秦國華,王瑞霞,徐志芳,3,桑 楠

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核呼吸因子1在心肌細胞損傷中的保護作用

秦國華1,2*,王瑞霞1,徐志芳1,3,桑 楠1

(1.山西大學環(huán)境與資源學院,山西太原 030006；2.暨南大學環(huán)境學院,廣州市環(huán)境暴露與健康重點實驗室,廣東廣州510632；3.山西省環(huán)境規(guī)劃院,山西太原 030001)

構建含有核呼吸因子1(NRF1)cDNA全長的質(zhì)粒NRF1-pcDNA3.1,用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9C2細胞,探討NRF1在NaHSO3誘導心肌細胞線粒體損傷中的作用.用空質(zhì)?；騈RF1-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染H9C2細胞,100mmol/L的NaHSO3處理轉(zhuǎn)染后的H9C2心肌細胞24h后,首先采用Western blot免疫印跡法檢測H9C2心肌細胞中NRF1和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)蛋白的表達情況.其次,采用化學發(fā)光法檢測細胞中ATP含量,考察NRF1對NaHSO3誘導H9C2心肌細胞線粒體損傷的影響.結果表明,與未染毒組相比,空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組NaHSO3染毒24h后, NRF1和TFAM蛋白的表達及ATP含量均降低;而NRF1-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了NRF1和TFAM蛋白表達和細胞內(nèi)ATP含量; NRF1-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的H9C2細胞經(jīng)過NaHSO3染毒24h后,與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后NaHSO3染毒組相比, NRF1和TFAM的蛋白表達及ATP含量均極顯著上升.由此說明: NaHSO3可降低H9C2細胞中NRF1和TFAM表達及ATP含量, NRF1的高表達可通過調(diào)控下游基因TFAM的表達進而增加細胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生,并且NRF1的高表達可使暴露于NaHSO3所引起的線粒體功能異常得到緩解,揭示NRF1在調(diào)節(jié)NaHSO3誘導的線粒體損傷過程中有重要意義.

NRF1；TFAM；亞硫酸氫鈉；質(zhì)粒構建

隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展,近幾十年亞洲地區(qū)的空氣污染逐漸加重,而SO2是主要污染物之一.SO2主要是由含硫物質(zhì)燃燒產(chǎn)生的,通過呼吸系統(tǒng)進入體內(nèi)后,會與水結合生成亞硫酸鹽(SO32-)和亞硫酸氫鹽(HSO3-),兩者在中性溶液中以摩爾比為3:1的動態(tài)平衡狀態(tài)下存在[1].SO2及其衍生物進入機體后,會增加心血管疾病,如心梗、心律失常、缺血性心臟病、心力衰竭等的發(fā)生率和死亡率[2].此外,作為一種食品添加劑,亞硫酸氫鹽廣泛用于水果、蔬菜的保鮮.實驗室前期研究表明, SO2進入機體后可到達小鼠各個組織器官(包括心臟),造成氧化應激和DNA損傷[3-4].進一步研究顯示, SO2可以引起小鼠心臟超微結構的改變,其中以線粒體最明顯,受損傷最嚴重[5].

前期研究發(fā)現(xiàn), SO2的衍生物NaHSO3可誘導大鼠心肌細胞線粒體結構及功能的損傷,表現(xiàn)為線粒體膜電位、細胞色素C氧化酶活性及ATP含量降低.與此同時,線粒體DNA(mtDNA)含量減少,調(diào)控mtDNA的核呼吸因子1(NRF1)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)的表達也降低.通過構建TFAM-pcDNA3.1質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)在H9C2細胞中高表達TFAM后, TFAM的蛋白表達顯著上升, ATP含量也顯著上升[6].為了進一步探究NRF1是否是SO2及其衍生物誘導線粒體功能紊亂的決定因素,本研究中我們構建了NRF1-pcDNA3.1重組質(zhì)粒,并將其在H9C2細胞中高表達,研究NRF1在SO2誘導心肌細胞線粒體損傷信號通路中的作用,為SO2長期接觸所誘導的心血管疾病的預防及治療提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞和培養(yǎng)基

研究中采用的pcDNA3.1質(zhì)粒為山西大學馬恩波老師實驗室贈送. H9C2細胞來自國家實驗細胞資源共享平臺.大鼠心肌細胞H9C2來源于胚胎期BD1X大鼠心臟組織的亞克隆細胞系,表現(xiàn)很多骨骼肌細胞的特性.H9C2細胞在含10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng).

1.2 實驗材料

Trizol、LA Taq酶購自Takara公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas;ATP檢測試劑盒均購自Beyotime公司;限制性內(nèi)切酶購自NEB公司;連接酶、pGEM-T easy Vector、FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑盒購自Promega公司;其他試劑均為分析純.

