高曉夢， 蘇 健， 王曉倩， 李玉芝， 孔 青， 董 平**， 梁興國

(1. 中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003； 2. 山東省萊陽市第九中學，山東 煙臺 265200)

外源寡核苷酸對大腸桿菌和雙歧桿菌生長的影響*

高曉夢1, 2， 蘇 健1， 王曉倩1， 李玉芝1， 孔 青1， 董 平1**， 梁興國1

(1. 中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003； 2. 山東省萊陽市第九中學，山東 煙臺 265200)

為研究外源寡核苷酸對2種典型腸道菌—雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的影響，向核酸營養(yǎng)缺乏型的培養(yǎng)基中分別添加39和61 nt的2種寡核苷酸，利用平板菌落計數(shù)和16S rDNA定量法比較了外源核酸對雙歧桿菌和大腸桿菌單獨生長及2種細菌混合生長的影響。研究顯示，雖然添加2種外源寡核苷酸對單獨培養(yǎng)的2種細菌的生長都有不同程度的促進效果，但對于混合培養(yǎng)的2種細菌，大腸桿菌的生長會因雙歧桿菌的生長而受到一定的抑制，當大腸桿菌和雙歧桿菌比例增加到1∶10時，大腸桿菌生長的抑制率可達到27.7%。結果表明，腸道微生物可以通過降解本研究中的2種寡核苷酸，達到主動利用外源的核酸類物質、促進自身生長的目的，體外實驗結果預示，一些特殊序列的寡核苷酸可能對改善腸道菌群的平衡具有潛在的積極作用。

寡核苷酸；腸道微生物；雙歧桿菌；大腸桿菌

人體腸道菌群是一個復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，各種菌互相制約，互相依存，共同進化，與宿主形成穩(wěn)定的互利共生系統(tǒng)[1]。這種相依相存的關系對人體有許多重要的生理功能，如促進消化，增強免疫等。當腸道菌群發(fā)生紊亂時，可能引起身體機能的紊亂或疾病的發(fā)生，如肥胖和腸炎性疾病等[2]。其中，雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)和大腸桿菌(Escherichiacoli)是腸道菌群中2種具有代表性的細菌。雙歧桿菌是腸道菌群中的有益菌，對人體的健康有著極其重要的作用。雙歧桿菌的生物屏障功能能阻止一些種類的致病菌的入侵和定植[3]；乳糖不耐癥的人群可以適量補充雙歧桿菌以減輕乳糖不耐[4]；此外，雙歧桿菌還具有延緩衰老、降低膽固醇和抗腫瘤等作用[5]。大腸桿菌是人體內(nèi)的中性菌，正常情況下不會對人體健康產(chǎn)生危害，只有在機體免疫力降低等情況下才會引發(fā)一些感染或炎癥，同時，有些種類的大腸桿菌能夠引起腹瀉、腎衰竭等癥狀[6]。

近年來，攝入核酸的安全性和功能性問題引起人們越來越多的關注。研究表明，嬰兒日糧中添加核酸與未添加比較，嬰兒糞便中的雙歧桿菌和乳酸桿菌含量升高，而腸道有害菌的比例下降，因此能夠降低嬰兒腹瀉等腸道疾病的發(fā)生[7]。嬰幼兒由于腸道內(nèi)微生物發(fā)育不完全，補充核酸顯得尤為重要，對成年人來講，核酸的攝入同樣對維持腸道的菌群平衡、促進胃腸粘膜生長等有積極的作用[8]。同時，核酸還被報道具有抗氧化[9]、提高免疫力、促進細胞增生分化，抗放射線損害等生理活性[10]。

