肖永華*， 李靜娜， 何振宇， 黃常剛， 梁高道

(武漢市疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430022)

鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是一種鄰苯二甲酸酯類化合物，其作為增塑劑主要應(yīng)用于PVC產(chǎn)品、塑溶膠、聚乙烯地板、食品包裝以及PVC材質(zhì)的醫(yī)療器材中[1]。DEHP在體內(nèi)水解產(chǎn)物為鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHP)，而MEHP可被進(jìn)一步被代謝轉(zhuǎn)化為5HO-MEHP、5OXO-MEHP等含脂肪側(cè)鏈的氧化物[2]。DEHP經(jīng)口攝入進(jìn)入腸道后，多數(shù)DEHP能在24 h內(nèi)完全代謝，僅有低于10%的原藥隨著尿液排出，其余均轉(zhuǎn)化為代謝物后隨著尿液、糞便等排出[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示， DEHP 暴露顯著抑制了青春期雌、雄仔鼠的活動(dòng)性，并且顯示出性別特異性[4]；DEHP及其代謝物具有生殖毒性，能導(dǎo)致雄性大鼠睪丸損傷并誘發(fā)睪丸間質(zhì)細(xì)胞腫瘤[5]。

目前對人體內(nèi)DEHP及其代謝物的研究相對較少，所采集的人群生物樣本主要是尿液[6 - 7]，對DEHP代謝物的檢測手段主要包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]、液相色譜法等[10 - 11]。本文在前期他人研究的基礎(chǔ)之上，選擇更能代表人群內(nèi)暴露的血清樣品作為監(jiān)測對象，采用超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法檢測DEHP代謝物。該方法快速，定性定量能力強(qiáng)，能保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

UPLC-TQD超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Waters公司)，配備電噴霧離子源(ESI)以及Masslynx4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；AL204電子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：鄰苯二甲酸單乙基己基酯(MEHP)、單(2-乙基-5-羥基己基)鄰苯二甲酸酯(5HO-MEHP)、單(2-乙基-5-氧己基)鄰苯二甲酸酯(5OXO-MEHP)、以及內(nèi)標(biāo)：13C4鄰苯二甲酸單乙基己基酯(13C4MEHP)，均購自美國AccuStandard公司。β-葡萄糖醛苷酶(美國Sigma公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國天地公司)；乙酸鈉、氫氧化鈉、乙酸銨(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；高氯酸(優(yōu)級純，天津市東方化工廠)；氨水(分析純，開封東大化工有限公司試劑廠)；MAX固相萃取小柱(200 mg/6mL，美國Waters公司)。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水機(jī)(MILLIPORE公司)制備。

1.2 樣品處理

稱取1.00 g血清樣品于15 mL離心管中，加入5.0 mL濃度為0.2 mol/L的乙酸鈉溶液以及100 μL 100 ng/mL的13C4MEHP內(nèi)標(biāo)工作液，充分混勻，再加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶，混勻后于37 ℃酶解提取12 h。將提取液恢復(fù)至室溫后在提取液中加入200 μL高氯酸，充分渦旋后再用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至沉淀消失。

將MAX固相萃取小柱分別用5 mL甲醇和5 mL純水活化后，將提取液過柱，用水將MAX小柱淋洗至中性后再用5 mL甲醇淋洗，最后用5 mL 5%甲酸甲醇洗脫小柱，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笥?00 μL純水復(fù)溶，高速離心后用超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC?HSS T3柱(100×2.1 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相：5 mmol/L乙酸銨溶液(A)，甲醇(B)。梯度洗脫程序：0～2.1 min，70%A；2.1～3.0 min，70%～20%A；3.0～5.0 min，20%A；5.0～6.1 min，20%～70%A。流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：-2.3 kV；脫溶劑氣溫度：350 ℃；離子源溫度：120 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。采用質(zhì)譜直接進(jìn)樣的方式優(yōu)化MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP以及13C4MEHP質(zhì)譜采集參數(shù)， MRM采集參數(shù)詳見表1。

表1 MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP以及13C4MEHP的MRM參數(shù)Table 1 The MRM parameters for MEHP,5HO-MEHP,5OXO-MEHP and 13C4MEHP

*quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法

樣品處理時(shí)所采用較多的分別為酶解[8]、乙腈沉淀蛋白等方法進(jìn)行提取。采用乙腈沉淀蛋白后高速離心，將上清液直接進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)幾種代謝物的回收率均較低，由此可推斷在進(jìn)行蛋白沉淀時(shí)，DEHP代謝物被沉淀所吸附；同時(shí)在采取酶解法提取DEHP代謝物時(shí)，當(dāng)血清樣品被酶解過夜，加入高氯酸沉淀蛋白后，離心取上清液過MAX小柱凈化，也發(fā)現(xiàn)幾種代謝物的回收率均較低，尤其是作為內(nèi)標(biāo)的13C4MEHP 幾乎全部損失。通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用酶解法提取目標(biāo)物時(shí)，用高氯酸沉淀蛋白后再用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至沉淀消失，這時(shí)提取液的pH值呈堿性，代謝物在乙酸鈉溶液中以離子狀態(tài)存在，將提取液過MAX小柱時(shí)，代謝物都會(huì)被吸附在小柱之上，先用水將小柱淋洗至中性后再加入3 mL 甲醇淋洗，最后用3mL 5%甲酸甲醇洗脫，最終的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEHP等幾種代謝物的回收率達(dá)到了89.6%～103.2%。同時(shí)，也將酶解提取液不沉淀蛋白直接過MAX小柱，結(jié)果存在提取液過小柱困難的情況最終也導(dǎo)致絕對回收率偏低，因而最終選擇將酶解液用高氯酸沉淀蛋白再將10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至沉淀消失這一種處理方法來處理血清樣品。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分別對色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，其優(yōu)化后的條件見1.3節(jié)。MRM色譜圖詳見圖1和圖2。

圖1 MEHP、13C4MEHP、5HO-MEHP和5OXO-MEHP的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of MEHP，13C4MEHP,5HO-MEHP and 5OXO-MEHP

圖2 血清加標(biāo)樣品MEHP、13C4MEHP、5HO-MEHP和5OXO-MEHP的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms ofserum spiked with MEHP，13C4MEHP,5HO-MEHP and 5OXO-MEHP

2.3 線性范圍、回收率、精密度及檢出限

MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP在1.00～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.995以上。在血清樣品中添加濃度為100 μg/kg的MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP混合標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)標(biāo)13C4MEHP的添加濃度均為10 μg/kg，分別做6個(gè)加標(biāo)平行樣和2個(gè)血清本底，平均回收率為89.6%～103.2%?；厥赵囼?yàn)結(jié)果見表2。通過逐級稀釋法來確立本方法的檢出限，當(dāng)進(jìn)樣濃度為0.1 μg/L的MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP時(shí)，信噪比均大于3，經(jīng)回收率校正后，選擇0.1 μg/kg作為本方法MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP的檢出限。

表2 MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及回收率(n=6)Table 2 Linear ranges,regression equation,correlation coefficients,recoveries and RSDs of MEHP,5HO-MEHP,and 5OXO-MEHP(n=6)

3 結(jié)論

人群在日常的工作和生活中很容易暴露于鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)，而DEHP及其代謝物對人群健康的影響也需引起更多人的重視。本文采用固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人體血清中鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)代謝物，方法靈敏度高，定性能力強(qiáng)，能為人群的DEHP內(nèi)暴露情況提供重要的技術(shù)支持。