李長明,謝尚舉,全仁夫,王拓,杜偉斌,楊宗保

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芒針對促進大鼠急性脊髓損傷功能修復(fù)的機制研究

李長明1,謝尚舉1,全仁夫1,王拓1,杜偉斌1,楊宗保2

(1.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院,杭州 311201;2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廈門 361102)

目的 觀察芒針對急性脊髓損傷炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細胞凋亡的影響,研究PI3K/Akt和MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與芒針的神經(jīng)保護作用,探討芒針促脊髓損傷修復(fù)的具體作用機制。方法 將150只成年雄性SD大鼠隨機分為A組、B組、C組、D組和E組,每組30只。采用改良Allen’s法制作大鼠脊髓中度損傷模型,A組為假手術(shù)組,不予以損傷脊髓及芒針治療;B組造模后不予以芒針治療;C組造模后采用芒針治療;D組造模前0.5 h鞘內(nèi)注射LY294002,造模后采用芒針治療;E組造模前0.5 h鞘內(nèi)注射PD98059,造模后采用芒針治療。分別采用BBB評分檢測大鼠的自發(fā)活動;ELISA檢測炎性因子TNF-a、IL-6、IL-1b、NF-kB的含量;TUNEL檢測細胞凋亡的程度;免疫組化檢測Bcl-2和Bax陽性細胞水平;Western印跡分析p-Akt和p-ERK在脊髓組織的表達,RT-PCR分析Cyt-C和Caspase-3在體內(nèi)的表達。相對的下行Akt和ERK信號通路通過LY294002和PD98059特異性抑制劑處理分析在體內(nèi)的抑制作用。結(jié)果 炎癥反應(yīng)和PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路抑制的神經(jīng)元凋亡參與了脊髓損傷大鼠模型的損害,芒針介導(dǎo)的神經(jīng)保護作用與Bax蛋白陽性神經(jīng)元數(shù)目的減少及Bcl-2蛋白陽性神經(jīng)元數(shù)量的增加有關(guān)。芒針治療能改善大鼠的運動功能,PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路中p-Akt和p-ERK的激活,通過下調(diào)Bax蛋白和Bcl-2表達上調(diào),抑制了線粒體凋亡途徑關(guān)鍵因子Cyt-C的表達。TUNEL法檢測并抑制激活神經(jīng)元凋亡的Caspase-3的級聯(lián)。PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路特異性抑制劑LY294002和PD98059的應(yīng)用抑制了p-Akt和p-ERK的表達。結(jié)論 芒針促脊髓損傷修復(fù)的神經(jīng)保護作用可能與炎癥反應(yīng)和PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路的激活、通過下調(diào)Bax蛋白和Bcl-2表達上調(diào)以及抑制線粒體途徑誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)。

巨刺療法;芒針;脊髓損傷;炎癥反應(yīng);p-Akt;p-ERK;Bcl-2;Bax;Cyt-C;Caspase-3;凋亡;大鼠

脊髓損傷是一種臨床常見病,常導(dǎo)致脊髓功能的不可逆轉(zhuǎn)、損傷平面以下運動及感覺功能完全喪失,從而引起終身殘疾,給家庭和社會帶來了沉重的負擔(dān)。脊髓損傷后的不可逆損傷是由繼發(fā)性損害所致,而繼發(fā)性脊髓損傷是由一系列復(fù)雜的細胞和分子過程介導(dǎo)的。

炎癥反應(yīng)和凋亡是繼發(fā)性損傷的重要組成部分,在調(diào)節(jié)急性和慢性脊髓損傷[1-2]的發(fā)病機制中起核心作用。有研究[3-4]報道,減少炎癥反應(yīng)和細胞凋亡能減輕脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷和促進脊髓功能的恢復(fù)。PI3K/Akt和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是中樞神經(jīng)系統(tǒng)幾個關(guān)鍵的促生存通路。有研究[5]表明,中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在大量Akt和ERK1/2,其參與神經(jīng)組織的各個生理和病理過程。Akt和ERK1/2能通過多種途徑促進細胞的存活,增加與Bcl-2/Bax的比例,抑制細胞色素C的釋放及Caspase級聯(lián)反應(yīng),產(chǎn)生抗凋亡作用[6-10]。LY294002和PD98059是Akt和ERK1/2的特異性抑制劑,能阻斷Akt和ERK1/2信號通路產(chǎn)生促凋亡作用[11-13]。

