唐遠江，尚以順，周思旋，楊粵黔，張 濤，余 波

（1.貴州宏宇畜牧技術發(fā)展有限公司，貴州 貴陽 550005；2. 貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005）

光枝勾兒茶主要成分提取工藝的優(yōu)化

唐遠江1，2，尚以順1，周思旋2，楊粵黔1，2，張 濤1，2，余 波1，2

（1.貴州宏宇畜牧技術發(fā)展有限公司，貴州 貴陽 550005；2. 貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005）

光枝勾兒茶是民族中藥材，為研究同時提取光枝勾兒茶中蘆丁和槲皮素的最佳條件，采用回流提取法、響應面分析法，考察乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比3個因素及其交互作用和提取時間對提取工藝的影響。結果表明，光枝勾兒茶蘆丁和槲皮素的最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)73.72%、溫度60.52℃、液料比32.21 mL/g，提取時間3 h，蘆丁、槲皮素的提取率分別為18.55、0.36 mg/g，通過試驗驗證得到蘆丁、槲皮素的提取量平均值分別為18.48、0.35 mg/g，與理論值相比誤差小。試驗結果為光枝勾兒茶蘆丁和槲皮素的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

光枝勾兒茶；蘆??；槲皮素；回流提取；響應面

Abstract：Berchemia polyphylla var. leioclada. is a national medicine plant. In order to find the optimum condition of rutin and quercetin from B. polyphylla var. leioclada. reflux extraction method and surface response analysis were used，ethanol concentration，extraction temperature，solid-liquid ratio factors and their ineraction and extracting time were designed to optimize the extracting process. The results showed that the best extraction condition of rutin and quercetin were selected with 73.72% alcohol，60.52℃ and 32.21 mL/g of solid-liquid ratio，extracting time was 3 h. The extraction rates of rutin and quercetin were 18.55 and 0.36 mg/g，respectively.Through experiment study，the average of rutin and quercetin were 18.48 and 0.35 mg/g，respectively，which had a lillte error to the theory value. The results provide a theoretical basis for further development and use of rutin and quercetin from B. polyphylla var. leioclada.

Key words：Berchemia polyphylla var. leioclada.；rutin；quercetin；reflux extraction；response surface

光枝勾兒茶（Berchemia polyphylla var.leioclada.）屬于鼠李科勾兒茶屬植物，是鐵包金的一種，又名老鼠耳、烏龍根，貴州苗家常用藥材，多以根、莖、葉入藥，有清熱利濕，化痰止咳等功效［1］。勾兒茶屬植物味苦、平，具有止血止痛、祛風濕等功效，對風濕性關節(jié)炎、肺結核、蕁麻疹、急慢性氣管炎、黃疸、睪丸腫痛、婦女痛經(jīng)、痢疾、跌打損傷、癰腫瘡毒等癥有良好治療作用［2］。研究表明，該屬植物的化學成分包括苷類、醌類、木脂素類、萜類以及黃酮類［3］等，具有抗氧化［4］、抗腫瘤［5-6］、抗腹瀉［7］、消炎鎮(zhèn)痛［8］、抑菌［9］等作用。勾兒茶屬植物作為一種重要的中藥材，在臨床、中獸藥研發(fā)上具有重要作用，以勾兒茶屬植物為主要入藥的止痢散能有效抗腹瀉［10］，且對動物無毒副作用［11］。

由于中獸藥制劑多為復方制劑，很難對其中單一成分的藥效進行評估，因此必須根據(jù)有效成分含量對復方制劑進行質(zhì)量控制。廣西中藥材標準規(guī)定以蘆丁、槲皮素、β-谷甾醇為鐵包金藥材的指標成分，根據(jù)有效成分含量多少進行質(zhì)量優(yōu)劣評估［12］。蘆丁、槲皮素屬于黃酮類化合物，黃酮類化合物的提取方法有煎煮法、回流提取法、索氏提取法、超聲提取法等［13］。工業(yè)化生產(chǎn)中多采用煎煮法和回流提取法，但水煎煮法很難有效提取黃酮類化合物［14］。光枝勾兒茶作為一種重要的獸用中藥材，目前關于其蘆丁和槲皮素的提取研究較少。本研究為了確定同時提取光枝勾兒茶中蘆丁和槲皮素的最佳工藝，通過回流法提取目標物質(zhì)，采用響應面法優(yōu)化提取條件，以期能有效開發(fā)和利用光枝勾兒茶中的蘆丁和槲皮素，同時為以該植物入藥的中獸藥提供質(zhì)量控制依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

