周鳳麗，馮定云，鄒小玲，吳少珠，劉燕飛 （中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸科，廣東廣州510630）

miRNA499在小細(xì)胞肺癌患者血清和肺泡灌洗液中的表達(dá)分析

周鳳麗，馮定云，鄒小玲，吳少珠，劉燕飛 （中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸科，廣東廣州510630）

目的：探討miRNA499能否作為早期診斷小細(xì)胞肺癌（SCLC）的分子標(biāo)志物．方法：收集26例SCLC患者的血清、肺泡灌洗液以及20例非肺癌呼吸疾病患者的血清，檢測(cè)其RNA濃度、RT逆轉(zhuǎn)錄后cDNA的濃度；同時(shí)檢測(cè)SCLC患者血清以及肺泡灌洗液中miRNA499的相對(duì)表達(dá)．結(jié)果：①SCLC患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499的表達(dá)水平均明顯升高；②非肺癌呼吸疾病患者幾乎不表達(dá)或者不表達(dá) miR?NA499．結(jié)論：miRNA499的檢測(cè)有可能作為臨床SCLC的早期診斷指標(biāo)和基因治療靶點(diǎn)．

肺癌；miRNA499；分子標(biāo)志物

0 引言

肺癌已成為人類因癌癥死亡的主要原因［1－2］．肺癌分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cancer， NSCLC），其中15%～20%為SCLC．SCLC血行轉(zhuǎn)移早，手術(shù)機(jī)會(huì)少，5年生存率不足10%［2］．因此早期診斷才是臨床有效治療SCLC的關(guān)鍵．目前對(duì)NSCLC分子標(biāo)志物的研究較多，SCLC是否也有相應(yīng)的早期診斷的分子標(biāo)志物呢？MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小為20～25個(gè)核苷酸．miRNAs已在許多細(xì)胞代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如發(fā)育、增殖、分化和凋亡．循環(huán)miRNAs已被提議作為新興的生物標(biāo)志物，如癌癥、糖尿病和心血管疾病，包括急性心肌梗死（acute myocardial infarction， AMI）［3］．

目前研究證明miRNAs在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)，如miRNA499的表達(dá)與肝癌密切相關(guān)［4－5］．本研究通過(guò)檢測(cè)SCLC患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499的表達(dá)，明確miRNA499能否作為早期診斷SCLC的分子標(biāo)志物．

1 資料和方法

1．1 一般資料 收集中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院2015－01／2016－05住院或門診的SCLC患者26例，其中男14例，女12例，中位年齡45（30～65）歲，未經(jīng)任何手術(shù)治療以及放、化療，均經(jīng)病理確診．對(duì)照組為非肺癌呼吸疾病患者20例，均為同期中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院接受支氣管鏡檢查的患者．

1．2 標(biāo)本采集 血清采集使用一次性真空采血管（惰性分離膠促凝管），采集受試者外周血標(biāo)本5 mL，分離血清，吸取1 mL血清于1．5 mL離心管中，將血清3000 g離心10 min，后將上清液置入新的離心管中，置－80℃低溫保存．肺泡灌洗液收集使用olympus BF?1T260電子支氣管鏡，SCLC患者取荷瘤肺葉灌洗，對(duì)照組均取右中葉灌洗，以37℃的無(wú)菌生理鹽水150 mL灌洗，回收灌洗液，取樣 10 mL，3000 g，離心5 min、加入250 μL生理鹽水保存．

1．3 血清及肺泡灌洗液中RNA的提取與RT?PCR

采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照常規(guī)Trizol提取操作．血清取 250 μL，加入 1 mL Trizol．生理鹽水溶解的肺泡灌洗液沉淀上清250 μL，加入1 mL Tr?izol，提取方法按照常規(guī)Trizol提取．miRNA499上游引物和下游引物序列均由廣州銳博公司提供（該公司陳述未公開上述引物，需要者可以向其索取）．檢測(cè)按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增．全部取2 μL的cDNA 用于 RT 反應(yīng)條件：42℃，15 min，85℃，1 min．試劑購(gòu)自 Promega公司，定量 PCR采用的體系為：25XdNTPs 2 μL，10Xbuffer 5 μL，上下游引物各10 pmol，Pfu 酶 0．5 μL，濃度參見試劑盒說(shuō)明書，模板2 μL，加三蒸水至總體積 50 μL，該試劑盒為 Super?Real PreMix Plus（SYBR Green），購(gòu)自北京天根（FP205?01）；擴(kuò)增條件為：預(yù)變性 94℃ 5 min，進(jìn)入循環(huán)，變性 94℃ 15 min，退火60℃ 20 s，延伸72℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min相對(duì)拷貝數(shù)比值計(jì)算，依據(jù)2△CT法計(jì)算各組miR499的相對(duì)表達(dá)量［10］．

