劉彩麗， 王穎瑛

(安陽(yáng)市婦幼保健院檢驗(yàn)科， 河南 安陽(yáng) 455000)

TNF-α/NF-κB信號(hào)通路在依那西普緩解大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用*

劉彩麗， 王穎瑛△

(安陽(yáng)市婦幼保健院檢驗(yàn)科， 河南 安陽(yáng) 455000)

目的探討依那西普(ETN)對(duì)膠原誘導(dǎo)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(CIA)的緩解作用及其機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組(n=10)：①對(duì)照組；②生理鹽水治療組(NS組)；③(0.5 mg/kg)依那西普治療組(ETN組)。其中②和③組的鼠在炎癥分值達(dá)到兩分及以上時(shí)隨機(jī)分組開(kāi)始治療。藥物采用皮下注射牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)Wistar大鼠建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型。治療前和治療期間每周測(cè)量足趾容積和體重，治療4周后處死，ELISA檢測(cè)血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平；取足趾部位肌肉提取胞漿和胞核蛋白，Western blot檢測(cè)NF-κB含量及其亞細(xì)胞定位。結(jié)果依那西普治療組較之生理鹽水治療組能顯著緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥癥狀、降低TNFα以及下游炎癥因子水平(P<0.05)；能抑制炎癥狀況下NF-κB的核內(nèi)定位增加、胞漿定位減少的狀況。結(jié)論依那西普可通過(guò)抑制TNFα/NF-κB信號(hào)通路緩解大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

依那西普；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；TNFα/NF-κB信號(hào)通路；大鼠

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作為一種自身免疫病，其發(fā)病率及致殘率均較高，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其發(fā)病機(jī)制及治療的研究均取得了較大的進(jìn)展，目前認(rèn)為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α, TNF-α)直接參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)軟骨的炎癥及破壞，NF-κB是RA進(jìn)展中滑膜炎癥的重要炎性細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，依那西普(etanercept，ETN)作為TNFα拮抗劑，通過(guò)阻止TNFα與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，減少組織的損傷，以干擾炎癥的發(fā)生并緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病，已廣泛應(yīng)用于臨床。本文通過(guò)膠原誘導(dǎo)建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠模型，研究ETN對(duì)TNF-α/NF-κB信號(hào)通路的影響，以期對(duì)ETN緩解炎癥的作用機(jī)制有進(jìn)一步的了解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

6～7周齡雄性Wistar大鼠，由北京維通利華公司提供，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001，體重(170 g±10 g)。飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)動(dòng)物房，自由飲水進(jìn)食，室溫24℃±2℃。藥物：依那西普(Etanercept，恩利)，批號(hào)S20130019，由輝瑞制藥有限公司提供。試劑：牛Ⅱ型膠原蛋白，Chondrex公司；弗氏完全佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)，美國(guó)Sigma公司；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)胞漿和胞核蛋白提取試劑盒(AR0106)，博士德公司；大鼠血管生成素Ang-1 ELISA檢測(cè)試劑盒(XY-7338)，eBioscience公司；NF-κB一抗(ab7971, 1:400)、β-actin一抗(ab6276, 1∶10 000)，Abcam公司；TATA-binding protein (TBP)一抗(#12578, 1∶1 000)，Cell signaling公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(SA00001-2, 1∶5 000)，Proteintech公司，聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，Millipore公司。

1.2 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型建立

將用0.1 mol/L冰醋酸溶解的牛Ⅱ型膠原蛋白與等體積的CFA充分乳化，配成終濃度為0.5 g/L的Ⅱ型膠原乳劑。大鼠用水合氯醛(用量0.3 ml/100 g)麻醉后，模型組于大鼠背部及鼠尾根部多點(diǎn)皮下注射配制好的Ⅱ型膠原溶液，總量為1 ml，1周后按上述方法、相同劑量再進(jìn)行1次，對(duì)照組注射等體積生理鹽水。第15天開(kāi)始，大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，發(fā)病時(shí)間在15～20 d內(nèi)，第21天統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，選取類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎指數(shù)≥2分的大鼠20只，與注射生理鹽水的對(duì)照組大鼠10只同時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 動(dòng)物分組與處理方法

將建模時(shí)注射生理鹽水的對(duì)照組大鼠標(biāo)記為正常對(duì)照組；將建模成功的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠隨機(jī)分為兩組(n=10)：生理鹽水治療組(NS組)和依那西普治療組(ETN組)。NS組大鼠每天注射等體積生理鹽水；給予ETN組大鼠每天尾靜脈注射依那西普0.5 mg/kg，治療4周后處死。

1.4 觀察與檢測(cè)指標(biāo)

