黃珊，孟慶雯，楊洋，譚海濤

miR-155基因敲除對辛伐他汀治療大鼠動脈粥樣硬化的影響

黃珊1，孟慶雯1，楊洋1，譚海濤1

目的探討miR-155基因敲除對大鼠動脈粥樣硬化形成及對辛伐他汀治療大鼠動脈粥樣硬化療效的影響。方法miR-155基因敲除雄性SD大鼠20只作為實驗組，腹腔注射維生素D3，高脂飼料喂養(yǎng)進(jìn)行大鼠動脈粥樣硬化建模。8周后將實驗組大鼠按完全隨機(jī)抽樣方法分為實驗?zāi)Ｐ徒M和實驗治療組，每組10只，實驗治療組大鼠給予10 mg/kg辛伐他汀，實驗?zāi)Ｐ徒M給予等量生理鹽水。另取相同遺傳背景、鼠齡和體重的雄性SD大鼠20只作為正常組，隨機(jī)分為正常對照組和正常治療組，每組10只，正常治療組予以和實驗治療組大鼠同樣的建模和給藥，正常對照組普通飼料喂養(yǎng)，腹腔注射等量生理鹽水。HE染色觀察4組大鼠主動脈損傷；檢測各組大鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋（HDL）；qRT-PCR檢測血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）、白介素6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）mRNA在不同組別表達(dá)情況。結(jié)果與正常對照組相比，各模型組主動脈均見AS斑塊形成。與正常對照組相比，正常模型組、實驗?zāi)Ｐ徒M和辛伐他汀組大鼠TC、TG、LDLC水平均明顯升高，正常模型組HDL明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常模型組比較，實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠TC、TG、LDL水明顯降低，HDL明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與實驗?zāi)Ｐ徒M相比，辛伐他汀組大鼠TC、TG、LDL均明顯降低，HDL明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組相比，正常模型組、實驗?zāi)Ｐ徒M和辛伐他汀組大鼠VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA相對表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常模型組比較，實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與實驗?zāi)Ｐ徒M相比，辛伐他汀組大鼠VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論miR-155基因敲除可預(yù)防大鼠動脈粥樣硬化形成，對辛伐他汀治療大鼠動脈粥樣硬化療效產(chǎn)生有利的影響，可能為預(yù)防及治療動脈粥樣硬化提供方向。

miR-155；基因敲除；辛伐他汀；動脈粥樣硬化；血管細(xì)胞粘附分子-1；白介素6

動脈粥樣硬化（As）是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。⒛X血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)[1]。目前為止，As的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，存在多種學(xué)說，涉及多種危險因素，以至臨床缺乏有效的防治藥物[2]。1986年，美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院ROSS教授[3]首次明確提出As是一種炎癥性疾病，是對損傷的一種過度防御反應(yīng)。目前As的病因尚不清楚，但是各種致As因素引起的血管內(nèi)皮功能損害，多種炎性細(xì)胞因子的過度釋放是As形成的重要步驟已經(jīng)被廣泛接受[4]。炎癥和免疫激活是動脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。As是Th-1免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，Th1細(xì)胞分泌的白介素-6（IL-6），在激活的免疫細(xì)胞和調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)[5]。血管平滑肌細(xì)胞（SMC）大量增殖、遷移并吞噬脂質(zhì)形成平滑肌源性泡沫細(xì)胞對As斑塊的形成至關(guān)重要。單核細(xì)胞遷移至內(nèi)皮下需要單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的參與，MCP-1對單核細(xì)胞有強(qiáng)烈的趨化作用。研究表明，單核細(xì)胞、SMC和內(nèi)皮細(xì)胞均可以產(chǎn)生MCP-1[6,7]。免疫和炎癥反應(yīng)的媒介，有關(guān)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸，與血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）有關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)[8]，抗炎因子Kruppel樣因子2（KLF2）明顯抑制miR-155的表達(dá)及IL-6、MCP-1的分泌，過表達(dá)miR-155可部分逆轉(zhuǎn)KLF2對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用。因此，miRNA-155可能通過多途徑在As的炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用。

1 材料和方法

1.1 動物及試劑miR-155基因敲除雄性SD大鼠和相同遺傳背景、鼠齡和體重的雄性SD正常大鼠各20只，出生7～8周，體重170～190 g，購自北京市動物實驗中心[合格證編號為SYXK（京）：2011-0006]；維生素D3購自上海通用藥業(yè)；高脂飼料購自于海南醫(yī)學(xué)院動物實驗中心；辛伐他汀購自杭州默沙東制藥有限公司。