本文研究了2種特定序列的單鏈寡核苷酸對雙歧桿菌和大腸桿菌這2種具有代表性的腸道細菌生長的影響，并模擬寡核苷酸進入到細菌中的情況，初步探究了外源寡核苷酸在2種細菌液中的生物穩(wěn)定性，為研究外源核酸對腸道細菌生長的影響提供基礎。關于攝入核酸對腸道微生物的影響，目前研究大多集中于單核苷酸。近年來對小鼠[11-12]、仔豬[13-14]和魚類[15]等動物實驗的研究表明，飼料中添加單核苷酸可以促進腸道菌群平衡、提高機體免疫力。而我們?nèi)粘＋@取的核酸大多來自于飲食，食品中核酸在體內(nèi)的消化被認為從小腸開始，到達小腸時核酸從蛋白、糖等其他食品成分中剝離出來，以裸露的寡核苷酸狀態(tài)存在其中，腸道微生物直接面對的主要核酸成分將是寡核苷酸。甚至有研究表明腸道微生物體內(nèi)能夠發(fā)現(xiàn)這些通過飲食攝入的外源寡核苷酸[16]。而關于寡核苷酸對腸道微生物的影響鮮有報道，因此，深入研究寡核苷酸對腸道微生物的影響有利于人們理解飲食核酸及其吸收利用對健康的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(E.coliTop 10)，天根生物科技有限公司，經(jīng)5次傳代培養(yǎng)后使用；青春雙歧桿菌(B.adolescentis)，中國微生物菌種保藏中心；配制培養(yǎng)基所用的試劑皆為國產(chǎn)分析純；細菌基因組提取試劑盒、pGM-T連接試劑盒和質粒小提試劑盒，天根生物有限公司；SYBR? Select Master Mix，美國Invitrogen公司；DreamTaq Green PCR Master Mix，美國Thermo Scientific公司。

雙功能氣浴恒溫振蕩器，金壇市科析儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；超聲細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；厭氧培養(yǎng)箱，日本三菱公司；紫外分光光度計，日本島津公司；實時熒光定量PCR，杭州博日有限公司。

本研究中使用的寡核苷酸購買自蘇州金唯智生物科技有限公司，片段序列列于表1中。

表1 本研究所用寡核苷酸的名稱及序列

1.2 實驗方法

1.2.1 2種細菌培養(yǎng)基的配制 PTYG培養(yǎng)基[17]用于雙歧桿菌活化培養(yǎng)，LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌活化培養(yǎng)。由于培養(yǎng)基中的核酸成分主要由酵母粉提供，所以本研究培養(yǎng)2種細菌所用的核酸缺乏型培養(yǎng)基均不含酵母粉。以下稱酵母粉缺乏型PTYG培養(yǎng)基(或PTYG-)和酵母粉缺乏型LB培養(yǎng)基(或LB-)。

1.2.2 大腸桿菌和雙歧桿菌生長曲線的測定 采用比濁法建立大腸桿菌top10菌株(以下簡稱大腸桿菌)和青春雙歧桿菌(以下簡稱雙歧桿菌)的生長曲線。具體操作如下：將活化好的2種菌液按1%的接種量分別接種于正常LB和酵母粉缺乏型LB培養(yǎng)基中及正常型PTYG和酵母粉缺乏型PTYG培養(yǎng)基中。其中大腸桿菌在37℃，150 r/min的恒溫振蕩器中震蕩培養(yǎng)，雙歧桿菌在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。大腸桿菌培養(yǎng)基每隔2 h取樣，600 nm波長下比色，記錄其光密度值，雙歧桿菌每隔3 h取樣600 nm波長下比色，記錄光密度值。以時間為橫坐標，菌液的OD值為縱坐標建立生長曲線。

1.2.3 大腸桿菌和雙歧桿菌單獨培養(yǎng)的方法 采用平板菌落計數(shù)法探究不同濃度的單核苷酸混合物及寡核苷酸對大腸桿菌和雙歧桿菌單獨生長的影響。具體操作方法如下：將活化好的菌株按0.1%的接種量接種在酵母粉缺乏的培養(yǎng)基中，并向培養(yǎng)基中添加寡核苷酸，分別培養(yǎng)至平穩(wěn)期后平板菌落計數(shù)，建立柱狀圖。

1.2.4 大腸桿菌和雙歧桿菌混合培養(yǎng)的方法 將2種細菌活化后接種到添加寡核苷酸的培養(yǎng)基(PTYG-)中，于厭氧試管中培養(yǎng)。培養(yǎng)至穩(wěn)定期后利用細菌16S rDNA熒光定量PCR的方法對2種細菌進行計數(shù)[18]。