光枝勾兒茶樣品，由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所獸用中草藥研究室提供，經(jīng)貴州省畜牧獸醫(yī)研究所尚以順研究員鑒定為Berchemia polyphylla var. leioclada.。蘆丁、槲皮素對照品購自上海源葉生物科技有限公司，色譜甲醇購自賽默飛世爾科技有限公司，試劑均為分析純。試驗主要設備包括BSA224S電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）、LC-20高效液相色譜儀（日本島津公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線繪制 分別精密量取0.4 mg蘆丁、槲皮素對照品，置入10 mL容量瓶，加入少量甲醇，超聲溶解，冷卻后定容，配制成0.4 mg/mL的蘆丁、槲皮素標準溶液，分別以兩種對照品溶液為標樣，精密量取配制成含有蘆丁、槲皮素 0.016、0.032、0.048、0.064、0.080 mg/mL的混合液。HPLC檢測蘆丁、槲皮素含量，分別以峰面積的積分值Y為縱坐標，蘆丁、槲皮素濃度X為橫坐標，繪制標準曲線。根據(jù)線性范圍，連續(xù)進樣6次，計算回樣品收率和峰面積相對標準偏差（RSD）檢測條件［15］：色譜柱為Diamonsil C18柱（4.6×250 mm，5 μm），流動相為甲醇∶水=55∶45，柱溫28℃，檢測波長為257 nm，進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。

1.2.2 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響 取光枝勾兒茶粉末1 g，按照液料比30 mL/g分別加入體積分數(shù)為0、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液，70℃下回流提取2 h，以4 000 r/min離心10 min，沉淀部分重復提取1次，合并濃縮上清液，置于50 mL容量瓶中，定容、搖勻后過0.45 μm濾膜得到供試品溶液。HPLC檢測蘆丁、槲皮素含量。每個試驗組3次平行（下同）。

1.2.3 料液比對提取率的影響 稱取光枝勾兒茶粉末 1 g，按照液料比為 10、20、 30、40、50 mL/g分別加入70%乙醇溶液，70℃下回流提取2 h后檢測蘆丁、槲皮素的含量。

1.2.4 提取時間對提取率的影響 稱取光枝勾兒茶粉末1 g，按照液料比為30 mL/g加入70%乙醇溶液，70℃下分別提取 1、2、3、4、5 h，檢測蘆丁和槲皮素的含量。

1.2.5 提取溫度對提取率的影響 稱取光枝勾兒茶粉末1 g，按照料液料比為30 mL/g加入70%乙醇溶液，分別在 50、60、70、80、90℃溫度條件下回流提取2 h，檢測蘆丁和槲皮素的含量。

1.2.6 Box-Behnken試驗 根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以蘆丁、槲皮素含量為目標函數(shù)響應值，選取乙醇體積分數(shù)（X1）、料液比（X2）、溫度（X3）設計3因素3水平的響應面分析試驗，其因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計

2 結果與分析

2.1 標準曲線

試驗得到蘆丁、槲皮素的標準曲線為別為Y= （2E+07） X-11925，R2= 0.9965，Y = （2E+07）X-36384，R2= 0.9962，蘆丁平均回收率為97.91%，RSD為2.85%，槲皮素平均回收率為98.64%，RSD為3.14%，表明蘆丁和槲皮素濃度均在0.016～0.080 mg/mL內(nèi)與峰面積線性關系良好。

2.2 最佳乙醇體積分數(shù)

