姚楠+陳能+劉文剛+許學猛+黃丹娥+蔡大可+趙傳喜

【摘 要】目的：研究補腎活血方含藥血清對白細胞介素-1β（IL-1β）刺激的人原代軟骨細胞miRNA-140及其靶基因表達的影響。方法：通過采用生理鹽水和補腎活血方分別灌胃雌性SD大鼠制備空白血清和含藥血清。將人軟骨細胞種植于6孔板并且分為3組?？瞻讓φ战M和模型對照組細胞培養(yǎng)的血清采用大鼠空白血清，含藥血清組細胞培養(yǎng)的血清采用大鼠含藥血清。另外，模型對照組和含藥血清組細胞加入10 ng·mL-1 IL-1β。以上各組細胞設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)細胞至IL-1β刺激后24 h收集各組細胞提取總RNA。采用RT-qPCR檢測軟骨細胞miRNA-140-5p以及聚蛋白樣金屬蛋白酶-5（ADAMTS-5）、胰島素樣生長因子結合蛋白5（IGFBP5）和基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）mRNA表達。結果：與空白對照組比較，模型對照組軟骨細胞miRNA-140-5p表達和IGFBP5 mRNA表達明顯降低（P < 0.05），ADAMTS-5和MMP-13mRNA表達明顯升高（P < 0.05）；與模型對照組比較，補腎活血方含藥血清顯著升高了IL-1β刺激的軟骨細胞miRNA-140-5p表達和IGFBP5 mRNA表達（P < 0.05），并且顯著降低ADAMTS-5和MMP-13 mRNA表達（P < 0.05）。結論：補腎活血方含藥血清可以抑制IL-1β導致的人原代軟骨細胞退變，其作用機制與提高miRNA-140-5p和IGFBP5 mRNA表達，降低ADAMTS-5和MMP-13 mRNA表達有關。

【關鍵詞】 骨關節(jié)炎，膝；補腎活血方；miRNA-140-5p；軟骨細胞

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是全世界最常見的與老齡化相關的退行性關節(jié)疾病[1]，使患者產生極大痛苦，給家庭造成沉重負擔。中醫(yī)學認為，KOA發(fā)病的病機主要為腎虛血瘀和腎虛絡阻。根據(jù)補腎、活血、通絡和祛風除濕原則篩選中藥組成的補腎活血膠囊（后更名為補腎強筋膠囊）為本院院內制劑，多年來的臨床及動物實驗均證實了其對KOA有良性干預作用[2-5]，但具體作用機制尚不明確。miRNA是廣泛存在于真核生物中的一種非編碼的小RNA，它主要調控基因轉錄后水平。大量研究報道表明，miRNA在骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）發(fā)病過程中軟骨細胞增殖、凋亡以及軟骨基質合成與分解代謝等方面發(fā)揮了重要的調控作用，其中miRNA-140在維持軟骨正常代謝即維持軟骨基質穩(wěn)態(tài)的過程中起重要

作用[6-7]。

本實驗采用白細胞介素-1β（IL-1β）作為造模劑在體外復制出退變的軟骨細胞模型，研究了補腎強筋膠囊含藥血清對IL-1β刺激的軟骨細胞miRNA-140-5p及其靶基因聚蛋白樣金屬蛋白酶-5（ADAMTS-5）、胰島素樣生長因子結合蛋白5（IGFBP5）和基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）mRNA表達的影響，從miRNA角度探討其治療KOA的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級SD雌性大鼠10只，體質量180～220 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物中心生產許可證號：SCXK（粵）2013-0002。

實驗動物質量合格證號：NO44007200021993。本研究在廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院）SPF級動物實驗室進行，設施使用許可證號：SYXK（粵）2015-0059。

1.2 實驗儀器 ClassⅡType B2型生物安全柜（新加坡Esco公司）；DMI8型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；3111型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；Cellometer Mini型自動細胞計數(shù)儀（美國Nexcelom公司）；BSA224S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；5424型小型高速離心機（德國Eppendorf公司）；Milli Q Plus型超級純水儀（美國Millipore公司）；702型超低溫冰箱（美國Thermo Scientific公司）；Smart-Spec plus 型核酸蛋白測定儀（美國Bio-Rad公司）；ViiA7型實時熒光定量PCR系統(tǒng)（美國Thermo公司）。

