王祎杰, 王曉英

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210009)

1 引言

p16基因又稱MTS1(Multiple Tumor Suppressor 1)基因、p16INK4(細(xì)胞周期依賴性激酶CDK4抑制劑)，是美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室Kamb等[1]于1994年發(fā)現(xiàn)的新抗癌基因，位于9p21，其全長8.5 kb，由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子(126bp、307bp、11bp)間隔組成[2]。編碼蛋白質(zhì)是分子量約為16 kDa的單鏈多肽，故稱其為p16基因。

p16基因的表達(dá)產(chǎn)物(p16蛋白)可抑制CDK4(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶)介導(dǎo)的Rb蛋白磷酸化，其與cyclinD1競爭結(jié)合CDK4，致使CDK4正向作用和Rb蛋白磷酸化過程受阻，具活性的Rb蛋白可抑制DNA合成所必需的轉(zhuǎn)錄因子等酶的表達(dá)[3]。當(dāng)p16基因失活時(shí)，cyclinD1過表達(dá)結(jié)合CDK4，使Rb蛋白磷酸化，導(dǎo)致其與轉(zhuǎn)錄因子(E2F)解離[4]，處于游離態(tài)的E2F激活一系列可促使細(xì)胞進(jìn)入S期并進(jìn)行DNA復(fù)制的蛋白表達(dá)，進(jìn)而促使細(xì)胞增殖[5]。

研究顯示，p16基因已在肺癌[6]、乳腺癌[7]、皮膚癌[8]、胃癌[9 - 10]、腎癌[2,11]、卵巢癌[12 - 13]、咽喉癌[14]、淋巴瘤[15]及黑色素瘤[16]等中發(fā)現(xiàn)純合子缺失，無義、錯(cuò)義及移碼突變，表明p16基因以缺失、突變的方式廣泛參與腫瘤的形成。檢測p16基因有無改變，對判斷患者腫瘤的易感性及預(yù)測腫瘤的預(yù)后具有十分重要的臨床意義。本文主要對近年來p16基因相關(guān)檢測技術(shù)的原理、方法及進(jìn)展作一簡要綜述。

2 傳統(tǒng)檢測技術(shù)的應(yīng)用

在過去的幾十年里，p16基因已逐漸成為遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的DNA檢測方法包括突變檢測(直接法和間接法)及甲基化檢測。

2.1 基因突變檢測

2.1.1直接法直接法即應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，根據(jù)遺傳病的致病基因類型直接對其進(jìn)行突變檢測，以確定受診者是否攜帶致病基因，進(jìn)而確定是否患病，常見方法有DNA直接測序法(Direct Sequencing，DS)[17]、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction-restricted Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)[18]、變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)[19]、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-stranded Conformation Polymorphism，SSCP)[20]等。上述幾種突變檢測方法的比較見表1。

表1 p16基因突變傳統(tǒng)檢測方法比較Table 1 Traditional methods for detection of p16 gene mutation

2.1.2間接法間接法即根據(jù)p16蛋白(在多種腫瘤組織中呈過度表達(dá))間接判斷p16基因是否存在點(diǎn)突變，通過應(yīng)用特異性抗體與其產(chǎn)物蛋白結(jié)合產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，常見方法有免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry，IHC)[21,22]、酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)[23]、半導(dǎo)體(Semiconductor)技術(shù)[24]等。由于在不同切片組織中，抗原修復(fù)、抗體濃度、培育溫度及時(shí)間等的不同，造成不同批次的結(jié)果存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致假陽性和假陰性錯(cuò)誤的發(fā)生。

2.2 DNA甲基化檢測

腫瘤組織中常出現(xiàn)甲基化異常的現(xiàn)象，主要是基因組普遍低甲基化(如癌基因)和局部區(qū)域高甲基化(如抑癌基因)，異常甲基化(高或低)會(huì)影響細(xì)胞分裂的生理穩(wěn)定性[25 - 27]。常見的甲基化檢測方法有甲基化敏感的單核苷酸擴(kuò)增(Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension，MS -SNuPE)[28]、變性高效液相色譜(Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC)[29]、甲基化特異性PCR(MS -PCR)[30 - 31]等。上述幾種甲基化檢測方法的比較見表2。