1.2.5 根據(jù)細菌16S rDNA定量的方法 細菌16S rDNA引物的設計：本研究中雙歧桿菌的引物是根據(jù)雙歧桿菌的16S rDNA基因序列，應用引物設計軟件設計其特異性引物。定量大腸桿菌所用16S rDNA的引物參考文獻[19]，2種細菌引物信息見表2。

表2 q-PCR使用的引物

標準品的制備：將2種細菌擴大培養(yǎng)，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取2種細菌的基因組DNA。利用細菌16S rDNA的引物分別擴增2種細菌的基因組DNA獲得目的基因。采用醇沉法純化目的基因。將目的基因與質粒載體連接后導入到大腸桿菌中擴大培養(yǎng)后利用質粒小提試劑盒提取質粒。得到的質粒為熒光定量PCR的標準品，根據(jù)標準品的濃度計算其中細菌的濃度，并根據(jù)熒光定量PCR的熒光值和細菌濃度制作標準曲線。

混合培養(yǎng)細菌的定量：利用細菌DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的混合培養(yǎng)細菌的DNA，以此為模版，分別利用2種細菌的引物，通過熒光定量PCR和標準曲線定量每種細菌的數(shù)量。

1.2.6 寡核苷酸在細菌培養(yǎng)基中穩(wěn)定性的檢測 取培養(yǎng)24 h的菌液10 000 r/min離心5 min取上清。取18 μL培養(yǎng)基加2 μL(10 μmol/L)的片段，37℃恒溫靜置，分別在20 min、2 、6和20 h時加等體積苯酚氯仿異戊醇，10 000 r/min，5 min后取上清。用15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，電壓為350 V。根據(jù)電泳圖中寡核苷酸的殘余判斷其穩(wěn)定性。

1.2.7 寡核苷酸在2種細菌細胞液中穩(wěn)定性的檢測 將細菌破碎后，一部分作為對照，另一部分加入寡核苷酸，每隔一定的時間終止反應，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，檢測片段的完整性，以此評價寡核苷酸在細菌中的穩(wěn)定性。細菌的破碎方法為：取細菌培養(yǎng)液10 000 r/min離心5 min棄上清，用PBS重懸，離心。反復清洗3次后PBS重懸，用超聲細胞破碎儀300 W，5 s、10 s和20 min破碎菌體[20]。分別取18 μL的細菌破碎液加2 μL(10 μmol/L)的片段和20 μL的細菌破碎液，37℃恒溫靜置，分別在20 min，2 、6和12 h時加等體積苯酚氯仿異戊醇，10 000 r/min，5 min后取上清。用15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，電壓為350 V。

2 結果與分析

2.1 寡核苷酸對大腸桿菌和雙歧桿菌生長的影響

2.1.1 細菌培養(yǎng)時間的確定 為探究外源寡核苷酸對2種細菌生長的影響，本研究在正常的培養(yǎng)基成分中去掉酵母提取物成分，使其成為核酸營養(yǎng)缺乏型的培養(yǎng)基。通過繪制細菌在正常培養(yǎng)基和酵母粉缺乏型培養(yǎng)基中的生長曲線，對2種細菌的生長狀況有整體的把握。

圖1 A顯示了雙歧桿菌在酵母粉缺乏型PTYG培養(yǎng)基和正常PTYG培養(yǎng)基中的生長曲線。在正常PTYG培養(yǎng)基中培養(yǎng)約5 h后，雙歧桿菌的生長進入對數(shù)期，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質足以維持其生長繁殖，生長速率最大；18 h后，細菌的數(shù)量達到最大值并維持穩(wěn)定，此時細菌生長處于平穩(wěn)期。雙歧桿菌在酵母粉缺乏型培養(yǎng)基中的生長趨勢與其在正常PTYG中的趨勢相比，15 h后就進入平穩(wěn)期，其在酵母粉缺乏型PTYG中的細菌數(shù)量要明顯少于其在正常PTYG中的數(shù)量，在酵母粉缺乏型PTYG中平穩(wěn)期OD值為0.8左右，而在正常PTYG中平穩(wěn)期OD值達1.7左右。