1.2 建模及分組取miR-155基因敲除雄性SD大鼠20只作為實驗組，出生7～8周，體重170～190g。均按60萬IU/kg的總劑量腹腔注射維生素D3，共注射3 d，同時給予含1%膽固醇、0.35%膽酸、5%豬油、0.61%丙基硫氧嘧啶、93.04%基礎(chǔ)飼料的高脂飼料喂養(yǎng)8周，建立大鼠As模型。8周后將實驗組大鼠按完全隨機(jī)抽樣方法分為實驗?zāi)Ｐ徒M和實驗治療組，每組10只，實驗治療組大鼠給予辛伐他汀10 mg/kg灌胃治療，實驗?zāi)Ｐ徒M給予等量生理鹽水。另取相同遺傳背景、鼠齡和體重的雄性SD正常大鼠20只作為正常組，隨機(jī)分為正常對照組和正常治療組，每組10只，正常治療組和實驗治療組大鼠予以同樣的建模和給藥，正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，普通飼料喂養(yǎng)。將辛伐他汀溶于生理鹽水，濃度為10%，按10 mg/kg給實驗治療組和正常治療組大鼠灌胃，給予其他兩組等體積生理鹽水灌胃，所有大鼠均于12周齡開始進(jìn)行灌胃，每日上午10時灌胃一次，整個灌胃周期為8周。所有大鼠均分籠按清潔級動物飼養(yǎng)，飼養(yǎng)和飲水清潔級合格。

1.3 血脂檢測及主動脈形態(tài)學(xué)觀察將灌胃8周并空腹12 h后的各組大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，常規(guī)皮膚消毒，開胸暴露心臟及血管，抽取腹腔靜脈血10 ml，置于普通干燥試管靜置后離心分離上層血請，-20℃下保存，用于檢測各組大鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）水平。小心分離胸主動脈，取主動脈約1.0 cm，用生理鹽水洗凈，置于4%多聚甲醛溶液中固定5～6 h，石蠟包埋后做成5μm厚的切片，脫蠟水化，常規(guī)HE染色后在光鏡下觀察主動脈粥樣硬化程度及其他病理變化。

1.4 RT-PCR檢測miR-155、VCAM-1、IL-6和MCP-1基因表達(dá)情況按Trizol試劑說明書，采用Trizol一步法提取組織標(biāo)本中總RNA，取1μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃60 min，85℃ 5 min，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后利用Primer Premier 3.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，委托上海Invitrogen公司進(jìn)行引物合成，以GAPDH作為內(nèi)參（表1）。RT-PCR測miR-155、VCAM-1、IL-6和MCP-1基因的mRNA表達(dá)，RT-PCR反應(yīng)體系：95℃預(yù)變性3 min、95℃變性40 s、60℃退火30s、72℃延伸30s，40個循壞，所得CT值經(jīng)轉(zhuǎn)換后采用2-△△Ct法 計算各目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析（分析前先行方差齊性檢測），多組間均數(shù)的兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 主動脈病理學(xué)觀察胸主動脈HE染色顯示（圖1），正常對照組大鼠血管壁內(nèi)膜、中膜和外膜界限清晰，平滑肌排列整齊，血管組織結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜完好，未見脂質(zhì)沉積或泡沫細(xì)胞（圖1a）。實驗治療組大鼠血管壁內(nèi)膜輕微增生，平滑肌排列紊亂，有As斑塊形成，斑塊中可見一定數(shù)量泡沫細(xì)胞、膽固醇結(jié)晶和脂質(zhì)沉積（圖1b）。正常治療組大鼠血管內(nèi)膜增生較辛伐他汀組稍重，泡沫細(xì)胞、膽固醇結(jié)晶和脂質(zhì)沉積均有所增加（圖1c）。實驗?zāi)Ｐ徒M的內(nèi)膜增生程度最嚴(yán)重，內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊中有大量脂質(zhì)、膽固醇晶體沉積和泡沫細(xì)胞聚集，內(nèi)彈力板排列紊亂變性壞死，病變區(qū)域有炎性細(xì)胞浸潤（圖1d）。與正常對照組相相比，各模型組主動脈均見典型的As斑塊形成。

2.2 血脂水平比較與正常對照組相比，實驗?zāi)Ｐ徒M、正常治療組和實驗治療組大鼠TC、TG、LDL均明顯升高，正常模型組HDL明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而正常治療組和實驗治療組HDL未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P均＜0.05）。與實驗?zāi)Ｐ徒M比較，正常治療組大鼠TC、TG、LDLC水平均明顯降低，HDLC水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常治療組相比，實驗治療組大鼠TC、TG、LDL均明顯降低，HDL明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表2。

