國博士后科學基金面上資助項目(2016M602920XB)。