1.3 NRF1-pcDNA3.1的質(zhì)粒構建

1.3.1 NRF1基因的獲取 取100mg左右Wistar大鼠心臟組織,加入1mL Trizol勻漿,提取總RNA.蛋白核酸測定儀測RNA的濃度及OD260/OD280,確保比值在1.9~2.1的范圍內(nèi).取1μg總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,加入NRF1上下游引物,上游引物為5′-GTCGAATGA TCTGTGGTTCA-3′,下游引物為5′-GCCGTTTA TTTCCTTTTCAGTTGC-3′,使用Analytik Jena熒光定量PCR儀進行擴增.反應體系為100μL,其中buffer 10μL、MgCl210μL、dNTP 16μL、Taq酶0.5μL、上下游引物各4μL、cDNA 4μL.擴增程序為:95℃預變性4min;95℃30s,55℃ 30s,72℃ 2min進行35個循環(huán);72℃延伸10min, 4℃終止.瓊脂糖凝膠電泳檢測目的DNA片段大小.然后以此PCR的產(chǎn)物為模板,加入含H I和I雙酶切位點的引物,上游引物為5′-GCAG- GATCCCGAATGATCTGTG-3′,下游引物為5′- ACTCTCGAGCCGTTTATTTCC-3′進行擴增,反應體系與反應條件同上.瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物,并用膠回收試劑盒回收DNA片段.

1.3.2 含NRF1基因片段重組質(zhì)粒的構建 膠回收DNA產(chǎn)物與pcDNA3.1質(zhì)粒經(jīng)H I和I雙酶切后,酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的催化下,混合4℃過夜連接.然后轉(zhuǎn)化、挑取單克隆菌落,進行搖菌擴增并提取質(zhì)粒.通過菌落PCR及質(zhì)粒酶切初步鑒定重組質(zhì)粒,選取酶切鑒定成功的質(zhì)粒送往英駿公司進行序列測定.

1.4 細胞培養(yǎng)及染毒

H9C2細胞,用加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng).細胞生長到50%~60%時,用0.4μg空質(zhì)粒pcDNA3.1或NRF1-pcDNA3.1和1μL FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染24h之后再加100μmol/L NaHSO3染毒24h,每組設3個平行樣.細胞存活率采用MTT法檢測.

1.5 Western blot

取1′106H9C2細胞,加入蛋白裂解液進行勻漿,12000′,4℃條件下離心15min,提取蛋白,取30μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)到NC膜上,封閉,加入目的蛋白抗體(anti-GAPDH一抗, CST; anti-NRF1一抗, Anbo; anti-TFAM一抗, BioVision)4℃孵育過夜,熒光標記二抗(IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG(H+L), LI-COR)孵育后, LI-COR Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進行掃描檢測.每組設3個平行樣,每樣測定2次.

1.6 胞內(nèi)ATP的檢測

將生長至70%~80%狀態(tài)良好的細胞用200μL ATP檢測裂解液進行裂解,4℃,12000×,離心10min,取上清,使用酶標儀檢測相對光單位值(RLU),考馬斯亮藍法測定蛋白含量.用試劑盒中ATP標準品設立ATP濃度梯度,測定RLU值,建立RLU值-ATP濃度的標準曲線,所測得RLU值/對應的ATP上清蛋白含量,即為所求結果,每組設3個平行樣,每樣測定3次.

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,采用單因素方差分析與LSD多重比較,0.05時認為具有統(tǒng)計學顯著性.

2 結果

2.1 菌落PCR的擴增含酶切位點NRF1結果

如圖1所示,菌落PCR擴增顯示在1500~ 2000bp有特異性產(chǎn)物,與預期目的片段(1795bp)大小吻合,初步證明所選菌落中含NRF1- pcDNA3.1.

2.2 重組質(zhì)粒NRF1-pcDNA3.1的酶切結果

如圖2所示,將雙酶切后的重組質(zhì)粒NRF1- pcDNA3.1進行電泳,可觀察到有2條帶, Lane2的上方條帶為pcDNA3.1質(zhì)粒,下方為NRF1條帶.進一步表示NRF1-pcDNA3.1質(zhì)粒構建成功.

2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及NaHSO3處理對細胞存活率影響

如圖3所示,轉(zhuǎn)染空質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒NRF1- pcDNA3.1對細胞存活率影響無顯著差異, 100μmol/L NaHSO3處理對細胞存活率也無明顯影響.細胞存活率均在90%以上.