圖1 B顯示了大腸桿菌在正常LB和酵母粉缺乏型LB培養(yǎng)基中的生長曲線。大腸桿菌在正常培養(yǎng)基中的生長速度和數(shù)量高于其在酵母粉缺乏型的培養(yǎng)基中的情況。在酵母粉缺乏的LB培養(yǎng)基中，0～10 h處于對數(shù)生長期，12～20 h處于平穩(wěn)期。

(PTYG、PTYG-、LB和LB-分別為正常型雙歧桿菌培養(yǎng)基、酵母粉缺乏型雙歧桿菌培養(yǎng)基、正常型大腸桿菌培養(yǎng)基和酵母粉缺乏型大腸桿菌培養(yǎng)基。PTYG：NormalB.adolescentismedium；PTYG-：Yeast lackingB.adolescentismedium；LB：NormalE.colimedium；LB-：Yeast lackingE.colimedium.)

圖1 2種細菌在培養(yǎng)基中的生長曲線

Fig.1 Growth curves ofthe two kinds of bacterium inthe medium

正常培養(yǎng)基的配方中含有酵母粉，它是培養(yǎng)基核苷酸的主要來源[21]。在含有酵母粉的培養(yǎng)基中，2種細菌的生長速率都明顯高于其在不含酵母提取物的培養(yǎng)基中的生長速率，平穩(wěn)期時含有酵母提取物的培養(yǎng)基中的細菌的量也高于不含酵母提取物培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細菌數(shù)量。因此，酵母粉中的核酸成分對細菌的生長有重要作用。為了定量探討核酸成分對細菌生長的影響，我們在以下的研究中，采用了不含有酵母粉的培養(yǎng)基。后續(xù)的研究中，將選用處于對數(shù)生長期的細菌進行接種，并在平穩(wěn)期研究外源寡核酸對細菌生長的影響。因為在對數(shù)期細菌的活力較大，且平穩(wěn)期時細菌的數(shù)量穩(wěn)定便于計數(shù)。

2.1.2 寡核苷酸對2種細菌單獨生長的影響 為探究寡核苷酸對2種細菌生長的影響，本研究選用2種長度和序列均不同的寡核苷酸——39和61 nt[22]，初步探究其對2種細菌生長的影響。

圖2顯示的是向雙歧桿菌和大腸桿菌的酵母粉缺乏型培養(yǎng)基中添加39和61 nt的寡核苷酸的細菌生長結果，添加的寡核苷酸的終濃度是10 μmol/L，其質量濃度分別約為0.1和0.2 mg/mL，培養(yǎng)至20 h左右時進行計數(shù)。

圖2 寡核苷酸對雙歧桿菌和大腸桿菌生長的影響Fig.2 The influence of oligonucleotides onthe growth of B. adolescentisand E. coli

從圖2中可以看出，添加寡核苷酸能促進雙歧桿菌的生長，其中39和61 nt的片段對雙歧桿菌生長的促進率分別是19.0%和29.4%。向大腸桿菌的酵母粉缺乏型培養(yǎng)基中添加終濃度為10 μmol/L的2種寡核苷酸，其對大腸桿菌的生長也有促進作用。其中39和61 nt片段對大腸桿菌生長的促進率分別是16.9%和25.9%。

從上述結果可以看出，2種細菌在核酸營養(yǎng)成分缺乏時，都可以利用外源的寡核苷酸促進自身的生長發(fā)育。

2.1.3 寡核苷酸對2種細菌混合生長的影響 寡核苷酸對單獨培養(yǎng)的雙歧桿菌和大腸桿菌的生長都有促進作用，但是人體的腸道中是多種細菌共同生長形成的復雜系統(tǒng)，因此將以混合培養(yǎng)的大腸桿菌和雙歧桿菌研究外源寡核苷酸對它們生長的影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒剛出生4～7 d時，體內(nèi)大腸桿菌和雙歧桿菌的比例約為1∶100，隨著年齡的增長，體內(nèi)的雙歧桿菌數(shù)量越來越少[23]。本研究選用大腸桿菌和雙歧桿菌的比例為1∶10，模擬探究當機體有外源大腸桿菌侵入時，外源寡核苷酸對2種細菌混合生長的影響。

