梁 媛， 趙 馨 怡， 張 靖 偉， 簡 路 洋， 梁 帥， 王 晗， 王 際 輝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

亞油酸和α-亞麻酸對(duì)脂肪干細(xì)胞活力及成脂分化的影響

梁 媛1， 趙 馨 怡2， 張 靖 偉1， 簡 路 洋1， 梁 帥1， 王 晗2， 王 際 輝2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

應(yīng)用MTT比色法檢測不同濃度的亞油酸和α-亞麻酸對(duì)脂肪干細(xì)胞活力的影響，利用油紅O染色法和甘油三酯質(zhì)量摩爾濃度測定法檢測亞油酸和α-亞麻酸對(duì)脂肪干細(xì)胞成脂分化的影響。MTT結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，α-亞麻酸能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞活力，但在較高濃度(60 μmol/L)體現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用；而亞油酸能夠顯著抑制脂肪干細(xì)胞活力。油紅O染色和甘油三酯測定結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，亞油酸和α-亞麻酸均能促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成脂分化；與α-亞麻酸相比，亞油酸對(duì)脂肪干細(xì)胞成脂分化的促進(jìn)作用更強(qiáng)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

亞油酸；α-亞麻酸；脂肪干細(xì)胞；細(xì)胞活力；成脂分化

Abstract: The adipose tissue-derived stromal cells (ADSCs) were treated with different contentions of linoleic acid (LA) and alpha-linolenic acid (ALA). MTT assay was used to measure the effects of LA and ALA on cell viability. The effects of LA and ALA on adipogenic differentiation were detected by oil red O staining and triglyceride (TG) content assay. MTT assay showed that ALA could enhance the cell viability significantly, but significant cytotoxic effect on contentions of 60 μmol/L. LA could suppress the cell viability significantly. The result of oil red O staining and TG content assay showed that both LA and ALA could promote the adipogenic differentiation of ADSCs when compared to the control group, LA show higher adipogenic differentiation than ALA in a dose-dependent manner.

Keywords: linoleic acid; alpha-linolenic acid; adipose tissue-derived stromal cells; cell viability; adipogenic differentiation

0 引 言

脂肪酸是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，它不僅是人體細(xì)胞的重要組成成分，更參與調(diào)節(jié)體內(nèi)的多種代謝[1]。日常膳食中，多不飽和脂肪(PUFAs) 攝入的種類和數(shù)量與人體健康密切相關(guān)。有研究表明，PUFAs具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、促進(jìn)大腦發(fā)育、防治心腦血管疾病等多種生理功能[2-3]。PUFAs主要包括n-3和n-6脂肪酸兩種亞型，其中亞油酸(LA，n-6)和α-亞麻酸(ALA，n-3)被認(rèn)為是人體自身不能合成、必須從食物中獲得的必需脂肪酸[4]。LA和ALA不僅能夠在體內(nèi)通過去飽和酶的作用延長、轉(zhuǎn)化成花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等多種脂肪酸[5]，而且是參與合成前列腺素、血栓素及白三烯等類二十烷酸的重要前體物質(zhì)[6]。

肥胖已成為一個(gè)世界性的健康問題，由肥胖所引起的一系列代謝綜合征也隨之突顯。肥胖的產(chǎn)生受遺傳、社會(huì)環(huán)境等多種因素的影響，其根本表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞數(shù)目的增多和體積的增大[7]，而脂肪細(xì)胞數(shù)目的增多與干細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞的成脂分化密切相關(guān)[8]。脂肪干細(xì)胞(adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs)是一類來源于脂肪組織的多潛能干細(xì)胞，能多向分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞類型[9]。脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞活力直接影響其功能的發(fā)揮。同時(shí)，在脂肪組織發(fā)育的過程中，脂肪干細(xì)胞的成脂分化也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

據(jù)報(bào)道，n-3和n-6脂肪酸的攝入對(duì)肥胖起不同作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，攝入富含n-3 PUFAs的魚油能夠減少脂肪的累積[10]，而攝入含LA高脂飼料的母鼠會(huì)導(dǎo)致其哺乳幼崽體內(nèi)白色脂肪組織的增生和肥大[11]。體外實(shí)驗(yàn)表明，n-3和n-6脂肪酸對(duì)前脂肪細(xì)胞的增殖和分化的影響存在差異[12]。多不飽和脂肪酸對(duì)ADSCs細(xì)胞活力和成脂分化的影響尚未完全闡明。本研究以LA和ALA為對(duì)象，研究其對(duì)ADSCs細(xì)胞活力和成脂分化的影響，以期為研究飲食中脂肪酸的攝入與肥胖等脂類代謝異常的相關(guān)性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡的C57BL/6J小鼠，大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑

亞油酸，Cayman公司；α-亞麻酸，Cayman公司；MTT，上海源葉生物科技有限公司；成骨分化培養(yǎng)基，武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶鈣鈷法染色試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；油紅O，Sigma公司；甘油三酯測定試劑盒，南京建成生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 ADSCs的體外培養(yǎng)