目前無論中醫(yī)學(xué)還是西醫(yī)學(xué),仍然沒有很好的方法用于治療脊髓損傷[14]。針灸是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的一部分[15],針刺對脊髓的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的影響是多方面的,但至今還未能完全被認知。芒針系由古代“九針”中的“長針”發(fā)展而來,具有取穴少、透穴多、針感強、傳導(dǎo)快等特點,尤其在治療病位深、病勢急、病因復(fù)雜而難愈的頑疾時,能發(fā)揮出一般針灸無法達到的療效。筆者前期研究表明,芒針秩邊與水道穴可以明顯改善脊髓損傷后尿潴留的情況,使脊髓誘發(fā)電位產(chǎn)生變化。然而,芒針對脊髓損傷的具體作用和機制尚不明了。故本實驗探討芒針對脊髓損傷后炎癥反應(yīng)和凋亡的影響,并闡明芒針促脊髓功能修復(fù)的PI3K/Akt和MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)抗凋亡機制,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

150只健康成年雄性SD大鼠,體重為(250±30)g,清潔級,由廈門大學(xué)動物實驗中心提供并分籠飼養(yǎng)[SYXK(閩)2013-0006]。所有大鼠飼養(yǎng)于恒溫、恒濕環(huán)境,每籠3～4只,采用人工照明,12 h光照/黑暗(光照時間7:00—19:00)周期循環(huán)自由取食基礎(chǔ)飼料和自來水,檢疫1星期后分組實驗。動物實驗經(jīng)廈門大學(xué)實驗動物管理委員會批準,并遵循美國國立衛(wèi)生研究院于1996年修訂的《實驗動物管理和使用指南》。

1.2 主要試劑與儀器

山羊抗兔磷酸化蛋白激酶B多克隆抗體(P-Akt)、山羊抗兔p-ERK1/2多克隆抗體、山羊抗兔Bcl-2多克隆抗體、山羊抗兔Bax多克隆抗體和山羊抗兔Bad多克隆抗體(Bioword公司,中國);LY294002和PD98059 (Sigma公司,美國);TNF-a酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、IL-1b酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、IL-6聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒和NF-kB酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(TSZ公司,美國);原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法(TUNEL)試劑盒(羅氏生物公司,北京);JL2B型電脈沖刺激儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,江蘇);RM2135型切片機(Leica公司,德國);電泳及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司,美國)。

1.3 大鼠脊髓損傷模型建立

SD大鼠造模前禁食8 h,實驗順序隨機進行。大鼠稱重后用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉,用卵圓鉗鉗夾無四肢反應(yīng)后將大鼠俯臥位固定于操作臺上,采用改良Allens法制作脊髓中度損傷SD大鼠模型。胸背部(T8-12)正中切口,鈍性分離椎旁肌和棘上韌帶,暴露上下各1個錐體長度,咬除T9-10棘突及全部椎板,暴露0.5 cm寬硬膜。用質(zhì)量為10 g的克氏針沿帶有刻度的導(dǎo)管從60 mm高處垂直自由下落,打擊在直徑4 mm、寬2 mm的由薄塑料材料制成的半圓片上,致傷后迅速移開打擊物,造成大鼠脊髓后角中度損傷,采用4-0絲線逐層縫合。整個實驗過程在(37±0.5)℃的溫度下進行,術(shù)后皮下注射1.0 mL生理鹽水以補充丟失的血容量及每日青霉素(80 U/d)腹腔注射預(yù)防感染,單籠飼養(yǎng),室溫保持在20℃～25℃,給予充足的食物和水。每日2次膀胱按摩協(xié)助排尿,直至建立反射性膀胱排空。

1.4 動物分組及處理

將150只大鼠隨機分為A組、B組、C組、D組和E組,每組30只。A組只打開椎板,不予以損傷脊髓及芒針治療;B組造模后,不予以芒針治療;C組造模后,采用芒針治療,每日1次,共治療7次;D組術(shù)前0.5 h鞘內(nèi)注射5mg LY294002 10mL(溶于1%DMSO),造模后行芒針治療,每日1次,共治療7次;E組術(shù)前0.5 h鞘內(nèi)注射20mmol/L PD98059 10mL(溶于1%DMSO),造模后行芒針治療,每日1次,共治療7次。

1.5 芒針治療方法

C組、D組和E組造模成功后,待大鼠麻醉蘇醒后再進行芒針治療。取秩邊、水道穴。穴位定位根據(jù)世界衛(wèi)生組織制定的國際標準。秩邊位于臀外下部,股骨大轉(zhuǎn)子與薦椎尾椎結(jié)合部連線外1/3與中1/3交點處;水道位于腹部,恥骨聯(lián)合與胸劍聯(lián)合中點連線(分13等份)恥骨聯(lián)合上3等份旁開約2 cm處。詳見圖1。針刺部位備皮消毒,采用華佗牌0.25 mm×25 mm不銹鋼芒針直刺14～15 mm,捻轉(zhuǎn)1 min后留針15 min,其間同側(cè)秩邊、水道(每次單側(cè),左右交替)連接JL2B型電脈沖刺激儀,頻率為2 Hz,電流為1～3 mA,共治療15 min。每日1次,共治療7次。