向2種細菌混合培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μmol/L的39 nt的寡核苷酸(質量濃度約為0.1 mg/mL)，結果如表3所示，添加寡核苷酸的實驗組中雙歧桿菌的數(shù)量明顯多于不加寡核苷酸組(P<0.01)。對于大腸桿菌(見圖3)，培養(yǎng)基中加入外源的寡核苷酸后，混合培養(yǎng)中的雙歧桿菌能明顯地抑制大腸桿菌的生長，當大腸桿菌和雙歧桿菌的比例為1∶5時，抑制率為19.0%； 當體系中雙歧桿菌的比例增加到1∶10時，雙歧桿菌對大腸桿菌生長的抑制率為27.7%，雙歧桿菌的數(shù)量越多對大腸桿菌生長的抑制作用越大。盡管本研究發(fā)現(xiàn)添加寡核苷酸后混合培養(yǎng)中大腸桿菌的數(shù)量較未添加寡核苷酸組多(P<0.01)，但是雙歧桿菌的生長被促進后能夠明顯地抑制大腸桿菌的生長。

表3 39 nt的寡核苷酸對混合培養(yǎng)的2種細菌生長的影響Table 3 The effect of 39 nt oligonucleotides on the growth of the two kinds of bacterium in mixed culture

注：混合培養(yǎng)的大腸桿菌與雙歧桿菌的初始比例為1∶10。**表示P<0.01與不加核酸組比較。

Note：The original proportion ofE.coliandB.adolescentiswas 1∶10 in mixed culture.**representP<0.01 compared with the group of without oligonucleotides.

①Bacteria；②Without oligonucleotides group；③With oligonucleotides group；④B.adolescentis；⑤E.coli

圖3 雙歧桿菌對大腸桿菌生長的影響Fig.3 The effect of B. adolescentis on the growth of E. coli

上述研究結果證明，寡核苷酸可能被菌吸收并加以利用，對細菌生長產(chǎn)生影響，其被吸收和利用的形式將在以下實驗中做進一步研究。

2.2 模擬寡核苷酸進入細菌后的穩(wěn)定性

2.2.1 寡核苷酸在2種細菌培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性 為研究培養(yǎng)基對寡核苷酸穩(wěn)定的影響，將本文所用的61和39 nt的寡核苷酸和培養(yǎng)基混合，使用的培養(yǎng)基為已培養(yǎng)細菌24 h后，離心去掉菌體的上清液。

如圖4 A和4 B所示，2種寡核苷酸在單純培養(yǎng)基中20 h后均沒有降解。這表明，寡核苷酸在培養(yǎng)液中以完整狀態(tài)存在，即細菌在吸收這2種寡核苷酸之前，這2種片斷是完整的，應以完整的形式進入菌體。

圖4 2種寡核苷酸在雙歧桿菌培養(yǎng)基和大腸桿菌培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性

2.2.2 寡核苷酸在2種菌細胞液中的穩(wěn)定性 為研究寡核苷酸進入菌體后是以何種形式發(fā)揮促進細菌生長的作用，我們研究了片段在2種細菌破碎液中的穩(wěn)定性，以模擬分析寡核苷酸進入細菌后的存在形式。

由圖5 A和B可以看出，2種細菌破碎液都只在膠孔附近有大量DNA片段，在39和61 nt的寡核苷酸處均沒有出現(xiàn)電泳條帶，說明2種寡核苷酸在加入到細菌破碎液前，雙歧桿菌和大腸桿菌破碎液中沒有與之大小相同的核酸片段。

圖5 2種細菌破碎液中核酸存在形式

圖6顯示的是39和61 nt的寡核苷酸在雙歧桿菌細胞液中的穩(wěn)定性。從圖中可以看出，39 nt的寡核苷酸在雙歧桿菌的細胞液中2 h后就被完全降解，61 nt長的片段在6 h后被完全降解。大腸桿菌破碎細胞液中的降解情況如圖7所示，39 nt長的片段在大腸桿菌破碎液中降解很快，到20 min時已經(jīng)降解了大部分，到2 h時已經(jīng)降解完全，而61 nt長的片段在大腸桿菌破碎液中降解地較慢，12 h后被完全降解。