取6～8周齡C57BL/6J小鼠，斷頸處死，75%酒精浸泡消毒5 min。無菌條件下取腹股溝處脂肪組織，剔除筋膜和血管，用含2%雙抗的PBS反復(fù)沖洗3次。將組織盲剪成糜，加等體積0.1%Ⅰ型膠原酶，37 ℃水浴中消化30 min，每10 min吹打均勻。加入等體積含有10%胎牛血清的DMEM/F12，1 500 r/min離心5 min。沉淀用PBS洗滌2次，加完全培養(yǎng)基重懸接種于培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，1∶2傳代。

1.2.2 ADSCs多向誘導(dǎo)分化

[9]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為105個(gè)/mL，重新接種于24孔板。待細(xì)胞融合至90%時(shí)，分別更換成DMEM/F12、10% FBS、1%雙抗、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、200 μmol/L吲哚美辛和10 μg/mL牛胰島素的脂分化培養(yǎng)基和成骨培養(yǎng)基，每3 d更換一次培養(yǎng)基。成脂誘導(dǎo)至14 d時(shí)，細(xì)胞用10%中性甲醛固定10 min，用PBS洗滌2次，油紅O工作液染色10 min，蒸餾水清洗，加入蘇木精染色液復(fù)染10 min，再用蒸餾水清洗，加入1% NaHCO3，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。成骨誘導(dǎo)至14 d時(shí)，細(xì)胞用70%乙醇固定10 min，按照試劑盒說明書用堿性磷酸酶鈣鈷法染色試劑盒染色，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.3 MTT法檢測亞油酸和α-亞麻酸對(duì)ADSCs 增殖的影響

細(xì)胞以5×104個(gè)/mL重新接種于96孔板。待細(xì)胞融合至90%時(shí)，分別加入稀釋過的LA和ALA處理細(xì)胞，使其終濃度為20、40、60 μmol/L，并設(shè)空白對(duì)照孔和調(diào)零孔。培養(yǎng)3 d后每孔加入20 μL MTT溶液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3～4 h。棄舊培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，輕輕振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，于490 nm處測得吸光度OD。

1.2.4 油紅O染色法檢測亞油酸和α-亞麻酸對(duì)ADSCs成脂分化的影響

細(xì)胞以105個(gè)/mL重新接種于24孔板。待細(xì)胞融合至90%時(shí)，更換成脂分化培養(yǎng)基，同時(shí)分別加入稀釋過的LA和ALA處理細(xì)胞，使其終濃度為20、40 μmol/L，并設(shè)空白對(duì)照組。成脂誘導(dǎo)至第3天，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，方法同“1.2.2”，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.5 甘油三酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

細(xì)胞以2×105個(gè)/mL重新接種于6孔板。待細(xì)胞融合至90%時(shí)，更換成脂分化培養(yǎng)基，同時(shí)分別加入稀釋過的LA和ALA處理細(xì)胞，使其終濃度為20和40 μmol/L，并設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)至第3天，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次。以1% Triton X-100的裂解液處理細(xì)胞30 min。分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、蒸餾水各20 μL和工作液200 μL，混勻。37 ℃孵育5 min，546 nm處測定各孔吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，不同處理之間采用Ducan’s多重比較，P<0.05具有顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 ADSCs多向誘導(dǎo)分化

ADSCs體外培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察已有細(xì)胞貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，細(xì)胞單層分布均勻，多呈纖維狀和不規(guī)則多角形，傳代后細(xì)胞增殖迅速，呈旋渦狀生長。

利用化學(xué)誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)ADSCs向脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞方向分化，以證明其多向分化潛能。成脂誘導(dǎo)至14 d時(shí)進(jìn)行油紅O染色，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由長梭形變?yōu)楸鈭A形。細(xì)胞體積增大，油紅O染色發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)大量脂滴形成。

在成骨細(xì)胞分化過程中，堿性磷酸酶可以作為一種特異性標(biāo)志蛋白。如圖2所示，成骨誘導(dǎo)至14 d 時(shí)進(jìn)行堿性磷酸酶染色后，可以觀察到細(xì)胞形態(tài)的明顯改變，細(xì)胞內(nèi)累積了較多黑色顆粒狀沉淀。

圖2 ADSCs的骨脂分化Fig.2 Osteogenic differentiation of ADSCs

2.2 亞油酸和α-亞麻酸對(duì)ADSCs細(xì)胞活力的影響

利用MTT法檢測LA和ALA對(duì)ADSCs細(xì)胞活力的影響，用酶標(biāo)儀在490 nm處測吸光度。MTT在活細(xì)胞中能被還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，DMSO能夠?qū)⒔Y(jié)晶溶解。在一定范圍內(nèi)，結(jié)晶生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，可間接反映細(xì)胞活力的大小。如圖3所示，與對(duì)照組相比，ALA能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞活力，但在較高濃度(60 μmol/L)體現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用，而LA能夠顯著抑制ADSCs細(xì)胞活力。