圖1 大鼠穴位示意圖

1.6 實驗取材

每組取10只大鼠分別于術(shù)后即刻及術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d進行運動功能評分;每組取10只大鼠于術(shù)后7 d心臟灌注取受損節(jié)段脊髓組織1 cm用于HE、TUNEL和免疫組化檢測;每組取10只大鼠于術(shù)后7 d在冰上取新鮮段受損節(jié)段脊髓組織1 cm用于ELISA、Western印跡和RT-PCR檢測。

1.7 檢測指標與方法

1.7.1 功能評價

采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分法對大鼠進行功能評價。在本次研究中,筆者對大鼠特定的功能行為進行了評價,如肢體運動、爪掌面、步態(tài)協(xié)調(diào)、腳趾間隙和尾部的位置等。如果沒有自發(fā)的后肢運動得分為0分,21分表示正常運動。評價時由兩位經(jīng)驗豐富且獨立的測試者在1個100 cm×100 cm的開放區(qū)域內(nèi)進行,共測試4 min。

1.7.2 光鏡

脊髓損傷后7 d,各組大鼠給予10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)和過量肝素生理鹽水心臟灌注20 min,繼之再用0.1 mol PBS配置的4%多聚甲醛固定液(pH值=7.4)灌注5 min,取受損節(jié)段脊髓組織1 cm石蠟包埋,切成縱向6mm厚的石蠟切片,組織片二甲苯脫蠟,加入1X蘇木素染液/溶性伊紅染液,中性樹膠封固,再使用光學(xué)顯微鏡進行分析。

1.7.3 細胞因子的測定

取T9-10節(jié)段脊髓組織勻漿提取上清液,取提取的上清液及不同濃度的標準品各孔50mL,用封板膜封板后置37℃溫育30 min,洗滌5次,每孔加入酶標試劑50mL,再溫育、洗滌、顯色,在酶標儀上于450 nm波長處以陰性對照孔調(diào)零,檢測各孔光密度(OD)值,根據(jù)標準液的檢測結(jié)果得出標準曲線,求出各組樣品的實際濃度。

1.7.4 TUNEL檢測

切片二甲苯脫蠟和再水化,將切片用Proteinase K工作液處理20 min,然后用PBS洗滌3次,加50mL TUNEL反應(yīng)混合液于標本上(1號試劑2號試劑以1:14混合),加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中(37℃ 1 h)。然后用PBS洗滌,滴加50mL 3號試劑(37℃ 30 min),再用PBS洗滌后,滴加100mL新鮮配制的DAB工作液,顯微鏡下觀察隨時終止反應(yīng)。采用蘇木素進行復(fù)染,中性樹膠封固。每張切片隨機取5個視野計數(shù)TUNEL陽性和陰性細胞,結(jié)果以TUNEL陽性細胞數(shù)占總細胞的百分比表示。

1.7.5 Bcl-2和Bax的免疫組化定位

石蠟包埋制備6mm厚的組織切片,然后二甲苯脫蠟和再水化,經(jīng)微波抗原修復(fù),每張切片加1滴或50mL的3%過氧化酶阻斷劑,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,室溫下孵育10 min;加1滴或50mL正常非免疫血清,37℃孵育10 min;加50mL的第一抗體(bcl-2,1:40稀釋,bs1511;bax,1:20稀釋,bs1030);加50mL生物素標記的山羊抗兔IgG(1:200稀釋,B-0061),37℃孵育40 min;加50mL辣根過氧化酶標記鏈親和素溶液(1:400倍稀釋,IH-0061),37℃孵育40 min;加100mL新鮮配制的DAB工作液(AR-0611),顯微鏡下觀察隨時終止反應(yīng)。每一步期間進行0.01 M PBS浸泡,每次5 min,共3次。蘇木素復(fù)染,中性樹膠封固。染色切片用成像軟件系統(tǒng)和顯微鏡檢測免疫陽性細胞。

1.7.6 免疫印跡檢測p-Akt和p-ERK1/2

總蛋白用總蛋白提取試劑盒提取分離。蛋白濃度使用BCA蛋白定量試劑盒的說明書進行測定。受損節(jié)段脊髓樣品50～100mg加入相同體積的5×loading buffer上樣緩沖液,煮沸10 min。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫下孵育兔抗大鼠p-Akt蛋白一抗(1:1000);兔抗大鼠p-ERK1/2蛋白一抗(1:1000),再與辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體(1:4000)在室溫下孵育,將膜與ECL發(fā)光底物,膜與膠片在暗室結(jié)合曝光、顯影、成像。經(jīng)Quantity One圖像分析軟件進行光密度分析,目的條帶的光密度與相應(yīng)的內(nèi)參蛋白b-actin條帶的光密度的比值即為目的蛋白表達的相對表達值。