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析．正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，采用 t檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 兩組患者血清和肺泡灌洗液中RNA濃度測(cè)定

本研究對(duì)RNA進(jìn)行濃度測(cè)定和A260／280比值測(cè)定．正常肺泡盥洗液和血清中RNA含量比肺癌患者少很多，其原因不詳．但是其提取RNA的A260／280比值均可以滿足下一步實(shí)驗(yàn)的需要（表1）．

表1 血清和肺泡灌洗液總RNA濃度和A260／280比值對(duì)照表

2．2 miRNA499 PCR溶解溫度曲線 本研究將miRNA499a的引物進(jìn)行PCR，發(fā)現(xiàn)引物具備特異性，僅有單一的峰值，說(shuō)明miRNA499的引物具有特異性（圖 1）．

圖1 miR499PCR溫度溶解曲線

2．3 肺癌患者血清和肺泡灌洗液以及非肺癌呼吸疾病患者血清的PCR擴(kuò)增曲線 本研究對(duì)肺癌患者血清、肺泡灌洗液以及非肺癌呼吸疾病患者血清進(jìn)行PCR檢測(cè)．結(jié)果顯示，曲線呈“倒S形”，提示PCR擴(kuò)增是標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線，說(shuō)明miRNA499PCR擴(kuò)增過(guò)程是特異性指數(shù)擴(kuò)增（圖2～4）．

圖2 血清標(biāo)本的擴(kuò)增曲線

圖3 肺泡灌洗液的擴(kuò)增曲線

圖4 陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線

2．4 兩組患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499表達(dá)量比較 對(duì)肺癌患者和非肺癌呼吸疾病患者（對(duì)照組）血清進(jìn)行取樣250 μL，提取總RNA；同樣，對(duì)生理鹽水溶解的肺泡灌洗液標(biāo)本，也吸取250 μL．值得注意的是，肺泡灌洗液最初來(lái)自臨床，體積是10 mL，對(duì)其高速離心后，丟棄上清，加250 μL生理鹽水溶解．然后，取總RNA，該總RNA血清和灌洗液中包含了總miRNA．最后，用20 μL無(wú)核酸酶的水溶解，取2 μL反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，PCR 上樣量 2 μL．qPCR 相對(duì)定量的依據(jù)原理是：一定血清或肺泡灌洗液體積內(nèi)miR499拷貝數(shù)的變化．其原因如下：①?zèng)]有合適的恒定表達(dá)的內(nèi)參；②檢測(cè)樣品非腫瘤組織，因?yàn)檠寤蚬嘞匆褐屑词褂蠻6，無(wú)法分辨是腫瘤來(lái)源的還是免疫細(xì)胞來(lái)源的．通過(guò)對(duì)血清和灌洗液的PCR結(jié)果進(jìn)行分析，縱坐標(biāo)表示倍數(shù)變化．具體計(jì)算方式：患者樣品PCR擴(kuò)增的Ct值減去對(duì)照組Ct值，公式：2＾－（Ct患者－Ct對(duì)照），Ct表示定量 PCR 儀上擴(kuò)增曲線Ct值．其結(jié)果提示肺癌患者無(wú)論在血清還是肺泡灌洗液，其 miR499 表達(dá)顯著增高（P＜0．01，圖 5）．