圖1 大鼠主動脈壁形態(tài)學(xué)變化（HE染色×400；a：正常對照組、b：實驗治療組、c：正常治療組、d：實驗?zāi)Ｐ徒M）

2.3 VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)水平比較PCR擴(kuò)增后，基因擴(kuò)增物與預(yù)期設(shè)計完全符合。RT-PCR檢測mRNA表達(dá)量結(jié)果如下：與正常對照組相比，實驗?zāi)Ｐ徒M、正常治療組和實驗治療組大鼠VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與實驗?zāi)Ｐ徒M比較，正常治療組大鼠VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常治療組相比，實驗治療組大鼠VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA相對表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表3。

3 討論

動脈粥樣硬化（As）是一種慢性、炎性免疫性心血管疾病，其病理特征包括動脈內(nèi)膜增厚、泡沫細(xì)胞累積、細(xì)胞外脂質(zhì)和纖維組沉積[9,10]。免疫系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DCs）、血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）和白細(xì)胞亞群的分化，廣泛涉及到As的起始和并發(fā)癥[11]。MiR-155可高度表達(dá)于活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC，上調(diào)巨噬細(xì)胞和氧化型低密度脂蛋白刺激的單核細(xì)胞[12]，參與癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病的病理生理過程[13]。

表1 RT-PCR實驗的引物

表2 各組大鼠血脂水平比較（n=10，mmol/L）

表3 各組大鼠VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA相對表達(dá)情況

本實驗對比研究了正常對照組、實驗?zāi)Ｐ徒M、正常治療組和實驗治療組，辛伐他汀組4組大鼠的As形成和辛伐他汀治療As的效果。大鼠As模型的建立成功，HE染色顯示各模型組主動脈血管內(nèi)壁均見典型的As斑塊，損傷情況與國內(nèi)外其它文獻(xiàn)報導(dǎo)一致。建模組大鼠的TC、TG、LDLC水平均明顯升高，說明大鼠As建模成功。正常治療組TC、TG、LDL水平低于實驗?zāi)Ｐ徒M，說明辛伐他汀對大鼠As具有一定的治療效果，能改善血脂情況，使As病情好轉(zhuǎn)，與其它研究結(jié)果一致。實驗治療組TC、TG、LDL低于正常治療組水平，消除其他無關(guān)因素影響，考慮可能與大鼠MiR-155基因敲除有關(guān)。根據(jù)國內(nèi)外其他研究報導(dǎo)，MiR-155基因與As形成的炎癥機(jī)制密切相關(guān)，MiR-155基因敲除組大鼠As的辛伐他汀治療效果優(yōu)于正常大鼠As的治療效果，出現(xiàn)此類研究結(jié)果考慮可能與T細(xì)胞的分化、炎癥系統(tǒng)調(diào)控某些炎癥因子的基因表達(dá)受阻和免疫炎癥反應(yīng)的介導(dǎo)有關(guān)，從而影響了As的發(fā)展，增加了藥物治療效果。

本實驗研究了與MiR-155基因有關(guān)的VCAM-1、IL-6和MCP-1三種血清標(biāo)志物mRNA在四組實驗大鼠中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，實驗?zāi)Ｐ徒M、正常治療組和實驗治療組三組大鼠VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)水平均明顯升高，與血管內(nèi)膜損傷和血清水平呈現(xiàn)相同趨勢，說明MiR-155基因通過炎癥機(jī)制影響了辛伐他汀對大鼠As的治療效果。正常治療組大鼠VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA相對表達(dá)水平低于實驗?zāi)Ｐ徒M，說明VCAM-1、IL-6和MCP-1與辛伐他汀的治療效果有關(guān)，與國內(nèi)外其他研究結(jié)果類似。實驗治療組大鼠VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)水平明顯低于正常治療組，說明MiR-155基因敲除大鼠會影響VCAM-1、IL-6和MCP-1的表達(dá)，并可能對辛伐他汀治療As的療效產(chǎn)生影響。

綜上所述，本研究通過對四組大鼠不同觀測指標(biāo)的研究，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對MiR-155基因敲除組As大鼠的治療效果更加顯著，考慮MiR-155基因與體內(nèi)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)有關(guān)，從而阻斷As病情的進(jìn)一步發(fā)展和促進(jìn)藥物治療修復(fù)損傷。MiR-155基因敲除對辛伐他汀治療大鼠As具有促進(jìn)作用，但是MiR-155基因敲除是否對所有的藥物療效均有促進(jìn)作用以及其他具體的輔助機(jī)制，還有待進(jìn)一步的研究。

[1] Hansson GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease[J]. N Engl J Med,2009,352(16):429-30.

[2] Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s[J]. Nature,1993,362(6423):801-9.

[3] Ross R. The Pathogenesis of Atherosclerosis — An Update — NEJM[J].Harefuah,1986,34(64):368-70.

