劉勝男，石鳳翎，閆 偉，張雨桐，張 玥

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

利用ISSR分子標記的指紋圖譜對內(nèi)蒙古6個苜蓿品種的鑒定初報

劉勝男，石鳳翎，閆 偉，張雨桐，張 玥

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

以內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學培育注冊的6個苜蓿品種(草原1號、草原2號、草原3號、草原4號、準格爾苜蓿和敖漢苜蓿)為試驗材料，利用ISSR分子標記技術篩選出適宜的10條引物，建立各品種的指紋圖譜，根據(jù)同一引物的圖譜差異將各品種加以鑒定區(qū)分。結(jié)果表明，利用10條引物中的4條引物的圖譜繪制了2套苜蓿品種的鑒定圖，根據(jù)各品種在圖譜中不同位置特異條帶的有無，可將全部6個苜蓿品種準確區(qū)別開。

苜蓿；指紋圖譜；品種鑒定；ISSR分子標記

Abstract：Use Inner Mongolia Agricultural University fostered and registered six Alfalfa varieties (M.varia Martin.cv.Caoyuan No.1,M.varia Martin.cv.Caoyuan No.2,M.varia Martin.cv.Caoyuan No.3,M.sativa L.cv.Caoyuan No.4,M.sativa L.cv.Zhungeer,M.sativa L.cv.Aohan) as the experimental material, using ISSR molecular marker technology to choose suited 10 primers, to establish the fingerprint of each variety , according to differences in fingerprint of the same primer to distinguish each variety. The results show that, use 4 primers in suited 10 primers can draw 2 sets of alfalfa varieties identification figure, according to with or without specific bands at different location in the fingerprint of each variety , all six alfalfa varieties can be distinguish.

Keywords:Alfalfa；Fingerprint；Identification of Varieties；ISSR Molecular Marker

1 引言

至2015年,我國注冊登記苜蓿品種80個〔1〕，但由于我國市場上苜蓿品種混亂、真假難辨、真正的優(yōu)良苜蓿品種得不到有效的保護。許多生產(chǎn)者往往不能辨別出各品種之間的差異，造成播種后損失慘重〔2〕。因此快速準確地檢測出送檢樣品與標簽所示品種是否名實相符，品種是否一致，有無相互摻雜是解決當前生產(chǎn)問題中非常重要的一項技術。

傳統(tǒng)的苜蓿品種鑒定方法主要是形態(tài)鑒定法，但各苜蓿品種間在形態(tài)特征上相似,同時該方法需結(jié)合常規(guī)種植鑒定，在一個生長季節(jié)內(nèi)完成。鑒定過程所需時間較長。隨著生化技術的發(fā)展，可以從蛋白水平上對具有不同遺傳特性的種子予以鑒別，例如同工酶電泳技術、蛋白質(zhì)電泳技術，該方法發(fā)展快、應用面廣、準確性較高，彌補了常規(guī)形態(tài)鑒定法的不足，并且在苜蓿品種純度鑒定中得到了應用。國內(nèi)外學者利用種子貯存蛋白和同工酶電泳技術分別對苜蓿品種間差異進行了研究〔3-5〕，證明了不同苜蓿品種間譜帶差異明顯，說明該技術用于鑒定苜蓿品種是有效可行的。目前，已有30多種同工酶用在作物品種鑒定中，最常用的是酯酶同工酶和過氧化物同工酶，但其也存在一些不足。貯藏蛋白鑒定法(PAGE方法)和同工酶譜帶鑒定法，均存在檢測過程長、技術較復雜、成本較高,對某些遺傳背景相似的品種鑒別也較難，且由于蛋白質(zhì)、同工酶是基因控制產(chǎn)生的，多態(tài)性較少，在相似品種的鑒定上具有一定的局限性。

ISSR分子標記技術是近年來快速發(fā)展起來的一種DNA分子遺傳標記技術，DNA分子標記技術即是通過對品種DNA的多態(tài)性即DNA堿基序列的差異進行分析,從而鑒別不同品種。其檢測對象是品種的DNA片段(基因),沒有器官的特異性,不受環(huán)境的影響,有較高的準確性和重復性〔6〕。ISSR為隨機引物，引物長度在20bp左右，采用與常規(guī)的PCR相同的條件，其穩(wěn)定性比RAPD好，ISSR標記為顯性標記，可以揭示整個基因組的一些特征，符合孟德爾遺傳規(guī)律，具有穩(wěn)定性好，多態(tài)性高，試驗操作簡單、快速、用時少等優(yōu)點。因此，本試驗采用ISSR分子標記技術對6個苜蓿品種進行初步鑒定，為苜蓿品種真實性鑒定提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1供試材料

6個苜蓿品種材料及其來源詳見表1。

表1 試驗材料及來源

2.2 DNA提取

室內(nèi)盆栽育苗，當長至10片真葉時，隨機抽取30個單株，每株分別取4片幼葉混合提取DNA，使用植物基因組DNA試劑盒提取DNA〔7〕。檢測DNA濃度，稀釋到10～20ng/μl，分裝于20℃冰箱中保存。

2.3 ISSR引物篩選、PCR反應體系的建立及擴增產(chǎn)物的檢測

利用上海生物工程技術公司提供的30條ISSR引物，從中篩選出10條條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物，對6個苜蓿品種進行擴增。ISSR-PCR反應體系參照前人的試驗結(jié)果〔8〕：20μl總反應體系中含有模板DNA1μl、引物1μl、2×Taq PCR Master Mix 10μl、ddH2O 8μl。PCR擴增條件為94℃預變性3min，94℃變性30s，53～60℃退火45s，72℃延伸1.5min，循環(huán)35次，之后72℃延伸10min，4℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠在1×TBE電泳緩沖液中電泳，電壓為100V，用2 000bpDNA Marker做標準分子量對照，電泳時間為1h，在紫外凝膠儀下成像。

