劉佩蓉,張瑜,桂敏,刁樞

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院,上海 200137)

·動物實(shí)驗(yàn)·

電針對術(shù)后認(rèn)知功能障礙大鼠認(rèn)知功能及海馬TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

劉佩蓉,張瑜,桂敏,刁樞

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院,上海 200137)

目的 觀察電針對術(shù)后認(rèn)知功能障礙大鼠認(rèn)知功能及海馬TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響,探討電針的作用機(jī)制。方法 將90只健康SD雄性老齡大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組(C組),手術(shù)組(S組),電針組(Z組),每組30只。每組又分為術(shù)后1 d、術(shù)后3 d和術(shù)后7 d 3個(gè)亞組。采用Morris水迷宮檢測認(rèn)知功能,免疫組化法檢測大鼠海馬TNF-α和IL-1β的變化。結(jié)果 與C組同時(shí)點(diǎn)比較,S組術(shù)后1 d、3 d、7 d找到平臺的潛伏期延長,穿越平臺次數(shù)減少(P＜0.05),以術(shù)后3 d最為明顯;與S組同時(shí)點(diǎn)比較,Z組術(shù)后1 d、3 d、7 d找到平臺的潛伏期縮短,穿越平臺次數(shù)增多(P＜0.05)。與 C組同時(shí)間點(diǎn)比較,S組 TNF-α和 IL-1β術(shù)后陽性表達(dá)數(shù)量增加(P＜0.05);與 S組同時(shí)間點(diǎn)比較,Z組各亞組陽性表達(dá)數(shù)量降低(P＜0.05)。結(jié)論 電針調(diào)節(jié)能改善肝左葉切除大鼠術(shù)后學(xué)習(xí)和記憶能力,可能與抑制海馬TNF-α和IL-1β的過度表達(dá)有關(guān)。

電針;認(rèn)知障礙;Morris水迷宮;TNF-α;IL-1β;大鼠;消化系統(tǒng)外科手術(shù)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是手術(shù)麻醉后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,導(dǎo)致患者記憶、注意力、語言和抽象思維能力顯著降低[1]。POCD常見于手術(shù)麻醉后的老年患者,約14%的老年人在手術(shù)后3個(gè)月內(nèi)經(jīng)歷過認(rèn)知能力下降[2]。POCD增加老年患者的病死率,所以發(fā)展?jié)撛诘念A(yù)防或治療 POCD的策略非常迫切[3]。近年來,各種臨床研究發(fā)現(xiàn)了許多POCD的危險(xiǎn)因素,如麻醉類型、患者年齡、手術(shù)應(yīng)激、手術(shù)創(chuàng)傷和術(shù)后疼痛等[4-6]。手術(shù)創(chuàng)傷后海馬促炎因子的過度表達(dá)是 POCD的發(fā)病機(jī)制之一[7-9]。電針調(diào)節(jié)能減輕非手術(shù)創(chuàng)傷大鼠腦組織炎癥反應(yīng)[10-11],進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶能力,但對于手術(shù)創(chuàng)傷大鼠是否同樣有效,目前尚無定論。本研究采用肝左葉切除術(shù)模擬中等手術(shù)創(chuàng)傷建立POCD模型[12],旨在探討電針調(diào)節(jié)對 POCD大鼠認(rèn)知功能的改善作用以及與海馬促炎因子TNF-α和IL-1β表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SD雄性老齡大鼠,18～20月齡,體重300～350 g,購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理

90只健康SD雄性老齡大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(C組)、手術(shù)組(S組)、電針組(Z組),每組30只。每組根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)分為術(shù)后1 d、術(shù)后3 d和術(shù)后7 d 3個(gè)亞組(n=10)。

根據(jù)文獻(xiàn)建立POCD模型[12],S組和Z組肝左葉切除術(shù),10%水合氯醛(0.04 mL/10 g)腹腔注射麻醉,待大鼠翻正反射消失后仰臥位固定,腹部消毒,于上腹部正中線做一小切口,游離切除左側(cè)肝葉,徹底止血,逐層關(guān)腹。C組腹腔注射麻醉后在上腹部正中線相同部位僅做表皮切開縫合術(shù),不切除肝左葉。