1.7.7 RT-PCR檢測Cyt-C和Caspase-3

總RNA采用RNA自旋試劑盒的說明書進行抽提。反轉(zhuǎn)錄體系含4mL DNAse 處理過的RNA、5×BuffermL、1mL dNTPs(10 mM)、1mL Oligo(dT)18 (50mM)、0.5mL隨機引物(100mM)、1mL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/mL)、8.5mL DEPC H2O,共20mL。然后按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。30℃ 10 min,42℃ 60 min,99℃ 5 min,4℃ 5 min。取出后在0.2 mL PCR管內(nèi),依次加入1mL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RT產(chǎn)物),各基因上游與下游引物各0.25mL,12.5mL PCR反應(yīng)mix(Taq酶,Taq buffer, dNTPs),用ddH2O補足體積至25mL。按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),94℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,56℃/55℃/48℃退火30 s,72℃延伸30 s, 72℃延伸10 min,擴增35個循環(huán)。用one-Dscan圖像分析軟件分析目標條帶的灰度值。

從GenBank獲得目的基因mRNA的全長序列,利用引物和探針設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計引物序列。經(jīng)過Blast分析,引物序列具有特異性。所用的引物及內(nèi)參照b-actin引物見表1。引物均委托鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1 目的基因的引物信息

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較若滿足正態(tài)性且方差齊時采用單因素方差分析法和法,方差不齊時選擇和法進行方差檢驗和兩兩比較,若不滿足正態(tài)性時采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 功能評估

本實驗共用大鼠150只,存活139只,存活率為92.7%,死亡大鼠予以補齊。A組后肢的運動功能(BBB評分)在術(shù)后3 d恢復(fù)到了21分,且A組造模后各時間點BBB評分與B組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (＜0.01)。B組和C組在術(shù)后1 d內(nèi)BBB評分＜2分,隨時間的延長,后肢功能逐漸恢復(fù),BBB評分逐漸升高,但兩組均未達到術(shù)前水平。C組治療后1、3 d BBB評分與B組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。C組治療后7、14 d BBB評分與B組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),提示芒針治療能促進大鼠脊髓功能的恢復(fù),治療后7 d芒針的療效開始顯現(xiàn)。詳見表2。

表2 各組不同時間BBB評分比較 (±s,分)

表2 各組不同時間BBB評分比較 (±s,分)

組別n術(shù)后即刻術(shù)后1 d術(shù)后3 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d A組3020.20±0.8420.40±0.5521.00±0.0021.00±0.0021.00±0.00 B組30 0.20±0.451) 0.60±0.551) 2.20±0.451) 3.80±0.451) 5.20±0.451) C組30 0.20±0.45 0.40±0.84 2.80±0.84 7.40±0.552) 11.60±0.892)

注:與A組比較1)＜0.01;與B組比較2)＜0.05

2.2 光鏡

術(shù)后7 d,光鏡下檢查A組(見圖2A1、圖2A2)脊髓形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,灰質(zhì)神經(jīng)細胞形態(tài)正常,分布均勻,細胞膜、細胞核及組織間隙均正常,白質(zhì)纖維分布均勻,髓鞘形態(tài)完整,排列整齊。B組(見圖2B1、圖2B2)脊髓形態(tài)不完整,神經(jīng)組織殘缺;組織重度出血,存在大量血細胞;組織疏松水腫,細胞空泡變性,部分細胞核固縮,神經(jīng)纖維溶解、消失;灰質(zhì)神經(jīng)細胞數(shù)量減少,灰質(zhì)神經(jīng)細胞腫脹、核裂解甚至消失,細胞周圍基質(zhì)消失呈空泡狀;白質(zhì)纖維減少,分布不均勻,脫髓鞘,形態(tài)不完整、相互融合。C組(見圖2C1、圖2C2)脊髓形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整,組織中散在血細胞,組織無水腫;灰質(zhì)神經(jīng)細胞形態(tài)基本正常,空泡變性減輕,部分細胞仍存在空泡變性,細胞核無明顯固縮,白質(zhì)纖維分布基本均勻,形態(tài)完整,無脫髓鞘。提示芒針能有效促進脊髓形態(tài)的恢復(fù),效果優(yōu)于B組。

2.3 抗炎反應(yīng)

為了測試芒針治療是否通過調(diào)節(jié)炎性細胞因子的分泌調(diào)控炎癥過程,筆者分析了T9-10節(jié)段脊髓組織中的TNF-a、IL-1b、IL-6、NF-kB的水平。由表3可見,脊髓損傷7 d后,B組促炎細胞因子(TNF-a、IL-1b、IL-6、NF-kB)的水平均顯著升高,與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。芒針治療后,C組促炎細胞因子(TNF-a、IL-1b、IL-6、NF-kB)的水平均顯著下降,與B組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。提示芒針能通過抑制炎癥反應(yīng)促進脊髓損傷的恢復(fù)。

表3 各組大鼠脊髓組織中TNF-a、IL-1b、IL-6、NF-Kb水平比較 (±s,ng/L)