表2 DNA甲基化常見檢測方法比較Table 2 Comparison of common test methods of DNA methylation

3 生物傳感技術(shù)的應(yīng)用

生物傳感技術(shù)是一種對生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為光電信號進(jìn)行檢測的高新技術(shù)，是由固定化的生物敏感材料作識別元件(酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì))、適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器(氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等)及信號放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。目前，根據(jù)理化換能器的不同，常見的抗癌基因p16生物傳感器主要有光學(xué)、壓電和電化學(xué)等類型。

3.1 光學(xué)生物傳感技術(shù)

3.1.1熒光共振能量轉(zhuǎn)移Feng等[32]利用陽離子共軛聚合物(Cationic Conjugated Polymer，CCP)建立熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)的方法檢測p16基因甲基化。該方法效率高，操作過程可避免引物標(biāo)記、分離純化的需要，成本低。但高靈敏的FRET生物傳感器設(shè)計(jì)困難，存在背景噪音需校正。

3.1.2表面等離子體共振表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是將一種具有特異識別能力的分子即配體固定于金屬膜表面，監(jiān)控溶液中被分析物與配體的結(jié)合，檢測復(fù)合物形成或解離過程中金屬膜表面溶液的折射率變化。Nand等[33]應(yīng)用SPR結(jié)合原位蛋白微陣列技術(shù)對CDK4-p16進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的研究。該方法簡單快速、成本低，但其靈敏度有限，測量范圍與物質(zhì)的分子量有關(guān)。

3.2 壓電生物傳感技術(shù)

壓電免疫傳感器是由壓電晶體及其表面固定化的抗原或抗體構(gòu)成，是在兩交互的生物分子間發(fā)生生物特異性反應(yīng)，并產(chǎn)生微小質(zhì)量變化或頻率改變。Yang等[34]將晶體固定在Au電極間，構(gòu)建壓電免疫傳感器快速檢測p16基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)取不同宮頸細(xì)胞的上清液并檢測不同濃度的p16INK4a，檢測的范圍為50～1 200 ng/mL，檢測限為10 ng/mL，分析時(shí)間小于30 min。此方法耗時(shí)短、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好(4 ℃,8周)、特異性高，但蛋白A經(jīng)PBS洗去殘余后易引起其失活，影響抗體的固定效果。

3.3 電化學(xué)生物傳感技術(shù)

3.3.1基于共價(jià)鍵固定法的非標(biāo)定型電化學(xué)檢測Ge等[35]運(yùn)用非標(biāo)定型伏安法經(jīng)戊二醛(GA)共價(jià)偶聯(lián)2-氨基乙硫醇(AET)修飾Au電極檢測p16基因。在電位控制下通過形成席夫堿，使氨基修飾的DNA探針成功組裝在GA耦合表面，然后將DNA探針與目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，共價(jià)鍵合法固定DNA探針較穩(wěn)定、耐用、特異性高，且對雜交反應(yīng)中無標(biāo)記的單堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA的電化學(xué)檢測具高靈敏性。

3.3.2基于雙重信號協(xié)同放大電化學(xué)免疫傳感器Duangkaew等[36]應(yīng)用雙位點(diǎn)夾心法構(gòu)建三明治結(jié)構(gòu)，將碳納米管(CNT)摻雜殼聚糖(Chitosan)結(jié)合戊二醛(GD，25%水溶液)修飾絲網(wǎng)印刷電極(SPCE)構(gòu)建生物傳感界面，捕捉抗體(Ab1)與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-p16(GST-p16)重組蛋白、金納米粒子(Au NPs，粒徑15 nm)標(biāo)記捕獲抗體(Ab2)反應(yīng)，經(jīng)Au、Ag依次沉積實(shí)現(xiàn)雙重信號放大。其線性范圍為15.6～250 ng/mL，檢測限為1.3 ng/mL。該方法與Yang等[34]利用壓電免疫傳感器檢測p16相比，靈敏度提高了近8倍。