Z組參照《實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜》[13],取百會穴(在頭頂正中線中點(diǎn)頭骨中央),雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴(位于腕至肘間下1/6處前肢內(nèi)側(cè),離腕關(guān)節(jié)約3 mm的尺橈骨縫間),雙側(cè)合谷穴(位于前肢第一、二掌骨之間)。采用0.35 mm×13 mm不銹鋼毫針,平刺約2.5 mm。然后百會穴連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(與百會穴形成環(huán)路的另一電極,連接于百會穴后5 mm的非穴點(diǎn))。電針頻率2/10 Hz,強(qiáng)度4 mA,疏密波持續(xù)刺激。術(shù)前30 min至手術(shù)結(jié)束,術(shù)后每日1次,每次30 min,連續(xù)7 d。C組和S組不予電針干預(yù)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 行為學(xué)測定

采用Morris水迷宮測定學(xué)習(xí)記憶能力,具體包括定位巡航實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮測定時(shí),室溫及水溫均保持在24～26℃。迷宮上方安置與電腦系統(tǒng)連接的攝像機(jī),同步記錄。于術(shù)前5 d進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練,每天4次。定位巡航實(shí)驗(yàn),將大鼠從離平臺最遠(yuǎn)的象限1/2弧度處輕放于水中,讓其找到水中的平臺,記為潛伏期(設(shè)定最長游動時(shí)間為90 s)?？臻g探索實(shí)驗(yàn),定位巡航實(shí)驗(yàn)后撤除平臺,選定和平臺相對的象限中點(diǎn)為入水點(diǎn),記錄90 s內(nèi)老齡大鼠為搜索平臺而穿過平臺區(qū)的次數(shù)。大鼠經(jīng)訓(xùn)練后,能連續(xù)3次在90 s內(nèi)從起始點(diǎn)找到平臺,作為訓(xùn)練成功的大鼠,進(jìn)入后面的試驗(yàn)。分別記錄術(shù)后1 d、3 d、7 d老齡大鼠的逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)。

1.3.2 海馬TNF-α和IL-1β的測定

于術(shù)后1 d、術(shù)后3 d和術(shù)后7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)麻醉后取大鼠海馬組織,-85℃冰箱保存,運(yùn)用免疫組化染色海馬TNF-α和IL-1β。組織切片放入3%過氧化氫溶液(雙氧水:純水=1:9),室溫避光孵育25 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS液沖洗5 min×3次;加入3%BSA,室溫封閉30 min;加入一抗,4℃孵育過夜,PBS液沖洗5 min×3次;滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗(HRP標(biāo)記)覆蓋組織,室溫孵育50 min,最后用DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水、透明、中性樹膠封片,蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色,DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠行為學(xué)測定結(jié)果比較

與C組同時(shí)點(diǎn)比較,S組術(shù)后1 d、3 d、7 d找到平臺的潛伏期延長,穿越平臺次數(shù)減少(P＜0.05),以術(shù)后3 d最為明顯;與S組同時(shí)點(diǎn)比較,Z組術(shù)后1 d、3 d、7 d找到平臺的潛伏期縮短,穿越平臺次數(shù)顯著增多(P＜0.05);Z組與C組術(shù)后同時(shí)點(diǎn)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠行為學(xué)測定結(jié)果比較 (±s,個(gè))

表1 3組大鼠行為學(xué)測定結(jié)果比較 (±s,個(gè))

注:與C組同時(shí)點(diǎn)比較1)P＜0.05;與S組同時(shí)點(diǎn)比較2)P＜0.05

指標(biāo) 組別n術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d C 組 10 26.33±7.05 27.35±6.97 27.35±7.01逃避潛伏期(s)穿越平臺數(shù)(次)S 組 10 33.10±6.811)62.52±12.011)40.11±11.451)Z 組 10 26.07±6.322)34.11±7.822)30.73±7.222)C 組 10 5.11±1.46 4.87±1.37 5.24±1.45 S 組 10 3.63±1.451)2.56±0.791)3.27±0.891)Z 組 10 4.98±1.332)3.87±0.882)4.36±1.102)