2.4 NRF1過表達對線粒體相關蛋白表達的影響

如圖4所示,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒后,再用100μM NaHSO3處理H9C2細胞24h, NRF1和TFAM的蛋白含量與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比均顯著降低(0.05).重組質(zhì)粒NRF1-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,細胞中NRF1蛋白極顯著增高,表示NRF1高表達成功,同時其下游蛋白—TFAM的蛋白含量也顯著升高(0.01).與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,細胞轉(zhuǎn)染NRF1-pcDNA3.1后再暴露于NaHSO3,NRF1和TFAM的蛋白含量均顯著增高,表明NRF1高表達可有效恢復NaHSO3所致的NRF1和TFAM的表達降低.

2.5 NRF1過表達對胞內(nèi)ATP含量的影響

如圖5所示,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒后,再用100μmol/L NaHSO3處理H9C2細胞24h,胞內(nèi)ATP含量與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比顯著降低(0.05).重組質(zhì)粒NRF1- pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,胞內(nèi)ATP含量極顯著增高,表示NRF1高表達可導致胞內(nèi)ATP含量上升.與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,細胞轉(zhuǎn)染NRF1-pcDNA3.1后再暴露于NaHSO3胞內(nèi)ATP含量顯著增高,表明NRF1高表達可有效恢復NaHSO3所致的胞內(nèi)ATP含量降低.

3 討論

線粒體是細胞進行氧化磷酸化的主要場所,是提供細胞能量的主要來源,而心臟是高度依賴ATP的器官.所以,研究污染物對心肌細胞線粒體的損傷很有必要.線粒體生物合成受轉(zhuǎn)錄因子,如核呼吸因子(NRFs)和TFAM等調(diào)節(jié)[7-9].其中, NRF1基因能調(diào)節(jié)由核編碼的線粒體呼吸鏈部分亞基的表達[10]. TFAM是一個核編碼的HMG蛋白,通過序列結合重鏈啟動子(HSP)和輕鏈啟動子來刺激mtDNA的轉(zhuǎn)錄[11-13]. TFAM具有調(diào)節(jié)mtDNA的拷貝數(shù),維護mtDNA的完整和穩(wěn)定,以及促進mtDNA損傷修復的功能,若無轉(zhuǎn)錄因子存在,mtRNA聚合酶則不能識別線粒體轉(zhuǎn)錄啟動子,而僅有極弱的非特異性轉(zhuǎn)錄活性[14].相關研究表明:NRF1可以激活mtDNA的轉(zhuǎn)錄因子TFAM,進而影響線粒體編碼的氧化磷酸化復合物的表達,包括F0F1的α與β亞基、細胞色素C氧化酶的亞基和UCPs等[15-16].敲除NRF1基因的小鼠表現(xiàn)出mtDNA數(shù)量的顯著減少,這種現(xiàn)象在胚胎發(fā)育過程中是致命的[17].由此可得, NRF1和TFAM基因是mtDNA復制和表達必不可少的因子[18].

亞硫酸氫鹽和亞硫酸鹽等試劑已被廣泛用于抗氧化等食品加工領域,在正常的人體血清中,亞硫酸鹽的平均濃度為5μmol/L,然而口服富含亞硫酸鹽的蔬菜汁30min后,血漿中亞硫酸鹽的濃度上升為112μmol/L[19].相關研究表明,濃度低于100μmol/L的NaHSO3對細胞活力無顯著差異. NaHSO3濃度為300μmol/L時,細胞活力出現(xiàn)顯著下降[6].因此,使用100μmol/L的NaHSO3進行體外實驗,具有一定實際意義.本研究中, 100μmol/L NaHSO3可引起H9C2細胞中NRF1、TFAM蛋白表達和ATP含量的顯著降低,這與先前關于SO2對大鼠心肌細胞的研究結果相一致.實驗表明,高表達NRF1也引起TFAM的高表達,使得ATP的產(chǎn)量顯著增加.心肌細胞在急、慢性缺氧及多種病理狀態(tài)下ATP含量均會降低[20],而高表達NRF1的H9C2細胞暴露于相同濃度的NaHSO3之后, NRF1和TFAM的蛋白表達以及ATP的產(chǎn)量均發(fā)生顯著上調(diào).心肌細胞內(nèi)ATP含量的恢復可有效提高心肌供氧,減少由于線粒體產(chǎn)能不足引起的其他損傷,如維持線粒體鈣穩(wěn)態(tài)、保護線粒體內(nèi)膜功能等.我們前期的研究表明, SO2動式染毒暴露Wistar大鼠,可能通過降低NRF1的表達,影響了其對TFAM的調(diào)控,進一步抑制了線粒體基因組轉(zhuǎn)錄,使心肌線粒體的氧化磷酸化功能受損[21].在對高脂飲食的研究中證實, C57BL/6J小鼠暴露于酮癥誘發(fā)性和非誘導性的高脂飲食,都引起了NRF1和TFAM mRNA水平的顯著下降,從而降低了mtDNA的復制和轉(zhuǎn)錄[22].同時, NRFs(包括NRF1)會誘導氧化磷酸化(OXPHOS)基因的轉(zhuǎn)錄,使細胞核編碼的蛋白轉(zhuǎn)移至線粒體上[23],而促進線粒體的合成. TFAM是核編碼轉(zhuǎn)錄因子,需要從胞漿轉(zhuǎn)入線粒體才能發(fā)揮活性.而在整個運轉(zhuǎn)過程中,前體蛋白TFAM的前導肽序列、胞漿中分子伴侶Chsp70、外膜表面受體Tom20、外膜轉(zhuǎn)位酶復合體核心分子Tom40、內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶復合體Tim23、基質(zhì)中mtHSP60和線粒體的膜電位都發(fā)揮了重要的作用[24].由此,我們推測通過高表達的NRF1調(diào)控下游基因TFAM,使得線粒體生物合成增加,減緩了NaHSO3的暴露對線粒體的損傷,使線粒體功能得到改善.這對探討NRF1在SO2及其衍生物誘導線粒體損傷和凋亡途徑的通路具有重要的意義.