圖5 血清及肺泡灌洗液中miRNA499的相對(duì)表達(dá)圖

3 討論

目前，NSCLC，尤其是肺腺癌的分子標(biāo)志物和靶向治療研究有了很多新的進(jìn)展，但SCLC的分子標(biāo)志物和靶向治療相關(guān)研究均未見新的報(bào)道．

miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小為20～25個(gè)核苷酸．最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，其中與腫瘤相關(guān)的調(diào)節(jié)是參與細(xì)胞增殖和凋亡［6－7］．miRNAs通過(guò)與其下游靶基因的 mRNA 的 3，UTR非翻譯區(qū)域相結(jié)合進(jìn)行調(diào)節(jié)，具體作用方式取決于miRNAs與其靶基因mRNA匹配程度，近乎完全匹配抑制靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄，匹配程度較差抑制翻譯水平的蛋白表達(dá)．大約有30%的人類基因mR?NA受miRNAs的調(diào)控，在多種人類腫瘤組織中可檢測(cè)到 miRNAs的異常表達(dá)［8－10］，而 miRNA499 的高表達(dá)及基因的多態(tài)性也與肝癌［11］、喉癌［12］、口腔癌［13］和肺癌［14］密切相關(guān)．

在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miRNAs發(fā)揮著復(fù)雜的生物學(xué)功能，即可作為原癌基因促肺癌發(fā)生，亦可調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路．研究顯示部分miRNAs對(duì)肺癌的相關(guān)癌基因進(jìn)行調(diào)控，與肺癌的發(fā)生以及臨床預(yù)后有著密切關(guān)系．具體涉及與肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)［15－16］，參與誘導(dǎo)肺癌的細(xì)胞凋亡過(guò)程［17］，與肺癌的早期診斷和病理分型相關(guān)［18－19］，與肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性相關(guān)［20］，以及作為評(píng)估預(yù)后的價(jià)值［21］等．Meta 分析顯示miRNA499可能是肺癌的潛在生物標(biāo)志物［14］，但具體與SCLC的關(guān)系尚未見明確的報(bào)道．

本研究對(duì)非肺癌呼吸疾病患者血清及肺癌患者血清及肺泡灌洗液中RNA濃度測(cè)定，發(fā)現(xiàn)總RNA的變化有著顯著變化．雖然這一檢測(cè)結(jié)果未必和miR?NA499有著直接關(guān)系．但是在研究肺癌患者體液中miRNA的表達(dá)變化時(shí)，應(yīng)當(dāng)給予重視，為什么患者血清中RNA的提取總量升高，有待進(jìn)一步研究．或許預(yù)示著更多其他非miRNA499的 miRNAs、環(huán)狀 RNA、非編碼RNA的增加，目前我們尚不清楚其背后機(jī)制．在檢測(cè)RT逆轉(zhuǎn)錄后，對(duì)照組與SCLC患者血清及肺泡灌洗液中的cDNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：SCLC患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499的表達(dá)水平都明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）．以這種差異表達(dá)情況為基礎(chǔ)，我們期待更進(jìn)一步的研究，比如miRNA499可能作為癌基因參與SCLC患者腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；miRNA499能否作為SCLC基因治療的一個(gè)靶點(diǎn)等．

［1］Ferlay J， Shin HR， Bray F， et al．Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008［J］．Int J Cancer，2010，127（12）：2893－2917．

［2］姚曉軍，劉倫旭．肺癌的流行病學(xué)及治療現(xiàn)狀［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22（8）：1982－1986．

［3］Ban E， Chae DK， Song EJ．Determination of micro?RNA in cardio?myoblast cells using CE with LIF detection［J］．Electrophoresis，2013，34（4）：598－604．

［4］Xiang Y， Fan S， Cao J， et al．Association of the microRNA?499 variants with susceptibility to hepatocellular carcinoma in a Chinese population［J］．Mol Biol Rep，2012，39（6）：7019－7023．

［5］Ye LX， Fu CW， Jiang F， et al．A meta?analysis of microRNA?149，microRNA?499 gene polymorphism and susceptibility to hepatocellular carcinoma［J］．Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi，2016，50（5）：445－450．

［6］Zhu J， Zhou Q， Tan S．Targeting miRNAs associated with surface expression of death receptors to modulate TRAIL resistance in breast cancer［J］．Cancer Lett，2016，383（2）：154－160．

［7］Shen SQ， Huang LS， Xiao XL，et al．miR?204 regulates the biologi?cal behavior of breast cancer MCF?7 cells by directly targeting FOXA1［J］．Oncol Rep，2017，38（1）：368－376．

［8］Lü L， Mao X， Shi P， et al．MicroRNAs in the prognosis of triple?negative breast cancer： A systematic review and meta?analysis［J］．Medicine （Baltimore），2017，96（22）：e7085．

［9］Asukai K， Kawamoto K， Eguchi H， et al．Micro?RNA?130a?3p Regu?lates Gemcitabine Resistance via PPARG in Cholangiocarcinoma［J］．Ann Surg Oncol，2017，24（8）：2344－2352．