圖6 2種寡核苷酸在雙歧桿菌破碎液中的穩(wěn)定性

圖7 2種寡核苷酸在大腸桿菌破碎液中的穩(wěn)定性

3 討論

核酸對微生物的生長繁殖起著非常重要的作用，在體內(nèi)核酸供給不足的情況下，補充外源核酸有助于促進腸道有益菌的生長，維持腸道菌群平衡[24]。本研究選用核酸缺乏型培養(yǎng)基，對于單獨培養(yǎng)的大腸桿菌和雙歧桿菌，添加外源寡核苷酸對2種細菌單獨生長均有相似的促進作用。不同序列的寡核苷酸對2種細菌生長的促進作用有一定差別，這可能與寡核苷酸的序列和長度有關。Sauer等人研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加單核苷酸的種類和濃度的不同對幾種大腸桿菌生長的影響有較大差異[25]。也有研究表明，哺乳動物細胞對雙鏈寡核苷酸的攝取存在序列依賴性[26]，而關于腸道微生物對外源核酸的攝取是否也具有一定的序列選擇性還需要進一步的研究驗證。

當2種細菌混合培養(yǎng)時，添加寡核苷酸對雙歧桿菌生長的促進作用要明顯高于其對混合培養(yǎng)中的大腸桿菌生長的影響。雖然在混合培養(yǎng)中添加寡核苷酸后大腸桿菌的增長數(shù)量多于未添加寡核苷酸組，但是雙歧桿菌的生長被促進后能夠明顯地抑制大腸桿菌的生長。由此可見，寡核苷酸能促進雙歧桿菌的生長，且雙歧桿菌的生長將抑制大腸桿菌的生長。雙歧桿菌對大腸桿菌生長的抑制，可能是由于雙歧桿菌生長代謝產(chǎn)生乙酸等短鏈脂肪酸，降低了環(huán)境pH，從而抑制大腸桿菌的生長[27]。Lau等人也得出了相似的結論，雙歧桿菌能通過合成有機酸等抗菌物質抑制有害菌的生長[28]。也有研究指出，腸道中其他種類的細菌如乳酸桿菌等也可能會對大腸桿菌的生長產(chǎn)生抑制作用[29]。探究寡核苷酸在腸道中對大腸桿菌數(shù)量的影響，僅僅研究其與雙歧桿菌混合培養(yǎng)是遠遠不夠的，需要對腸道菌群有全面的研究后才能下定論。

細菌中有多種核酸酶，寡核苷酸在細胞液中的降解，是核酸酶作用的結果。不同核酸片段的降解速度不同，可能與他們的序列結構及細菌中酶的種類不同有關。外源核酸進入細胞的吸收機制和代謝命運一直是人們關注的焦點[30-31]。寡核苷酸對細菌生長促進作用與其降解快慢沒有表現(xiàn)出明顯的相關性，僅與加入培養(yǎng)基中核酸的濃度有關。即降解得快的寡核苷酸并不能更多的促進細菌的生長。因此，雖然寡核苷酸進入細菌后，它可以被菌體中的核酸酶在短時間內(nèi)降解成單核苷酸被細菌利用，但能被細菌利用的形式可能不完全是單核苷酸等降解產(chǎn)物，未被降解的寡核苷酸也可能迅速被菌體所利用。需要指出的是，本實驗只是模擬寡核苷酸進入細菌后的穩(wěn)定性，進入每個細菌后的寡核苷酸所面臨的降解核酸的酶的濃度不能完全確定，需要進一步研究。

另外，本研究向雙歧桿菌的培養(yǎng)基中添加單核苷酸，結果表明，單核苷酸可以明顯地促進雙歧桿菌的生長(結果未列出)，并且其作用效果與寡核苷酸相似。這與Tanaka和Mutai等人在離體實驗中向培養(yǎng)基中添加外源單核苷酸有利于雙歧桿菌的生長的結論是一致的[32]。近年來對一些動物實驗的研究也表明，飼料中添加單核苷酸對促進腸道細菌的生長和維持腸道菌群平衡具有積極作用[11-15]。單核苷酸和寡核苷酸對細菌生長都有類似的促進作用，并且寡核苷酸進入細菌后可以被細菌中的核酸酶降解，因此寡核苷酸對細菌的促生長作用可能是由其進入細菌后降解產(chǎn)生的單核苷酸。因此，食品中的核酸成分在進入人體消化道降解成為寡核苷酸后，能夠被細菌作為生長材料所利用，參與細菌核酸類物質的合成。