[4] Fang L,Wei H,Mak KH,et al. Markers of low-grade inflammation and soluble cell adhesion molecules in Chinese patients with coronary artery disease[J]. Canadian Journal of Cardiology,2004,20(14):1433-8.

[5] Huang RS,Hu GQ,Lin B,et al. MicroRNA-155 silencing enhances inflammatory response and lipid uptake in oxidized low-density lipoprotein-stimulated human THP-1 macrophages. J Investig Med,2010,58:961-7．

[6] Klouche M,Gottschling S,Gerl V,et al. Atherogenic properties of enzymatically degraded LDL: selective induction of MCP-1 and cytotoxic effects on human macrophages[J]. Arteriosclerosis Thrombosis& Vascular Biology,1998,18(9):1376-85.

[7] Klouche M,Rose-John S,Schmiedt W,et al. Enzymatically degraded,nonoxidized LDL induces human vascular smooth muscle cell activation,foam cell transformation, and proliferation[J]. Circulation,2000,101(15):1799-805.

[8] Liu Q,Chen J,Wang J,et al. Putative tumor suppressor gene SEL1L was down regulated by aberrantly upregulated has-mir-155 in human panereatie duetal adeno carcinoma[J]. Mol Careinog,2014,53(9):711-21.

[9] Ilhan F, Kalkanli ST. Atherosclerosis and the role of immune cells[J].World Journal of Clinical Cases,2015,3(4):345-52.

[10] 范艷平,李海濱,譚清武,等. 人血漿脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2在冠狀動脈粥樣硬化中的研究進(jìn)展[J]. 臨床誤診誤治,2016,29(6):110-3.

[11] Kassiteridi C,Monaco C. Macrophages and dendritic cells: the usual suspects in atherogenesis[J]. Current Drug Targets,2015,16(4):373-82.

[12] Seok HY,Chen J,Kataoka M,et al. Loss of microRNA-155 Protects the Heart from Pathological Cardiac Hypertrophy[J]. Circulation Research,

Effect of miR-155 gene knockout in atherosclerosis rats treated with simvastatin

Huang Shan*, Meng Qingwen, Yang Yang, Tan Haitao.
*First Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, China.

ObjectiveTo investigate the effect of miR-155 gene knockout on the formation of atherosclerosis in rats and the effect of simvastatin on atherosclerosis in rats.Methods20 male SD rats with miR-155 knockout were used as experimental group. Vitamin D3 was injected intraperitoneally and fed with high fat diet to rats. After the model was completed, the experimental group was randomly divided into two groups: experimental modeling group and experimental treatment group, each group has 10 rats. The rats in the experimental treatment group were given a certain dose of simvastatin . The experimental modeling group was given the same amount of saline.20 healthy male SD rats were randomly divided into normal control group and normal treatment group. 10 rats in each group, Normal treatment group was injected with the same amount of normal saline and fed as same as experimental treatment group. Normal control group was given the same amount of saline. HE staining was used to observe the damage of aorta in four groups; The serum levels of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein(LDL) and high-density lipoprotein (HDL) were measured; QRT-PCR was used to detect the expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), interleukin-6 (IL-6), monocyte chemoattractant protein- 1 (MCP-1) mRNA expression in different groups.ResultsCompared with the normal control group, the aorta of the model group showed typical AS plaque formation. Compared with the normal control group, the levels of TC, TG and LDLC in the experimental model group, experimental treatment group and normal treatment group were significantly higher than those in the normal model group, the difference was statistically significant (P＜0.05). Compared with the experimental model group, the levels of TC, TG and LDLC in the normal treatment group were significantly lower(P＜0.05). Compared with the normal treatment group, the levels of TC, TG and LDLC in experimental treatment group were significantly decreased and the level of HDLC was significantly increased (P＜0.05). Compared with the normal control group, the mRNA expression levels of VCAM-1, IL-6 and MCP-1 in the experimental model group,experimental treatment group and normal treatment group were significantly higher than those in the normal control group (P＜0.05). Compared with the experimental model group, the expression of VCAM-1, IL-6 and MCP-1 mRNA in the normal treatment group was significantly lower(P＜0.05). Compared with the normal treatment group,the mRNA expression levels of VCAM-1, IL-6 and MCP-1 in experimental treatment group were significantly lower (P＜0.05).ConclusionMiR-155 gene knockout can prevent the formation of atherosclerosis in rats, and the beneficial effect of simvastatin on the treatment of atherosclerosis in rats may provide a direction for the prevention and treatment of atherosclerosis.

miR-155; Gene knockout; Simvastatin; Atherosclerosis; VCA- 1; IL-6

Huang Shan, E-mail: cddong7909@163.com

R543.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】1674-4055(2017)09-1069-04

海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金(HY2012-001)

1570102 ?？?海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院

黃珊,E-mail:cddong7909@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.09.13