表3 各組大鼠脊髓組織中TNF-a、IL-1b、IL-6、NF-Kb水平比較 (±s,ng/L)

組別nTNF-aIL-1bIL-6NF-kB A組30154.61±4.5116.95±0.8076.67±3.40538.80±14.04 B組30 211.38±3.541) 23.75±0.771)102.53±3.231) 816.79±13.791) C組30 170.06±3.212) 18.73±1.042) 86.81±1.492)626.45±4.952)

注:與A組比較1)＜0.01;與B組比較2)＜0.01

2.4 抗細胞凋亡的影響

為了檢驗芒針是否能有效抑制細胞凋亡,筆者采用損傷脊髓組織(距離T10脊髓節(jié)段損傷正中0.1 cm)進行TUNEL染色觀察。A組因未損傷脊髓,僅有少量凋亡(見圖3A)。術(shù)后7 d,B組大鼠脊髓損傷節(jié)段周圍出現(xiàn)大量的凋亡細胞(見圖3B),大鼠脊髓組織神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)與A組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。C組經(jīng)芒針治療后,凋亡細胞數(shù)明顯減少(見圖3C),神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)與B組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (＜0.01)。D組和E組分別使用LY294002和PD98059后,凋亡細胞數(shù)有所回升(見圖3D、圖3E),神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。每張切片選取5～10個不同的視野進行TUNEL陽性細胞計數(shù),陽性細胞率＝陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)。提示脊髓損傷后存在大量凋亡的發(fā)生,芒針治療后減少了凋亡現(xiàn)象,使用LY294002和PD98059后抑制了芒針的作用,說明PI3K/Akt和MAPK/1/2信號通路可能參與了芒針修復(fù)脊髓損傷的過程。詳見表4。

表4 各組脊髓組織神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)比較 (±s)

表4 各組脊髓組織神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)比較 (±s)

組別n神經(jīng)細胞凋亡指數(shù) A組300.08±0.02 B組30 0.95±0.021) C組30 0.69±0.062) D組30 0.89±0.023) E組30 0.88±0.043)

注:與A組比較1)＜0.01;與B組比較2)＜0.01;與C組比較3)＜0.01

2.5 Bax和Bcl-2免疫反應(yīng)的分布及其變化

表5 各組脊髓組織Bcl-2、Bax陽性表達情況比較(±s)

表5 各組脊髓組織Bcl-2、Bax陽性表達情況比較(±s)

組別n Bcl-2(個/mm2) Bax(個/mm2) A組300.09±0.010.03±0.00 B組300.12±0.010.15±0.00 C組30 0.23±0.021) 0.08±0.001) D組30 0.13±0.012) 0.13±0.013) E組30 0.16±0.012) 0.11±0.013)

注:與B組比較1)＜0.01;與C組比較2)＜0.01,3)＜0.05

脊髓損傷后7 d,B組Bcl-2的陽性細胞數(shù)明顯減少(見圖4B1),Bax的陽性細胞數(shù)明顯增加(見圖4B2)。經(jīng)芒針治療后,C組Bcl-2的陽性細胞數(shù)明顯增加(見圖4C1),Bax的陽性細胞數(shù)明顯減少(見圖4C2),與B組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。D組Bcl-2的陽性細胞數(shù)有所下降(見圖4D1、圖4E1),Bax的陽性細胞數(shù)有所增加(見圖4D2、圖4E2),與芒針組相比,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。提示芒針可以通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達產(chǎn)生抗凋亡作用。詳見表5。

注:A1為A組Bcl-2,A2為A組Bax,B1為B組Bcl-2,B2為B組Bax,C1為C組Bcl-2,C2為C組Bax,D1為D組Bcl-2,D2為D組Bax,E1為E組Bcl-2,E2為E組Bax

2.6 PI3K/Akt和ERK1/2信號通路的影響

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的激活,可以影響疾病的轉(zhuǎn)歸。為了檢驗PI3K/Akt和ERK1/2信號通路是否參與了芒針治療的過程,筆者采用新鮮脊髓組織(距離T10脊髓節(jié)段損傷正中0.1 cm)進行Western Blot檢測。結(jié)果顯示, B組脊髓損傷后p-Akt和p-ERK1/2表達明顯升高,與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。C組p-Akt和p-ERK1/2顯著增高,與B組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。D組和E組p-Akt和p-ERK1/2表達均降低,與C組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05,＜0.01)。提示芒針治療可能與PI3K/Akt和ERK1/2信號通路有關(guān)。詳見表6及圖5、圖6。

表6 各組受損節(jié)段脊髓組織p-Akt和p-ERK1/2表達情況比較 (±s,ng/L)

表6 各組受損節(jié)段脊髓組織p-Akt和p-ERK1/2表達情況比較 (±s,ng/L)