(1)一般觀察：觀察大鼠體毛的色澤、活動(dòng)狀態(tài)、排便及食量的變化情況并每周測(cè)定大鼠體重。(2)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎指數(shù)：根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹、顏色及關(guān)節(jié)活動(dòng)情況記錄并評(píng)價(jià)大鼠全身關(guān)節(jié)病變程度，每3 d評(píng)定1次，共評(píng)定7次。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)紅腫；1分，小趾關(guān)節(jié)稍腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足爪腫脹，4只肢體的病變程度累積積分為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎指數(shù)，最高為16分。21 d后根據(jù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分≥2分選取造模成功鼠20只。(3)足趾容積的測(cè)定：根據(jù)排水法原理，用自制的關(guān)節(jié)容積測(cè)量器測(cè)量大鼠左后足雙踝連線以下全足容積，從治療開(kāi)始，記為第0周，每周測(cè)量1次，共5次。(4)血清炎癥因子檢測(cè)：治療4周，眼內(nèi)眥靜脈叢取血2 ml，4 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，依照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清TNF-α、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8含量。(5)免疫印跡法(Western blot)測(cè)定足趾部位蛋白NF-κB的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位以及半定量分析，核蛋白以TBP為內(nèi)參，胞漿蛋白以β-actin為內(nèi)參。收取足趾部位肌肉樣本，根據(jù)柏世德亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)胞漿和胞核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書，提取胞漿蛋白和核蛋白。30 mg/孔的上樣量，12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。20 mA 1 h將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠的體重比較

生理鹽水治療組大鼠體重在治療第0、1、2、3、4周明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)；依那西普治療組大鼠體重在治療第4周明顯高于生理鹽水治療組(P<0.05，表1)。

2.2 三組大鼠足趾容積比較

生理鹽水治療組大鼠足趾容積在治療第0、1、2、3、4周明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；依那西普治療組大鼠足趾容積在治療第2、3、4周明顯低于治療生理鹽水治療組(P<0.05, 表2)。

2.3 三組大鼠血清炎癥因子水平的比較

治療4周后，生理鹽水治療組大鼠血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平顯著高于正常對(duì)照組 (P<0.05)；依那西普治療組大鼠血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平顯著低于生理鹽水治療組(P<0.05, 表3)。

Tab. 1 The body weight of different groups during CIA treatment (g， ±s, n=10)

CIA: Collagen induced arthritis; NS: Normal saline treatment group; ETN: Etanercept treatment group

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsNS group

Tab. 2 The tone volume of different groups during CIA treatment(g， ±s, n=10)

CIA: Collagen induced arthritis; NS: Normal saline treatment group; ETN: Etanercept treatment group

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsNS-treated CIA group

Tab. 3 The serum levels of TNF-α, Ang-1, IL-1β, IL-6 and IL-8 tested by ELISA (pg/ml，±s, n=10)

TNF-α: Tumor necrosis factor α; Ang-1: Angiopoietin-1; IL-1β: Interleukin 1 beta; IL-6: Interleukin 6; IL-8: Interleukin 8

*P<0.05vsnormal control group；#P<0.05vsNS-treated CIA group

2.4三組大鼠足趾部位NF-κB蛋白表達(dá)和定位的比較

外源物種膠原蛋白刺激產(chǎn)生的CIA狀態(tài)下，鼠足趾組織內(nèi)NF-κB p105/p50在核內(nèi)的定位異常增高(P<0.05，圖1)，胞漿定位顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)，治療4周后，治療2組NF-κB p105/p50的異常定位顯著低于治療1組(P<0.05)，核內(nèi)定位的顯著降低(P<0.05)，而胞漿定位顯著增加(P<0.05)。

Fig.1Western blot of NF-κB 1: Control group; 2: NS group; 3： ETN group； NF-κB: Nuclear factor-kappa B; TBP: TATA-binding protein