本實驗證實了NRF1在NaHSO3-NRF1- TFAM-mtDNA-ATP信號通路中的重要作用.此外,在線粒體損傷過程中,過氧化物酶體增生物激活受體γ輔激活因子-1α (PGC-1α)[25]、AMPK[23]及炎性細胞因子均可能參與,SO2及其衍生物誘導線粒體損傷是否有上述因子的參與有待進一步研究,對探究保護和維持線粒體功能的機制有重要意義.

4 結論

4.1 100μmol/L的NaHSO3處理空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的H9C2細胞,下調(diào)了NRF1和TFAM蛋白的表達,同時導致胞內(nèi)ATP含量降低.

4.2 通過構建重組質(zhì)粒NRF1-pcDNA3.1并轉(zhuǎn)染H9C2細胞,使NRF1高表達,并且上調(diào)了TFAM的表達和ATP含量的產(chǎn)生.

4.3 NRF1的高表達可能通過NRF1-TFAM- mtDNA的信號通路使NaHSO3的暴露引起線粒體功能異常得到緩解, NRF1對SO2及衍生物誘導的線粒體功能紊亂具有保護作用.

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The protect role of nuclear respiratory factor 1 in mitochondrial damage in cardiac muscles.

QIN Guo-hua1,2*, WANG Rui-xia1, XU Zhi-fang1,3, SANG Nan1

(1.College of Environmental Science and Resources, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.Guangzhou Key Laboratory of Environmental Exposure and Health, School of Environment, Jinan University, Guangzhou 510632, China；3.Shanxi Academy for Environmental Planning, Taiyuan 030001, China).

We constructed a NRF1-pcDNA3.1 plasmid and transfected it in H9C2 cells to explore the effects of NRF1 in sodium bisulfite-induced mitochondrial damage in cardiac muscles of rats. H9C2 cells were treated with 100mmol/L NaHSO3for 24h after NRF1-pcDNA3.1 or pcDNA3.1 transfection. Protein levels of NRF1 and TFAM were measured by Western blotting. The amount of ATP was detected by the chemiluminescence method. It showed that NaHSO3treatment for 24h resulted in significant decreases of NRF1 and TFAM protein expression and ATP amount. The protein levels of NRF1 and TFAM were significantly elevated after NRF1-pcDNA3.1 plasmid transfection, companied by a significant increase of ATP amounts. NRF1and TFAM protein expressions and ATP amount significantly increased after NaHSO3exposure for 24h in NRF1 over-expression group, compared with the pcDNA3.1-transfection group. It implied that over-expression of NRF1 might regulate TFAM to increase intracellular ATP production. In addition, over-expression of NRF1 alleviated the dysfunction of mitochondrial ATP caused by NaHSO3exposure. NRF1 plays an important role in the regulation of NaHSO3-induced mitochondrial damage.

NRF1；TFAM；NaHSO3；over-expression plasmid

X503

A

1000-6923(2017)04-1556-06

2016-07-21

國家自然科學基金資助項目(21007036);廣州市環(huán)境暴露與健康重點實驗室開放基金資助項目(GZKLEEH201612);環(huán)境化學與生態(tài)毒理學國家重點實驗室開放基金資助項目(KF2016-17)

秦國華(1977-),女,山西潞城人,教授,博士,主要從事環(huán)境與健康方面的研究.發(fā)表論文40余篇.

* 責任作者, 教授, qinguojua@sxu.edu.cn

, 2017,37(4)：1556~1561