組別np-Aktp-ERK1/2 A組300.56±0.110.86±0.09 B組30 1.04±0.071) 1.20±0.131) C組30 1.38±0.072) 1.62±0.202) D組30 1.17±0.044)- E組30- 1.32±0.063)

注:與A組比較1)＜0.01;與B組比較2)＜0.01;與C組比較3)＜0.01,4)＜0.05

圖5 術(shù)后7 d各組受損節(jié)段脊髓組織p-Akt表達情況

圖6 術(shù)后7 d各組受損節(jié)段脊髓組織p-ERK1/2表達情況

2.7 線粒體凋亡途徑的影響

表7 各組受損節(jié)段脊髓組織Cyt-C和Caspase-3的mRNA含量比較 (±s,ng/L)

表7 各組受損節(jié)段脊髓組織Cyt-C和Caspase-3的mRNA含量比較 (±s,ng/L)

組別nCyt-CCaspase-3 A組301.00±0.020.91±0.12 B組30 1.45±0.031) 1.28±0.031) C組30 1.04±0.082) 0.95±0.051) D組30 1.21±0.093) 1.10±0.063) E組30 1.31±0.023) 1.17±0.023)

注:與A組比較1)＜0.01;與B組比較2)＜0.01;與C組比較3)＜0.01

A組因未損傷脊髓,Cyt-C和Caspase-3僅少量表達。B組脊髓損傷后促進了Cyt-C和Caspase-3的激活,與A組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。C組顯著抑制Cyt-C和Caspase-3的表達,與B組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。D組和E組Cyt-C和Caspase-3的表達均有所升高,與C組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。提示芒針治療后可以促進Cyt-C和Caspase-3的降低,這種作用可能與PI3K/Akt和ERK1/2信號通路有關(guān)。詳見表7及圖7、圖8。

圖7 術(shù)后7 d各組大鼠受損節(jié)段脊髓組織Cyt-C的mRNA含量表達情況

圖8 術(shù)后7 d各組大鼠受損節(jié)段脊髓組織Caspase-3的mRNA含量表達情況

3 討論

芒針由古代九針之一的“長針”發(fā)展而來,因針體長、刺入深,具有取穴少、透穴多、針感強、傳導(dǎo)快等特點,被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療中,包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的神經(jīng)根炎、多發(fā)性神經(jīng)炎、癱瘓、胃腸疾病以及運動系統(tǒng)、精神系統(tǒng)、婦科等方面的疾患[16-17]。本研究結(jié)果顯示,①芒針促進了脊髓損傷的功能性恢復(fù);②炎癥反應(yīng)和細胞凋亡參與了芒針的治療作用;③進一步研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt和ERK1/2信號通路參與了芒針抗凋亡作用;④PI3K/Akt和ERK1/2信號通路的激活是通過線粒體凋亡途徑產(chǎn)生抗凋亡作用實現(xiàn)的。

脊髓損傷的治療一直是神經(jīng)科學(xué)研究的一大問題。長期大量的研究證明,針刺治療急性脊髓損傷可以減輕炎癥反應(yīng)和脊髓繼發(fā)性損傷,改善感覺和運動功能,并改善晚期神經(jīng)功能障礙[18-19]。本研究結(jié)果顯示,芒針治療7 d后,損傷大鼠BBB評分及形態(tài)學(xué)觀察均有好轉(zhuǎn),運動功能恢復(fù)明顯,脊髓形態(tài)結(jié)構(gòu)尚完整。在此基礎(chǔ)上,筆者認為芒針治療急性脊髓損傷是有療效的,其參與了脊髓損傷的神經(jīng)保護作用。

眾所周知,免疫炎癥反應(yīng)是脊髓繼發(fā)性損傷的主要機制之一。小膠質(zhì)細胞在繼發(fā)性神經(jīng)損傷發(fā)揮重要的作用。激活的小膠質(zhì)細胞會釋放TNF-a、IL-1b、IL-6等促炎性因子,從而加重局部炎癥反應(yīng)。TNF-a通過與腫瘤壞死因子受體(TNFR)結(jié)合,活化積聚炎癥細胞,激活內(nèi)皮細胞及神經(jīng)細胞,促進NF-kB的活化及IL-1b、IL-6、TNF-a自身的分泌,釋放細胞毒素(如氧自由基、蛋白水解酶等),誘導(dǎo)花生四烯酸代謝產(chǎn)物的釋放及脂質(zhì)過氧化,破壞細胞膜性結(jié)構(gòu),導(dǎo)致炎癥加重,增加血脊髓屏障的通透性,使損傷的脊髓進一步損傷,并可通過多種途徑誘發(fā)凋亡[20]。大量研究[21-24]證明,針灸具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗脂質(zhì)過氧化、防止細胞受損、抗凋亡等作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),脊髓損傷后,大鼠NF-kB、TNF-a、IL-1b、IL-6等促炎性因子含量和神經(jīng)元細胞凋亡率明顯增高,經(jīng)芒針治療可明顯降低傷段脊髓組織中NF-kB、IL-6b、IL-1b、TNF-a的濃度,并使神經(jīng)元細胞凋亡率明顯下降,具有明顯的炎癥抑制和抗凋亡作用。