乙醇體積分數(shù)為0、20%、40%、60%、80%、100%時，光枝勾兒茶蘆丁含量分別為1.89、3.02、6.11、13.68、18.32、18.55 mg/g，槲皮素含量分別為 0.08、0.12、0.25、0.32、0.34、0.35 mg/g。乙醇濃度越高，主要成分的提取量越高，但工業(yè)生產(chǎn)成本也高，因此初步確定最佳乙醇體積分數(shù)為60%。

2.3 最佳料液比

料液比為 10、20、30、40、50 mL/g時，光枝勾兒茶蘆丁含量分別為10.25、15.64，17.38、17.68、16.32、15.69 mg/g，槲皮素含量分別為0.12、0.26、0.35、0.32、0.27、0.24 mg/g，液料比為35 mL/g 時蘆丁、槲皮素的提取量均達到最大。提取溶劑極性與目標成分極性越相近越有利于目標成分提?。?6］，但增大溶劑量也增加濃縮時間，造成濃縮時能量損耗，因此選擇液料比30 mL/g 較合適。

2.4 最佳提取時間

提取時間為1、2、3、4、5 h時，光枝勾兒茶蘆丁含量分別為16.85、17.74、18.68、18.03、17.92 mg/g，槲皮素含量分別為0.24、0.32、0.38、0.42、0.39 mg/g。兩者提取量在提取時間為3 h時達到最高，長時間加熱可使蘆丁、槲皮素發(fā)生降解而轉(zhuǎn)變成其他物質(zhì)，由此確定最佳提取時間為3 h。

2.5 最佳提取溫度

提取溫度為 50、60、70、80、90℃時，光枝勾兒茶蘆丁含量分別為14.84、17.83、18.78、17.24、15.71、15.16 mg/g；槲皮素含量分別為0.35、0.42、0.38、0.33、0.29、0.26 mg/g。蘆丁的提取量在60℃時達到最大，槲皮素的提取量70℃時達到最大，但與60℃時相差不大。高溫條件有利于蘆丁、槲皮素浸出，但高溫條件下兩者易發(fā)生降解、縮合、氧化等化學反應而影響其穩(wěn)定性［17］。因此初步選擇60℃作為最佳提取溫度。

表2 響應面試驗結果

2.6 響應面分析提取工藝

2.6.1 響應面模型回歸分析 響應面試驗結果見表2，采用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對表2進行多元回歸擬合，建立蘆丁、槲皮素提取量對X1、X2、X3的二次多項回歸方程，蘆丁提取量Y = 18.43+1.12X1-0.24X2+0.46X3-

槲皮素提取量Y = 0.38+（2.500E-003）X1-（1.250E-003）X2+0.019X3+（7.500E-003）

2.6.2 蘆丁提取條件的響應面分析 由表3可知，模型F值為35.73，P＜0.001，說明響應回歸模型極顯著。失擬項P=0.0712＞0.05，失擬不顯著，模型校正系數(shù)R2=0.9232，說明該模型擬合度較好，可用該模型對蘆丁提取進行分析和預測。由P值可知各因素中二次項、、影響均顯著，對蘆丁提取量的影響大小：X1＞X3＞X2。各個因素交互實驗的響應面如圖1所示。響應面圖呈馬鞍形表示兩個因素交互作用顯著，圓形則表示不顯著［18］。由圖1可知X1和X3，X2和X3的響應面陡峭，表明他們之間交互作用較顯著，X1和X2相互作用不顯著。

表3 蘆丁提取條件的方差分析

圖1 乙醇體積分數(shù)、溫度和液料比交互作用對蘆丁提取影響的響應

2.6.3 槲皮素提取條件的響應面分析 由表4可知，模型F值為9.18，P＜0.001，說明響應回歸模型極顯著。失擬項P=0.4063＞0.05，失擬不顯著，模型校正系數(shù)R2=0.9259，說明該模型擬合度良好。由P值可知各個因素中二次項?。篨3＞X1＞X2。各個因素交互實驗的響應面見圖2。圖2所示X1和X3，X2和X3的響應面圖陡峭，表明其交互作用顯著，X1和X2相互作用不顯著。