1.3 藥物和試劑 本研究所用的補腎強筋膠囊由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供（生產批號20161003）；高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，生產批號8116358）；澳洲胎牛血清（美國Corning公司，生產批號35076116）；胰蛋白酶（美國Gibco公司，生產批號1846496）；DPBS（美國Corning公司，生產批號21031489R）；重組人IL-1β試劑（美國Peprotech公司，生產批號0909AFC95A0616）；Trigol試劑（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，生產批號50T00150）；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific公司，生產批號00182216）；MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）（美國Thermo Scientific公司，生產批號00361271）；相關引物（上海英濰捷基貿易有限公司）。

2 方 法

2.1 含藥血清制備 10只SD雌性大鼠在SPF級動物實驗室適應性喂養(yǎng)1周后，按體質量隨機分組法分為給藥組和正常對照組，每組5只。參考《中藥藥理研究方法學》中的“體表面積比”換算方法換算出動物的臨床等效劑量作為給藥劑量。給藥組采用0.243 g·kg-1生藥進行灌胃[8]；正常對照組則給予等體積的生理鹽水進行灌胃。所有大鼠連續(xù)灌胃7 d，最后一次給藥后1 h，采用巴比妥鈉注射麻醉后進行大鼠腹主動脈取血，離心機3000 r·min-1離心血樣5 min，吸取上清液，于56 ℃滅活30 min后采用0.45 μm濾膜抽濾除菌，分裝后放置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。endprint

2.2 細胞培養(yǎng)和造模 收集在本單位骨科手術室進行膝關節(jié)置換手術的患者（年齡65歲以上）的關節(jié)軟骨，迅速轉移至細胞培養(yǎng)室，按照本實驗室的傳統(tǒng)做法[8]分離和培養(yǎng)人原代軟骨細胞。將培養(yǎng)的第2代人軟骨細胞按每孔3×105個細胞種植于細胞培養(yǎng)6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度達到80%左右時棄去培養(yǎng)基，并且用DPBS洗2次后，分為以下3組：空白對照組只添加高糖DMEM培養(yǎng)基和10%大鼠空白血清；模型對照組添加高糖DMEM培養(yǎng)基和10%大鼠空白血清，并且加入10 ng·mL-1 IL-1β；含藥血清組添加高糖DMEM培養(yǎng)基和10%大鼠含藥血清，并且加入10 ng·mL-1IL-1β。以上各組細胞設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各組細胞。

2.3 反轉錄合成First-strand cDNA 首先采用Trigol，氯仿，異丙醇和75%乙醇等試劑提取軟骨細胞總RNA，然后將RNA反轉錄合成第一鏈cDNA。其中U6和miRNA-140-5p的First-strand cDNA合成中分別加入各自的RT引物，ADAMTS-5和MMP-13的First-strand cDNA合成中加入隨機引物?；蛞镌O計利用Primer 6.0生物軟件，分別設計了U6，擴增片段大小為89 bp；miRNA-140-5p，擴增大小為64 bp；GAPDH（基因序列號：M33197），擴增片段大小為105 bp；ADAMTS-5（基因序列號：NM_007038），擴增片段大小為113 bp；IGFBP5（基因序列號：NM_002427），擴增片段大小為241 bp；

MMP-13（基因序列號：NM_002427），擴增片段大小為183 bp。相關的引物均由上海英濰捷基貿易有限公司合成，具體的引物信息見表1。

2.4 基因表達的檢測 將滅菌超純水9.5 ?L，相關前引物和后引物（終濃度均是1 ?M）各1 ?L，cDNA 1 ?L，MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）12.5 ?L混合后共25 ?L體系放入定量PCR儀進行擴增。步驟1：94 ℃預變性5 min；步驟2：94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，

72 ℃延伸50 s，共45個循環(huán)。步驟3：72 ℃延伸7 min。擴增反應結束后進行產物熔解曲線分析。最終運用2-△△Ct法計算各組基因相對表達量。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間均數(shù)兩兩比較，方差齊時采用SNK法；方差不齊時采用Dunnett's T3法。當P < 0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 補腎強筋膠囊含藥血清對軟骨細胞miRNA-140-5p表達的影響 與空白對照組比較，模型對照組軟骨細胞miRNA-140-5p表達明顯降低；與模型對照組比較，補腎強筋膠囊含藥血清顯著升高軟骨細胞miRNA-140-5p表達。見表2、圖1、圖2。