細胞凋亡是神經(jīng)細胞損傷后細胞程序性死亡的重要形式。處于細胞凋亡的早期階段的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的激活,是細胞凋亡發(fā)生的必要前提。PI3K/Akt和ERK1/2信號通路的活化是調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、代謝、凋亡的主要途徑[25-26]?；罨腁kt(p-Akt)被認為是調(diào)節(jié)神經(jīng)元生存的中樞性控制因子,與神經(jīng)元的發(fā)育、分化、軸突的生長以及介導(dǎo)突觸的可塑性等密切相關(guān)。Akt的凋亡抑制作用是由Yao R等[27]首次發(fā)現(xiàn)的,其研究表明抑制PI3K/Akt的活性能抵消神經(jīng)生長因子(NGF)抑制細胞凋亡促細胞存活的作用。Jung SY等[7]在研究跑步機運動通過激活PI3K/Akt通路在大鼠降低脊髓損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡中發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后降低了NT-3和IGF-1蛋白的表達,p-Akt/Akt的比率與Bcl-2/Bax的比例明顯下降,Caspase-3的表達明顯增加。這項研究表明在脊髓損傷后跑步機上鍛煉通過抑制細胞凋亡促進運動功能的恢復(fù),且鍛煉的有益效果可以歸因于通過激活PI3K/Akt途徑的增加的神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響。ERK1/2細胞信號傳導(dǎo)通路是由一個小GTP蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白組成的級聯(lián)反應(yīng)[28],使ERK在神經(jīng)損傷的區(qū)域迅速激活(p-ERK1/2),減少神經(jīng)損傷對機體帶來的影響。在外傷性腦損傷中,急性挫傷區(qū)的神經(jīng)元可發(fā)生凋亡,并且持續(xù)數(shù)天至數(shù)星期,此過程中ERK1/2與Caspase家族蛋白被激活,引起興奮性氨基酸增多,使細胞內(nèi)的鈣離子和氧自由基增加,促進了神經(jīng)元的凋亡作用[29]。本研究也顯示,芒針治療后,大鼠p-Akt、p-ERK1/2的表達明顯增強,說明PI3K/Akt和ERK1/2信號通路有可能參與了芒針的抗凋亡作用。LY294002和PD98059分別為PI3K/Akt和ERK1/2信號通路的特異性抑制劑,特異性抑制Akt和ERK1/2的磷酸化,因而阻斷信號通路下游的級聯(lián)反應(yīng)。有研究[11]發(fā)現(xiàn),帕金森病中促紅細胞生成素的抗凋亡作用是通過PI3K/Akt/GSK-3b/ Caspase-3信號通路實現(xiàn)的,而這種抗凋亡作用可以被PI3K抑制劑LY294002和GSK-3b抑制劑氯化鋰抵消。Lu KT等[13]通過使用ERK/MAPK通路特異性抑制劑PD98059,發(fā)現(xiàn)抑制ERK/MAPK通路的激活可以減輕大鼠TBI模型引起的腦組織水腫和神經(jīng)功能損害。本實驗在脊髓損傷前0.5 h通過鞘內(nèi)注射LY294002和PD98059,并進行芒針治療后發(fā)現(xiàn),注射過特異性抑制劑LY294002和PD98059的大鼠p-Akt和p-ERK1/2表達較芒針組少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05,＜0.01)。因此驗證了PI3K/Akt和ERK1/2信號通路確實參與了芒針的抗凋亡作用。