2.6.4 最優(yōu)提取條件 根據(jù)回歸模型分析得到光枝勾兒茶中蘆丁、槲皮素的最優(yōu)提取條件為乙醇體積分數(shù)73.72%、提取溫度60.52℃、液料比32.21 mL/g，提取時間3 h，蘆丁、槲皮素含量的理論值分別為18.55、0.36 mg/g。在此最佳工藝條件下，通過3次平行試驗驗證后得到蘆丁、槲皮素的提取量平均值分別18.48、0.35 mg/g，在誤差范圍內(nèi)達到試驗預期目的，說明此工藝提取光枝勾兒茶主要成分工藝可靠。

表4 槲皮素提取條件的方差分析

圖2 乙醇體積分數(shù)、溫度和液料比交互作用對槲皮素提取影響的響應

3 結論與討論

本試驗得到光枝勾兒茶蘆丁、槲皮素的最優(yōu)提取條件為乙醇體積分數(shù)73.72%、提取溫度60.52℃、液料比32.21 mL/g、提取時間3 h。根據(jù)文獻報道，蘆丁和槲皮素的最佳提取條件有所不同。劉曉靜等［19］采用浸漬法取紅棗中蘆丁的最佳條件是乙醇體積分數(shù)74%、溫度72℃、液料比43 mL/g，與之相比，本試驗的液料比較低，乙醇體積分數(shù)相差不大、提取溫度較高。柯發(fā)敏［20］的研究得出回流法提取趕黃草中槲皮素的最佳條件為乙醇體積分數(shù)80%、溫度75℃、液料比15 mL/g，與之相比，本試驗的液料比較高，提取溫度、乙醇體積分數(shù)較低。

本試驗在考察提取時間對蘆丁和槲皮素提取率的影響時發(fā)現(xiàn)，提取時間越長，溫度始終保持恒定，但主要成分的提取率有所下降，因此在響應面設計中不考慮提取時間的影響。同時在提取過程發(fā)現(xiàn)提取3次可使有效成分完全浸出，故每個平行試驗均提取3次。響應面法是國內(nèi)外常用的試驗分析方法，采用非線性模型擬合，準確性高，實驗精度優(yōu)于正交設計，試驗預測值能更好地考察參數(shù)合理性和試驗設計的準確性［21］。本試驗首次采用響應面法優(yōu)化光枝勾兒茶蘆丁和槲皮素的提取條件，響應面分析表明，高濃度的乙醇有利于蘆丁的提取，但在工業(yè)化生產(chǎn)中使用高濃度乙醇成本較高，因此在后續(xù)試驗中應降低乙醇體積分數(shù)來考察蘆丁和槲皮素的最優(yōu)提取條件。

光枝勾兒茶的復方制劑在臨床上已有許多運用，本試驗的提取工藝為光枝勾兒茶蘆丁和槲皮素的開發(fā)利用提供了理論支持，但粗提物成分復雜，難以確定各成分的生物活性，在后續(xù)的研究中，項目組應對該藥材的化學成分和藥理作用進行研究，明確各化學成分的活性，使該藥材在開發(fā)利用和臨床研究上具有重要意義。

［1］ 江蘇新醫(yī)學院. 中藥大辭典［M］. 上海：上?？茖W技術出版社，2000：2067-2068.

［2］ 何順志，徐文芳. 貴州中草藥資源研究［M］. 貴陽：貴州科技出版社，2007：430.

［3］ 陳立，董俊興. 勾兒茶屬植物化學成分及其生物活性研究進展［J］.中草藥，2006，37 （4）：627-630.

［4］ 景永帥，吳蘭芳，張振東，等. 光枝勾兒茶提取物的抗氧化活性［J］. 中國老年學雜志，2011，3（7）：1179-1180.