3.2 補腎強筋膠囊含藥血清對軟骨細胞ADAMTS-5、IGFBP5和MMP-13 mRNA表達的影響 與空白對照組比較，模型對照組軟骨細胞ADAMTS-5和MMP-13 mRNA表達均明顯升高（P < 0.05），而IGFBP5 mRNA表達明顯下降（P < 0.05）；與模型對照組比較，補腎強筋膠囊含藥血清顯著降低ADAMTS-5和MMP-13 mRNA表達（P < 0.05），并且顯著提高IGFBP5 mRNA的表達（P < 0.05）。見表3。

4 討 論

關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞及其細胞外基質組成，通常情況下軟骨細胞的細胞外基質合成和分解代謝處于動態(tài)平衡，從而維持軟骨細胞穩(wěn)態(tài)。一旦軟骨細胞代謝失衡，細胞外基質降解加劇將引起軟骨退變，導致KOA發(fā)病。miRNAs是一類由內源基因編碼的長度為20～22個核苷酸的非編碼蛋白單鏈小RNA家族，通常通過影響靶基因的轉錄和翻譯，進而影響細胞的功能[9]。目前研究表明，miRNAs在KOA的發(fā)病過程中起重要作用[10]，其中miRNA-140在維持軟骨基質穩(wěn)態(tài)方面的作用尤為明顯[6-7]。miRNA-140在小鼠關節(jié)軟骨中表達明顯高于其他組織，并且在OA軟骨中的表達明顯低于正常軟骨[11-12]。另外，細胞炎癥因子是KOA發(fā)病進程中重要的致病因素，其中與KOA發(fā)病密切相關的是IL-1β，它是導致關節(jié)軟骨代謝失衡，促進軟骨基質降解進而破壞關節(jié)軟骨的主要細胞因子[13]。已有研究表明，IL-1β的刺激可以明顯降低體外培養(yǎng)的關節(jié)軟骨細胞miRNA-140的表達，這說明IL-1β誘導的體外軟骨細胞退變模型和臨床上的OA很類似，均以miRNA-140表達的顯著降低為主要特征。

在軟骨細胞外基質合成代謝中，胰島素樣生長因子-1（IGF-1）合成代謝細胞因子，可以減少關節(jié)軟骨的破壞，IGFBP5則可以調控其活性，與IGF-1的含量呈正相關。Tardif等[14]通過轉染miRNA-140以及抗miRNA-140分別處理OA軟骨細胞，證實了miRNA-140是IGFBP5的靶基因。在軟骨細胞外基質分解代謝中，引起軟骨細胞外基質降解的蛋白酶包括ADAMTS-5，它主要降解蛋白聚糖[15]；還包括MMP-13，它主要降解Ⅱ型膠原蛋白。Trzeciak等[16]發(fā)現(xiàn)，miRNA-140可以抑制ADAMTS-5的表達，從而緩解蛋白聚糖減少為特征的OA。Liang等[17]發(fā)現(xiàn)，miRNA-140可以負反饋調節(jié)IL-1β刺激的人軟骨C28/I2細胞系中MMP-13的表達。熒光素酶報道基因實驗進一步證實了ADAMTS-5和MMP-13都是miRNA-140的靶基因。

本研究首先制備了院內制劑補腎強筋膠囊的含藥血清，然后運用該含藥血清干預IL-1β刺激的體外人軟骨細胞退變模型，重點研究了miRNA-140及軟骨代謝相關靶點基因表達的變化。endprint

結果發(fā)現(xiàn)和文獻報道一致，IL-1β的刺激導致人原代軟骨細胞miRNA-140-5p表達和IGFBP5 mRNA表達明顯降低，同時ADAMTS-5、MMP-13 mRNA表達明顯升高[12]。而補腎活血方含藥血清可以顯著提高軟骨細胞miRNA-140-5p表達及IGFBP5 mRNA表達，明顯降低ADAMTS-5、MMP-13 mRNA表達水平，這表明其治療KOA的作用機制與調控miRNA-140進而維持軟骨細胞穩(wěn)態(tài)密切相關。該研究首次在人原代軟骨細胞miRNA層面探討了補腎活血方對軟骨代謝的影響，為全面闡釋其治療KOA的作用機制奠定了基礎。然而，該補腎活血方是否還調控其他miRNAs從而干預KOA，值得深入研究。

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