［10］Li X， Jin Y， Mu Z， et al．MicroRNA?146a?5p enhances cisplatinin?duced apoptosis in ovarian cancer cells by targeting multiple anti?ap?optotic genes［J］．Int J Oncol，2017，51（1）：327－335．

［11］Chu YH， Hsieh MJ， Chiou HL， et al．MicroRNA gene polymor?phisms and environmental factors increase patient susceptibility to hepatocellular carcinoma［J］．PLoS One，2014，9（2）：e89930．

［12］Brunotto M，Zarate AM，Bono A，et al．Risk genes in head and neck cancer： a systematic review and meta?analysis of last 5 years［ J］．Oral Oncol，2014 50（3）：178－188．

［13］Chen Z， Xu L， Ye X， et al．Polymorphisms of microRNA sequences or binding sites and lung cancer： a meta?analysis and systematic review［J］．PLoS One，2013，8（4）：e61008．［14］Chu YH， Tzeng SL， Lin CW， et al．Impacts of microRNA gene poly?morphisms on the susceptibility of environmental factors leading to carcinogenesis in oral cancer［J］．PLoS One，2012，7（6）：e39777．

［15］Liu X， Tian XD， Liu Y， et al．Regulation of Twist in the metastasis of non?small cell lung cancer by miR?92b［J］．Eur Rev Med Pharma?col Sci，2016，20（19）：4003－4010．

［16］Barshack I， Lithwick?Yanai G， Afek A， et al．MicroRNA expression differentiatesbetween primary lung tumors and metastases to the lung［J］．Pathol Res Pract，2010，206（8）：578－584．

［17］Iaboni M，Russo V，F(xiàn)ontanella R，et al．Aptamer?miRNA?212 conju?gate sensitizes NSCLC cells to TRAIL［J］．Mol Ther Nucleic Acids，2016，5：e289．

［18］Xie Y， Todd NW， Liu Z， et al．Altered miRNA expression in sputum for diagnosis of non?small cell lung cancer［J］．Lung Cancer，2010，67（2）：170－176．

［19］Raponi M， Dossey L， Jatkoe T，et al．MicroRNA classifiers for predicting prognosis of squamous cell Lung cancer［J］．Cancer Res，2009，69（14）：5776－5783．

［20］Guo L， Liu Y， Bai Y， et al．Gene expression profiling of drug?resist?ant small cell lung cancer cells by combining microRNA and cDNA expression analysis［J］．Eur J Cancer，2010，46（9）：1692－1702．

［21］Cinegaglia NC， Andrade SC， Tokar T， et al．Integrative transcrip?tome analysis identifies deregulated microRNA?transcription factor networks in lung adenocarcinoma［J］．Oncotarget，2016，7（20）：28920－28934．

Expression of miRNA499 in serum and bron?choalveolar lavage fluid of patients with small cell lung cancer

ZHOU Feng?Li， FENG Ding?Yun， ZOU Xiao?Ling， WU Shao?Zhu， LIU Yan?Fei
Department of Respiratory Medicine， The Third Affiliated Hospi?tal， Sun Yat?sen University， Guangzhou 510630， China

AIM： To determine whether miRNA499 can be used as a molecular marker for early diagnosis of small cell lung cancer SCLC．METHODS： The serum and bronchoalveolar lavage fluid from 26 patients with SCLC and serum of 20 cancer?free controls with respiratory disease were collected．The RNA concentration and the cDNA concentration after reverse transcription were detec?ted．The expression of miRNA499 in serum and bronchoalveolar lavage fluid of patients with SCLC were also detected．RE?SULTS：①The expression levels of miRNA499 in serum and bronchoalveolar lavage fluid of patients with SCLC were signifi?cantly increased．②The miRNA499 gene was almost not expressed or not expressed in small cell lung cancer?free controls with respir?atory disease．CONCLUSION： The miRNA499 may be used as the early diagnosis index and the target of gene therapy for SCLC．

lung neoplasms； miRNA499； molecular markers

R734．2

A

2095?6894（2017）09?39?03

2017－05－04；接受日期：2017－05－20

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020212531）

周鳳麗．博士，副主任醫(yī)師，碩導(dǎo)．E?mail：zhoufenglizfl＠126．com