2.4條帶統(tǒng)計分析及苜蓿品種鑒定圖的繪制

根據(jù)不同引物的擴增結(jié)果，建立不同苜蓿品種的ISSR標記的DNA指紋圖譜，觀測其特征性譜帶的有無，然后分類鑒別。參照孫欣等人的研究方法〔9〕繪制苜蓿品種鑒定圖(CID)。

3 結(jié)果與分析

3.1多態(tài)性引物和退火溫度篩選

從30條引物中篩選出可擴增出條帶的10條引物，其長度為15～18 bp；每條引物的最佳退火溫度略有差異(52.2℃～60.2℃)。其中引物813的最佳退火溫度較低，而引物866的最佳退火溫度較高(表2)。

表2 引物序列和最佳退火溫度

3.2各引物的擴增結(jié)果與品種指紋圖譜

10條引物對6個苜蓿品種的PCR擴增結(jié)果顯示，均能擴增出條帶清晰、多態(tài)性好的譜帶。同一引物在不同品種間擴增的譜帶位置、數(shù)目或明亮度均有一定的差異(圖1)。

3.3品種鑒定圖

依據(jù)10條引物的擴增結(jié)果及6個品種的指紋圖譜，繪制出2套(圖2和圖3)6個苜蓿品種的鑒定圖(CID)。

由圖2可知，在引物846的圖譜中，在1550bp和1300bp處，為4號品種的特異性條帶；在1000bp處，為5號品種的缺失條帶，因此，首先將4號品種和5號品種鑒別出來；在1500bp處為2號品種和3號品種的特異性條帶，因此將2號、3號與1號、6號區(qū)別開。進一步篩選引物855圖譜，在1300bp處，為3號品種特異性條帶；在270bp處為2號品種的特異性條帶，因此將2號品種和3號品種區(qū)別開。利用引物848的圖譜在2000bp處1號品種有特異性條帶，將1號和6號品種鑒別開。

由圖3可看出，利用引物881可將6個苜蓿品種中的4個區(qū)分開，在2000bp處，為3號品種的特異性條帶，可把3號鑒定出來；在1700bp處，為2號、4號、6號品種的特異性條帶，由此可將1號、5號與2號、4號、6號區(qū)別開；1號材料在1000bp處，為5號品種的特異性條帶；在1600bp處，為1號品種的特異性條帶，因此將1號與5號區(qū)分開；1000bp處為4號的特異性條帶，可把4號材料從中區(qū)分出來；篩選引物848，在450bp處，為2號品種的特異性條帶，可把2號與6號區(qū)分開。利用這種方法為構建材料的指紋圖譜奠定了基礎。

圖2 利用引物846、855、848鑒別6個苜蓿品種的CID示意圖

圖3 利用引物881和848鑒別6個苜蓿品種的CID示意圖

4 討論

由于ISSR分子標記技術結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點，具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高，重復性好的特點，現(xiàn)已廣泛應用于植物品種純度鑒定、基因定位、遺傳作圖、進化和系統(tǒng)發(fā)育等各方面的研究中。在苜蓿品種鑒定的研究分析中，魏瑧武就曾經(jīng)利用SSR、ISSR和RAPD分子標記技術構建55個國內(nèi)外苜蓿品種的DNA指紋圖譜，并且表明：苜蓿品種ISSR指紋圖譜多態(tài)性豐富,穩(wěn)定性比RAPD強；可以通過2～3個引物鑒別我國主要苜蓿品種和引進品種,SSR和ISSR指紋圖譜可以更好地用于苜蓿品種鑒定和遺傳多樣性分析〔10〕。本試驗也證實可利用2～3條引物將內(nèi)蒙古培育的6個苜蓿品種鑒別開，其方法簡單快速。

在利用ISSR標記技術進行品種鑒定時，引物的篩選、合適的PCR參數(shù)、品種間特異性條帶的有無等都會影響該技術的應用及品種鑒定結(jié)果的準確性。

苜蓿為異花授粉牧草，同一品種的個體間也有一定的差異，如何鑒定品種純度，即當某一品種內(nèi)混有其他品種的種子時如何將其鑒別出來，還需從單株圖譜分析上進一步探討適宜的鑒定方法。建議在新品種登記注冊后應及時建立原種的分子指紋圖譜，以作為生產(chǎn)應用中出現(xiàn)混雜或以假亂真等現(xiàn)象的甄別依據(jù)。

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APreliminaryStudyonSixInnerMongoliaAlfalfaVarietiesIdentificationUsingISSRMarkersFingerprint

LiuShengnan,ShiFengling,YanWei,ZhangYutong,ZhangYue

(CollegeofGrassland,ResourceandEnvironmental,InnerMongoliaAgriculturalUniversity;Hohhot010019,China)

S54

A

2095—5952(2017)03—0046—05

2017-07-21

內(nèi)蒙古自治區(qū)應用技術研究與開發(fā)資金計劃“內(nèi)蒙古草品種認證與鑒定及溯源管理研究與示范”、“優(yōu)質(zhì)生態(tài)牧草新品種選育與良種繁育關鍵技術研究”、內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才“內(nèi)蒙古高原鄉(xiāng)土草種質(zhì)資源遺傳改良與利用”創(chuàng)新團隊。

劉勝男(1992- )，女，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，主要研究方向為牧草遺傳育種，E-mail：973011156@qq.com。

石鳳翎 E-mail：sfl0000@126.com