［5］ 孫常松，李瑪琳. 五環(huán)三萜類化合物抗腫瘤活性及其機制研究進展［J］. 中國民族民間醫(yī)藥，2009，18（12）：14-15．

［6］ 滕紅麗，李 璉，鐘鳴，等. 復方紅豆杉膠囊治療肝癌60例臨床研究［J］. 中醫(yī)雜志，2006，47（4）：277-279．

［7］ 路衛(wèi)星. 中藥止痢散防治仔豬腹瀉病的試驗［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（6）：111-112.

［8］ 吳玉強，楊 興，鄧家剛，等. 鐵包金提取物鎮(zhèn)痛抗炎作用的研究［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2008，19（4）：825-826．

［9］ 賈強，王芳，梁明亮，等. 一種具有抗菌、抗炎及鎮(zhèn)痛功能的制劑及其制備方法［P］. 中國，CN 104586973 A. 2015-01-06.

［10］ 王玉坤，馮 將，魏玉好，等. 止痢散及其拆方對胃腸運動的影響［J］. 中國獸藥雜志，2016，50（7）：57-61.

［11］ 姜玲玲，陳鴻宇，史開志. 一種新獸用止瀉中藥復方制劑對大鼠的急性及亞慢性毒性試驗［J］. 中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（11）：3073-3079.

［12］ 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳. 廣西中藥材標準［M］. 南寧：廣西科學技術出版社，1990：9，260-261.

［13］ 宋浩銘，容 庭，劉志昌，等. 響應曲面法優(yōu)化芒果葉中總黃酮的超聲提取工藝［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2016（2）：116-122.

［14］ 何微，朱捷. 枸杞葉中總黃酮及蘆丁提取工藝的研究［J］，當代化工. 2015，11（44）：2723-2725.

［15］ 武玉祥，王小平，王 虹，等. HPLC法檢測光枝勾兒茶內(nèi)蘆丁和槲皮素方法的建立［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2016，44（13）：164-166.

［16］ 鄭丹丹，王京龍，王占一，等. 石榴葉總黃酮的提取工藝及抗氧化活性考察［J］. 中國實驗方劑學雜志，2016，22（3）：12-16.

［17］ 唐浩國. 黃酮類化合物研究［M］. 北京：科學出版社，2009：16-17，48-55.

［18］ R V Muralidhar，R R Chirumamila，R Marchant，et al. A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources［J］.Biochemical Engineering Journal，2001，9（1）：17-23.

［19］ 劉曉靜，黃 菊，何偉平. 紅棗蘆丁提取的最佳工藝研究［J］. 食品與藥品，2016，18（5）：335-338.

［20］ 柯發(fā)敏，余 昕，侯杰榮，等. 趕黃草中槲皮素的提取工藝研究［J］. 廣東化工，2016，15（43）：29-30.

［21］ 蘇拓彤，劉 英，徐佳麗，等. 應用Box-Behnken設計優(yōu)化地榆皂苷的閃式提取工藝研究［J］.中草藥，2012，43（3）：501-504.

（責任編輯 崔建勛）

Extraction optimization of main ingredients from Berchemia polyphylla var. leioclada.

TANG Yuan-jiang1，2，SHANG Yi-shun1，ZHOU Si-xuan1，YANG Yue-qian1，2，ZHANG Tao1，YU Bo1，2
（1.Guizhou Hongyu Animal Husbandry Technology Development Ltd，Guiyang 550005，China；2. Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Guiyang 550005，China）

R284.2

A

1004-874X（2017）06-0114-06

唐遠江，尚以順，周思旋，等.光枝勾兒茶主要成分提取工藝的優(yōu)化［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（6）：114-119.

2017-04-21

貴州省科學技術重大專項（黔科合[2013]6014）；貴州省農(nóng)業(yè)科技計劃建設項目（黔科合農(nóng)G字[2015]4001）

唐遠江（1987- ），男，碩士，研究實習員，E-mail：tangyjjay0909@126.com

余波(1981- )，男，碩士，副研究員，E-mail：yubonky@163.com