4 結語

本研究表明，核酸作為一種營養(yǎng)物質，當培養(yǎng)基中的核酸缺乏時，腸道中的細菌能夠主動地攝取外源寡核苷酸供生長所需。寡核苷酸能促進2種腸道細菌的生長，同時，還能在混合培養(yǎng)的雙歧桿菌和大腸桿菌中促進有益菌雙歧桿菌的生長，平衡菌群比例，調(diào)節(jié)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。其作用機制與寡核苷酸進入菌體后降解成的單核苷酸或更短的寡核苷酸有關。本研究結果將對飲食攝入核酸和特殊人群補充核酸起到一定的指導作用。

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Abstract: The safety and function of dietary nucleic acids on human body have received significant attentions in recent years. Adding exogenous nucleotides was widely recommended in infant formula milk powder and infant food for their beneficial functions. In the past, the researches mainly focused on the effect of mononucleotides on intestinal microorganisms. The nucleic acids are taken in mostly through food, and oligonucleotides are the important form of intake nucleic acids. However, there was less study on the influence of oligonucleotides on the intestinal microorganisms. In this study, we employed two kinds of oligonucleotides to investigate their effects on the growth of two typical intestinal bacteriaEscherichiacoliandBifidobacteriumadolescentis. Firstly,E.coliandB.adolescentiswere cultured separately in the medium lacking nucleic acids, and then two kinds of oligonucleotides (39 nt and 61 nt in length) were added into the medium. The primary results showed that the two oligonucleotides promoted the growth ofE.coliandB.adolescentis, respectively. Considering the complex intestinal bacterial community,E.coliandB.adolescentiswere then culture together, and real time quantitative PCR was used to quantifying the 16S rRNA gene (rDNA) of the two bacteria. Compared with the control, the added oligonucleotides promoted theB.adolescentisgrowth. However, it inhibited the growth ofE.coliobviously. To study the form of the oligonucleotides appropriate for bacteria, the collected bacteria were broken with ultrasonic wave with the released cytoplasm mixed with the oligonucleotides in order to simulate the existence of oligonucleotides in bacteria. The results of electrophoresis showed that the oligonucleotides remained undestroyed in the medium; however, they were degradable in bacterial cytoplasm. The results also showed that the degradation rate of 39 nt oligonucleotide was faster than that of the 61 nt oligonucleotide in both bacteria. The results indicated that the intestinal microorganisms preferred to degrade oligonucleotides instead of the integrated ones. In conclusion, intestinal microorganisms were able to utilize the exogenous nucleic acids for their growth. Meanwhile, exogenous nucleic acids play a positive role in maintaining the balance of gut microbes.

Key words: oligonucleotides; intestinal microorganism;Bifidobacteriumadolescentis;Escherichiacoli

責任編輯 朱寶象

The Influence of Exogenous Oligonucleotides on the Growth ofEscherichiacoliandBifidobacteriumadolescentis

GAO Xiao-Meng1, 2, SU Jian1, WANG Xiao-Qian1, LI Yu-Zhi1, KONG Qing1, DONG Ping1, LIANG Xing-Guo1

(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. No. 9 Middle School of Laiyang, Yantai 265200, China)

TS201.4

A

1672-5174(2017)11-031-09

10.16441/j.cnki.hdxb. 20160208

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國家自然科學基金項目(31201327，31301420)；國家自然科學基金委員會-山東省人民政府聯(lián)合資助海洋科學研究中心項目(U1406402)資助 Supported by National Natural Science Foundation of China(31201327，31301420)；National Natural Science Foundation of China(NSFC)-Shandong Joint Fund for Marine Science Research Centers(U1406402)

2016-06-03；

2016-10-14

高曉夢(1989-)，女，碩士生。E-mail: xiaomeng09sd@126.com

** 通訊作者：E-mail: dongping@ouc.edu.cn