2.2 3組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)比較

與C組同時(shí)間點(diǎn)比較,S組TNF-α和IL-1β術(shù)后陽性表達(dá)數(shù)量增加(P＜0.05),其中TNF-α以術(shù)后1 d最為明顯;IL-1β以術(shù)后3 d最為明顯;與S組同時(shí)間點(diǎn)比較,Z組各亞組 TNF-α、IL-1β陽性表達(dá)數(shù)量顯著降低(P＜0.05)。與C組比較,Z組術(shù)后 1 d TNF-α陽性表達(dá)數(shù)量增加(P＜0.05),術(shù)后3 d恢復(fù);術(shù)后1 d和術(shù)后 3 d IL-1β陽性表達(dá)數(shù)量增加(P＜0.05),術(shù)后 7 d恢復(fù)。詳見表2。

表2 3組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)比較 (±s)

表2 3組大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)比較 (±s)

注:與C組同時(shí)點(diǎn)比較1)P＜0.05;與S組同時(shí)點(diǎn)比較2)P＜0.05

指標(biāo) 組別n術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d C 組 10 0.82±0.12 0.78±0.15 0.80±0.13 TNF-αS 組 10 1.46±0.221)1.28±0.251)1.10±0.261)Z 組 10 1.09±0.241)2)0.93±0.212)0.85±0.232)C 組 10 3.02±0.36 3.23±0.34 2.97±0.30 IL-1βS 組 10 5.32±0.471)6.16±0.551)5.87±0.521)Z 組 10 4.31±0.351)2)4.56±0.381)2)3.28±0.362)

3 討論

POCD是老年患者手術(shù)麻醉后常見的并發(fā)癥,主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶能力的可逆性損害[14],部分甚至發(fā)生癡呆,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,并帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)。

結(jié)合傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)理論及相關(guān)基礎(chǔ)研究,電針能雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng),抑制炎癥的過度表達(dá)。根據(jù)POCD的臨床表現(xiàn),當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“健忘”范疇,甚至“癡呆”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,POCD的病位主要在于心腦,治療需立足疏經(jīng)通絡(luò)、醒神開竅。百會位居巔頂,穴歸屬督脈,是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴[15-16]。內(nèi)關(guān)屬手厥陰心包經(jīng)的絡(luò)穴,為八脈交會穴,善治精神疾患[16-17]。合谷是手陽明大腸經(jīng)的原穴,疏經(jīng)通絡(luò),是頭面部疾患中常用的穴位[18]。因此,本研究選取百會穴、雙側(cè)合谷穴和雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴行電針調(diào)節(jié)。

Morris水迷宮是測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的重要工具,通過受試大鼠找到迷宮中的平臺位置來反映空間記憶功能。Morris水迷宮廣泛應(yīng)用于評價(jià)大鼠和小鼠的認(rèn)知功能[19-24]。故本研究采用Morris水迷宮測定大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的變化。

炎癥反應(yīng)在手術(shù)創(chuàng)傷和麻醉引發(fā)的認(rèn)知功能障礙中起著重要的作用[25-26]。POCD的發(fā)病機(jī)制中,炎癥反應(yīng)可能起到重要的作用[7-9]。生理狀態(tài)下促炎因子和抗炎因子處于脆弱的平衡,這種平衡很容易被手術(shù)創(chuàng)傷打破,引起局部和全身炎癥反應(yīng)。手術(shù)創(chuàng)傷激活外周免疫系統(tǒng)釋放各種炎性因子,外周炎性因子透過血腦屏障激活小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致海馬區(qū)長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)的破壞,介導(dǎo)認(rèn)知功能的損傷;與年齡相關(guān)的膠質(zhì)細(xì)胞活性的改變也會加劇老年患者炎癥反應(yīng)的程度[8-9]。在POCD大鼠海馬組織中,各種炎癥細(xì)胞因子水平顯著升高,包括TNFα、IL-1α/β、IL-6和IL-8等[27]。這些炎癥細(xì)胞因子能進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞、破壞血腦屏障的通透性,最終引起腦損傷和認(rèn)知功能障礙[28-29]。本次研究顯示,與C組同時(shí)間點(diǎn)相比,S組術(shù)后TNF-α和IL-1β陽性表達(dá)數(shù)量增加(P＜0.05),與行為學(xué)測定在時(shí)間上吻合,證實(shí)存在有神經(jīng)炎癥反應(yīng),與以往研究一致[7-9]。