線粒體是細胞的“能量供應(yīng)器”,不僅參與了多種生理過程的調(diào)節(jié),還通過線粒體凋亡途徑在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[30]。當(dāng)細胞受損時,線粒體膜的通透性改變,將會釋放Cyt-C和Caspase,通過信號級聯(lián)激活細胞死亡程序。細胞色素C是線粒體介導(dǎo)凋亡途徑的關(guān)鍵因子。Akt可阻止線粒體釋放細胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子AIF,抑制Caspase瀑布級聯(lián)反應(yīng),從而發(fā)揮抗凋亡的作用。Akt還能磷酸化Bcl-2家族成員BAX的Ser184位點,抑制Cyt-C釋放,負調(diào)控促凋亡功能[31]。ERK1/2的激活不但可以上調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達,而且可以誘導(dǎo)其活化[32-33]。另外,活化的ERK1/2能使Bad ser112位點磷酸化(p-Bad),p-Bad與Bcl-2或Bcl-xL發(fā)生解聚,并且與磷酸絲氨酸結(jié)合蛋白14-3-3結(jié)合,游離的Bcl-2或Bcl-xL則促進細胞的抗凋亡作用。Luchetti F等[10]發(fā)現(xiàn)褪黑激素能夠通過提高bcl-2水平降低超氧陰離子的產(chǎn)生、線粒體損傷和Caspase依賴的細胞凋亡,并在細胞質(zhì)減少Cyt-C的釋放,且增加了ERK的激活,ERK1/2抑制劑PD98059的應(yīng)用,ROS增加、線粒體功能障礙和細胞凋亡。本研究采用免疫組化檢測Bcl-2和Bax的陽性細胞數(shù),發(fā)現(xiàn)芒針治療后Bcl-2陽性細胞數(shù)增加,Bax陽性細胞數(shù)減少。Cyt-C和Caspase-3在芒針干預(yù)后也顯著降低,凋亡受到抑制。特異性抑制劑LY294002和PD98059預(yù)處理后,Bcl-2陽性細胞數(shù)下調(diào),Bax陽性細胞數(shù)上調(diào)。Cyt-C和Caspase-3在芒針干預(yù)后較芒針組有所升高,凋亡較明顯。證實了芒針治療激活PI3K/Akt和ERK1/2信號通路通過線粒體凋亡途徑產(chǎn)生抗凋亡作用的。

綜上所述,芒針治療通過炎癥抑制和PI3K/Akt及ERK1/2信號通路通過線粒體凋亡途徑產(chǎn)生的抗凋亡作用,介導(dǎo)神經(jīng)保護作用及改善神經(jīng)運動功能,明確了芒針治療脊髓損傷的具體機制,為臨床應(yīng)用芒針治療急性脊髓損傷提供了理論依據(jù)。

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Mechanism Study of the Promoting Action of Elongated Needle Acupuncture on Functional Repair in Rats with Acute Spinal Cord Injury

-1,-1,-1,1,-1,-2.

1.,311201,; 2.,361102,

Objective To observe the effect of elongated needle acupuncture on inflammatory reactions and apoptosis in acute spinal cord injury, investigate if PI3K/Akt and MAPK/ERK signal transduction pathways are involved in the neuroprotective effect of elongated needle acupuncture and explore the promoting action of elongated needle acupuncture on spinal cord injury repair. Method One hundred and fifty adult male SD rats were randomized into groups A, B, C, D and E, 30 each. A model of moderate spinal cord injury was made by modified Allen's method. Group A received a sham operation without spinal cord injury and no elongated needle acupuncture. Group B did not receive elongated needle acupuncture after model making. Group C received elongated needle acupuncture after model making. Group D received an intrathecal injection of LY294002 at 0.5 hour before model making and elongated needle acupuncture after model making. Group E received an intrathecal injection of PD98059 at 0.5 hour before model making and elongated needle acupuncture after model making. Rat spontaneous activity was examined using the BBB rating. Inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, IL-1β and NF-kB contents were measured by ELISA. The degree of apoptosis was determined by TUNEL. Bcl-2- and Bax-positive cell levels were measured by an immunohistochemical method. Spinal p-Akt and p-ERK expressions were determined by Western blot. In vivo expressions of Cyt-C and Caspase-3 were determined by RT-PCR. The in vivo inhibitory effect on downstream Akt and ERK signaling pathways was investigated using specific inhibitors LY294002 and PD98059. Result Inflammatory reactions and neuronal apoptosis due to the inhibition of PI3K/Akt and MAPK/ERK signal pathways were involved in the damage in a rat model of spinal cord injury. The neuroprotective effect of elongated needle acupuncture was related to a decrease in the number of Bax protein-positive neurons and an increase in the number of Bcl-2 protein-positive neurons. Elongated needle acupuncture treatment improved rat motor function, activated p-Akt and p-ERK in PI3K/Akt and MAPK/ERK signal pathways by down-regulating Bax protein expression and up-regulating Bcl-2 protein expression and inhibited the expression of Cyt-C, a key factor in the mitochondrial apoptosis pathway. TUNEL detected and inhibited the activation of caspase-3 cascade in neuronal apoptosis. Application of specific inhibitors LY294002 and PD98059 to PI3K/Akt and MAPK/ERK signaling pathways inhibited the expression p-Akt and p-ERK expressions. Conclusion JIN’s three needle therapy plus mirror therapy for knee joint movement is an effective approach in treating hemiplegia after cerebral infarction, and it can improve the lower-limb motor function and the ADL.

Big needle therapy; Elongated needles; Spinal cord injury; inflammatory reaction; P-Akt; P-ERK; Bcl-2; Bax; Cyt-C; Caspase-3; Apoptosis; Rats

1005-0957(2017)03-0343-11

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.03.0343

浙江省中醫(yī)藥科研計劃項目(2008CB067)

李長明(1988—),男,住院醫(yī)師,碩士,Email:lcmmail@126.com

全仁夫(1969—),男,教授,Email:quanrenfu@126.com

2016-08-21