3.3.3電化學(xué)傳感與PCR聯(lián)用由于腫瘤組織、血樣等實(shí)際生物樣本基底組成復(fù)雜，直接檢測干擾嚴(yán)重，若進(jìn)行DNA抽提，一般堿基序列較長，常采用人工合成片段，且有時(shí)會(huì)結(jié)合PCR效果更好。Hou等[37]運(yùn)用合成的寡合苷酸修飾Au電極構(gòu)建DNA生物傳感器，將AET固定于電極表面，可占據(jù)未被DNA分子作用的位點(diǎn)，避免堿基與Au電極的非特異性作用，結(jié)合linker-PCR對人類胃癌組織及健康人血細(xì)胞p16INK4a基因5′-CpG島甲基化狀態(tài)進(jìn)行成功測定。Xu等[38]將橫流核酸生物傳感器(Lateral Flow Nucleic Acid Biosensor，LFNAB)與比例競爭性定量PCR(Proportion Competitive Quantitative PCR，PCQ-PCR)結(jié)合對小鼠血漿中的p16基因多甲基化位點(diǎn)進(jìn)行測定，甲基化水平的回收率均在94%以上。

電化學(xué)生物傳感技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中效果較好，但傳感器的靈敏度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性仍有待提高。可利用PCR擴(kuò)增，篩選高靈敏高選擇性的復(fù)合型雜交指示劑，選用雙或三嵌合劑代替單嵌合劑，結(jié)合納米材料(金、銀膠，量子點(diǎn)等)放大信號，優(yōu)化電極表面結(jié)構(gòu)提高靈敏度。DNA雜交過程選擇最佳溫度(不完全匹配的DNA鏈高溫下難穩(wěn)定存在)來提高選擇性?？稍跓o雜交指示劑或標(biāo)記物下，根據(jù)雜交后DNA分子中鳥嘌呤電化學(xué)信號的變化或因雜交造成傳感界面狀態(tài)改變而引起某些電化學(xué)參數(shù)的變化對DNA直接檢測以簡化操作。幾種重要的p16生物傳感技術(shù)的分析性能的比較見表3。

表3 不同p16檢測技術(shù)的分析性能比較Table 3 Comparision for analytical performance of multiple detection technologies of p16 gene

(續(xù)表3)

MethodsCharacteristicDetection limitDetection timeSimple levelReferenceElectrochemical immunosensor Construction of sandwich structure with covalent bond,dual signal amplifica-tion by Au and Ag deposi-tion,high selectivity(2-fold)1.3 ng/mLMinutesSimple operation,con-struction of sensor plat-form with short time,detect real samples rap-idly and sensitively[36]

4 p16基因檢測技術(shù)的展望

目前有關(guān)p16基因的檢測方法越來越多，但各種方法均存在優(yōu)缺點(diǎn)。但從整體看，電化學(xué)生物傳感技術(shù)這個(gè)新領(lǐng)域在p16基因檢測方面的應(yīng)用有著較為廣闊的前景。就現(xiàn)有研究而言，需進(jìn)一步了解p16與多種腫瘤的相關(guān)性，研究它及其表達(dá)產(chǎn)物與生物活性物質(zhì)結(jié)合后在早期診斷、療效評估、鑒別診斷及預(yù)后判斷等方面的協(xié)同關(guān)系。在完善自身檢測技術(shù)的同時(shí)，結(jié)合其它技術(shù)如光學(xué)、電學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等，實(shí)現(xiàn)各技術(shù)間的優(yōu)勢互補(bǔ)。隨著研究工作的深入，p16基因診斷和治療有望成為一種應(yīng)用前景良好的腫瘤診斷和治療方法。