近期研究顯示,電針刺激能改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,降低海馬組織中的IL-1β、TNF-α含量,緩解腦缺血后炎癥反應(yīng)[10]。電針可以抑制阿爾茨海默病大鼠海馬區(qū)IL-1β、TNF-α的過度表達(dá),減輕腦組織炎癥反應(yīng),進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶能力[11]。這表明,抑制炎癥反應(yīng)是電針治療認(rèn)知功能障礙的一種機(jī)制。多個(gè)研究報(bào)道,抑制TNFα或IL-1α/β信號通路能有效改善老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙[30-34]。本研究中與C組同時(shí)間點(diǎn)比較,S組TNF-α和IL-1β陽性表達(dá)數(shù)量顯著增加(P＜0.05);Z組與S組同時(shí)間點(diǎn)比較,TNF-α和IL-1β陽性表達(dá)數(shù)量降低(P＜0.05);Z組與C組同時(shí)間點(diǎn)比較,TNF-α術(shù)后3 d恢復(fù),IL-1β術(shù)后7 d恢復(fù);并且,海馬炎癥因子表達(dá)與行為學(xué)測定一致。本研究結(jié)果提示,電針調(diào)節(jié)可能通過抑制手術(shù)創(chuàng)傷大鼠海馬促炎因子的過度表達(dá),起到改善學(xué)習(xí)記憶的作用。

綜上所述,電針調(diào)節(jié)能改善肝左葉切除大鼠術(shù)后學(xué)習(xí)和記憶能力,可能與抑制海馬TNF-α和IL-1β的過度表達(dá)有關(guān)。

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Effect of Electroacupuncture on Cognition and Hippocampal TNF-α and IL-1β Expressions in Rats with Postoperative Cognitive Dysfunction

LIU Pei-rong,ZHANG Yu,GUI Min,DIAO Shu.Seventh People’s Hospital of Shanghai University of TCM,Shanghai200137,China

Objective To observe the effect of electroacupuncture (EA) on the cognition and hippocampal tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin (IL)-1β expressions in rats with postoperative cognitive dysfunction (POCD),and discuss the action mechanism of EA. Method Ninety healthy male senile Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into a sham operation group (group C), an operation group (group S) and an EA group (group Z), 30 rats in each group. Each group was then further divided into 3 subgroups: postoperative day 1, postoperative day 3 and postoperative day 7. The Morris water maze was adopted to evaluate the cognitive function, and immunochemistry method was used to detect the changes of TNF-α and IL-1β. Result Compared with group C at the same time points, the latent period was significantly longer and the crossing times were lower in group S on postoperative day 1, day 3 and day 7 (P＜0.05), and the differences were most significant on postoperative day 3;compared with group S at the same time points, the latent period was significantly shorter and the crossing times were higher in group Z on postoperative day 1, day 3 and day 7 (P＜0.05). Compared with group C at the same time point,the positive expressions of TNF-α and IL-1β were significantly higher in group S (P＜0.05); compared with group S at the same time points, the positive expressions were significantly lower in each subgroup of group Z (P＜0.05).Conclusion EA can improve the learning and memory of rats after left lateral segmentectomy of the liver, which ispossibly related to the inhibition of the over-expressions of TNF-α and IL-1β.

Electroacupuncture; Cognitive impairment; Morris water maze; TNF-α; IL-1β; Rat; Digestive system surgical procedures

R2-03

A

2017-05-14

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.09.1116

1005-0957(2017)09-1116-05

上海市衛(wèi)計(jì)委面上項(xiàng)目(20134286);上海市浦東新區(qū)學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃(PWRd2016-17)

劉佩蓉(1976—),女,副主任醫(yī)師,碩士,Email:lpeir@126.com

刁樞(1963—),男,主任醫(yī)師,Email:diao_shu@126.com