3 討論

TNF-α在炎癥反應(yīng)中起重要作用，可活化炎癥細(xì)胞，促其分泌趨化因子和黏附分子，是炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵一環(huán)。TNF-α是一種具有多種生物活性的促炎因子。在生理情況下，腸道細(xì)胞自身分泌的和腸道黏膜淋巴細(xì)胞分泌的TNF-α作用于臨近的腸道細(xì)胞，組成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞的增殖和凋亡，對(duì)維持腸道屏障起重要作用；在病理情況下，腸道黏膜中多種炎性細(xì)胞均可大量分泌TNF-α，在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病中具有重要作用。TNF-α的表達(dá)主要受NF-κB調(diào)控，后者為一類核內(nèi)的炎性轉(zhuǎn)錄因子家族，精密地調(diào)控著炎性反應(yīng)和凋亡信號(hào)。黃循銣等[1]采用葡聚糖硫酸鈉定量灌胃誘發(fā)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，測(cè)定小鼠結(jié)腸通透性，并初步探討其與炎癥因子TNF-α和NF-κB p65的關(guān)系。Matsuno等[2]通過(guò)動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)TNF-α在RA滑膜炎的發(fā)生中起關(guān)鍵作用,TNF-α可激活多形核細(xì)胞，刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素，并且通過(guò)刺激成骨細(xì)胞釋放Ca2+，抑制堿磷酶和膠原合成造成骨和軟骨破壞。NF-κB信號(hào)通路是聯(lián)系細(xì)胞因子、炎癥反應(yīng)的橋梁,多種炎癥相關(guān)疾病與NF-κB 信號(hào)通路的過(guò)度激活有關(guān),如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎/干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[3、4]。靜息狀態(tài)下, NF-κB 與其抑制蛋白IκB(inhiborkbinding，IκB)以非活性的形式存在于胞漿中,當(dāng)細(xì)胞受到炎性因子如TNF-α刺激時(shí), IκB激酶復(fù)合物 IKKs被激活,使IκB經(jīng)快速磷酸化、泛素化后降解，暴露出NF-κB的 DNA 結(jié)合域，NF-κB發(fā)生核移位并與相應(yīng)靶基因上特定κB序列結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，發(fā)揮其相關(guān)功能[5、6]，本研究發(fā)現(xiàn)CIA大鼠血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平顯著高于正常對(duì)照組，NF-κB也呈現(xiàn)大量活化，并且表現(xiàn)出明顯的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥，進(jìn)一步證實(shí)TNF-α在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)過(guò)度表達(dá)，并激活NF-κB信號(hào)通路，參與RA疾病的發(fā)生。依那西普是二聚體融合蛋白，包含可溶性75 kD的腫瘤壞死因子受體Ⅱ(p75-TNFR或TNFR Ⅱ)的細(xì)胞外配體結(jié)合部分，以及人免疫球蛋白IgG的Fc部分，應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療方面已獲得廣泛地使用和認(rèn)可[7]，本研究通過(guò)觀察，證實(shí)依那西普治療CIA 4周后，血清炎癥因子水平較生理鹽水治療組有顯著下降；通過(guò)對(duì)模型鼠的組織樣本進(jìn)行免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，依那西普顯著改變了TNF-α下游信號(hào)分子NF-κB的亞細(xì)胞定位。本文通過(guò)NF-κB p105/p50抗體檢測(cè)胞漿和胞核中NF-κB的含量，反映其活性。本研究證實(shí)，依那西普特異拮抗TNF-α后，NF-κB p105/p50在核內(nèi)的定位顯著低于生理鹽水治療CIA組，緩解了CIA模型鼠由于外物種膠原蛋白刺激產(chǎn)生的NF-κB p105/p50核內(nèi)定位的異常增加，而胞漿蛋白的數(shù)據(jù)與此呼應(yīng)，CIA模型鼠體內(nèi)，NF-κB p105/p50胞漿內(nèi)含量顯著低于正常對(duì)照組，依那西普處理4周后，NF-κB p105/p50胞漿含量顯著升高。結(jié)合血清ELISA檢測(cè)結(jié)果，可以初步認(rèn)識(shí)到，依那西普通過(guò)拮抗TNF-α，降低NF-κB活性，進(jìn)一步阻止下游Ang-1、IL-1β、IL-6和IL-8等炎癥因子的釋放，緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)展。

綜上所述，本研究證實(shí)依那西普通過(guò)抑制TNFα/NF-κB信號(hào)通路緩解大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，近年來(lái)，對(duì)依那西普的應(yīng)用范圍、機(jī)制的問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者[8-12]都進(jìn)行了廣泛研究。在個(gè)性化治療和聯(lián)合用藥[13]的趨勢(shì)下，本文從依那西普治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制為研究點(diǎn)，為臨床聯(lián)合用藥提供有價(jià)值的參考。

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EffectsofTNF-alpha/NF-kappaBsignalingpathwayonetanerceptalleviatingrheumatoidarthritis

LIU Cai-li, WANG Ying-ying△

(Department of Clinical Laboratory the Maternal and Child Health Hospital of Anyang City, Anyang 455000, China)

Objective: To investigate the effects of etanercept on collagen induced arthritis rats.MethodsThe rheumatoid arthritis model was establishedviasubcutaneous injection of bovine type Ⅱ collagen, and the effects of etanercept was compared through three groups: ①the normal control；②arthritis model treated with saline；③arthritis model treated with etanercept (0.5 mg/kg, intraperitoneal injection) with 10 rats in each group；group②and group③ were selected by arthritis index (≥2)and grouped randomly. The body weight and toe volume were measured at just before and during treatment weekly. Rats were sacrificed after 4 weeks of treatment, and the serum levels of tumor necrosis factor α(TNF-α), angiopoietin-1(Ang-1), IL-1β, IL-6 and IL-8 were tested by ELISA. Nuclear factor-kappa B(NF-κB) levels and subcellular locations in toe muscles were test by Western blot.ResultsEtanercept significantly relieved inflammation of rheumatoid arthritis, lowered the TNF-α and relative inflammatory factors levels compared with saline treatment (P<0.05). The results of Western blot showed that etanercept significantly suppressed the nuclear location of NF-κB p105/p50 caused by inflammation.ConclusionThe anti-inflammatation effect of etanercept may be related to its activity in inhibiting the activation of TNF-α/NF-κB pathway.

etanercept; rheumatoid arthritis; TNF-α/NF-κB pathway; rats

R593.22

A

1000-6834(2017)04-373-04

2017-02-23

2017-06-05

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Tel: 13569067892; E-mail： 10485536@qq.com

10.12047/j.cjap.5569.2017.090