圖3 不同濃度LA和ALA對(duì)ADSCs細(xì)胞 活力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of LA and ALA on cell viability of ADSCs

2.3 亞油酸和α-亞麻酸對(duì)ADSCs成脂分化的影響

利用油紅O染色法檢測LA和ALA在ADSCs 成脂分化過程中對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成和積累的影響，如圖4所示。圖4(a)中，與對(duì)照組相比，LA能夠明顯促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的成脂分化，隨著LA濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)脂滴的大小和數(shù)量均呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)；圖4(b)中，ALA組脂滴的數(shù)量和大小也有所增加，但與LA相比，ALA對(duì)ADSCs成脂分化的促進(jìn)相對(duì)較弱。

進(jìn)一步檢測細(xì)胞內(nèi)TG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。如圖5所示，與油紅染色結(jié)果相一致，LA和ALA處理組細(xì)胞內(nèi)TG質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所增加，但LA處理組細(xì)胞內(nèi)TG質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，而ALA處理組細(xì)胞內(nèi)TG質(zhì)量分?jǐn)?shù)則不隨ALA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而變化。

圖4 不同濃度的LA和ALA對(duì)ADSCsc成脂分化的影響Fig.4 Effects of different concentrations of LA and ALA on adipogenic differentiation in ADSCs

圖5 不同濃度的LA和ALA對(duì)ADSCs細(xì)胞內(nèi)TG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

Fig.5 Effects of LA and ALA on TG content in ADSCs

研究表明，飲食攝入脂肪酸的種類與肥胖等疾病的發(fā)生具有一定的相關(guān)性。但是，多不飽和脂肪酸對(duì)脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響及其對(duì)脂肪細(xì)胞分化的作用尚不明確。

已有學(xué)者研究表明，部分脂肪酸對(duì)成脂分化的影響存在差異。在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化過程中，花生四烯酸促進(jìn)其成脂分化的作用明顯強(qiáng)于二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸[13]。在對(duì)前脂肪細(xì)胞3T3-L1成脂分化的研究中發(fā)現(xiàn)，與二十碳五烯酸相比，硬脂酸和油酸作用更強(qiáng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與ALA相比，LA對(duì)ADSCs成脂分化的促進(jìn)作用更強(qiáng)，提示不同脂肪酸對(duì)脂肪干細(xì)胞成脂分化的影響可能存在差異，這可能與脂肪酸的飽和程度和雙鍵位置的不同有關(guān)。

此外，某些信號(hào)通路也可能參與調(diào)控多不飽和脂肪酸對(duì)成脂分化的影響。作為成脂分化關(guān)鍵的調(diào)控因子，C/EBPα和PPARγ能夠共同誘導(dǎo)成脂分化過程中脂滴的生成和脂肪相關(guān)蛋白如FAS、脂蛋白酯酶等的表達(dá)[15-16]。Wnt、Hedgenhog、Notch和TGF-β等信號(hào)通路也參與調(diào)控成脂分化過程[17-19]。因此，脂肪酸在體內(nèi)模型或在體外影響成脂分化的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和闡明。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了LA和ALA對(duì)ADSCs細(xì)胞活力和成脂分化的影響，發(fā)現(xiàn)LA能夠抑制ADSCs細(xì)胞活力，而ALA在較低濃度(60 μmol/L)下能夠增強(qiáng)ADSCs細(xì)胞活力，較高濃度下抑制ADSCs 細(xì)胞活力；與ALA相比，LA對(duì)ADSCs成脂分化的促進(jìn)作用更強(qiáng)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

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Effectoflinoleicacidandalpha-linolenicacidoncellviabilityandadipogenicdifferentiationinadiposetissue-derivedstromalcells

LIANG Yuan1, ZHAO Xinyi2, ZHANG Jingwei1, JIAN Luyang1,LIANG Shuai1, WANG Han2, WANG Jihui2

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

TS201.4

A

1674-1404(2017)05-0323-05

2016-03-07.

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371764，31370554)；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014026016).

梁 媛(1991-)，女，碩士研究生；通信作者：王 晗(1972-)，女，副教授.

梁媛,趙馨怡,張靖偉,簡路洋,梁帥,王晗,王際輝.亞油酸和α-亞麻酸對(duì)脂肪干細(xì)胞活力及成脂分化的影響[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(5):323-327.

LIANG Yuan, ZHAO Xinyi, ZHANG Jingwei, JIAN Luyang, LIANG Shuai, WANG Han, WANG Jihui. Effect of linoleic acid and alpha-linolenic acid on cell viability and adipogenic differentiation in adipose tissue-derived stromal cells[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(5): 323-327.