廖德芳，苗海生，李華春，高 林，寇美玲，李 樂(lè)

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

應(yīng)用qRT-PCR方法快速定量藍(lán)舌病抗原的研究

廖德芳，苗海生，李華春，高 林，寇美玲，李 樂(lè)

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

在疫苗生產(chǎn)中需要對(duì)培養(yǎng)病毒的有效抗原數(shù)量進(jìn)行定量，對(duì)其一般采用TCID50測(cè)定或噬斑滴定的方法。這些傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)是耗時(shí)、重復(fù)性差異較大。本研究采用qRT-PCR檢測(cè)藍(lán)舌病病毒含量，并用準(zhǔn)確滴定噬斑單位的藍(lán)舌病病毒作為對(duì)照，比較待檢樣品和對(duì)照的Ct值，通過(guò)線性方程計(jì)算待檢樣品的病毒含量。對(duì)7個(gè)獨(dú)立樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性均高于噬斑分析方法，并且可在藍(lán)舌病病毒培養(yǎng)過(guò)程中實(shí)時(shí)檢測(cè)病毒含量。該方法操作簡(jiǎn)單、快捷，可在病毒生產(chǎn)過(guò)程即時(shí)檢測(cè)病毒含量，在藍(lán)舌病疫苗生產(chǎn)中具有重要意義。

藍(lán)舌??；qRT-PCR；病毒含量

Abstract：Quantitatively amount of cultivated virus in vaccine production was necessary，and the method of TCID50 or plaques titration to quantitative was adopted generally. The shortcomings of these traditional methods were timeconsuming and the repeatability was not strong. The Bluetongue virus content was detected by qRT-PCR，in contrast with accurate titration plaques units of Bluetongue virus as a control in this study. The Ct values of test and control samples were compared，and the concentrations of test samples by the linear equation was estimated. The test results of 7 independent samples showed that the accuracy and repeatability were higher than plaques analysis method. And this method could be applied to real-time detection virus content in the process of virus culture. The method was simple and rapid during the operation，and could detecte virus content in the process of virus culture，which had significance in Bluetongue vaccine production.

key words：Bluetongue；qRT-PCR；virus content

藍(lán)舌病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）須通報(bào)動(dòng)物疫病，是一種主要由庫(kù)蠓傳播的蟲媒病，能夠感染多種偶蹄動(dòng)物。疫苗免疫是控制該病的重要方法。在藍(lán)舌病疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，為了使疫苗生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，需要對(duì)病毒含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，一般采用噬斑單位來(lái)表示病毒含量[1]。但是噬斑測(cè)定方法不僅費(fèi)時(shí)，而且結(jié)果不穩(wěn)定[2-4]。

實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（qPCR）可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，可以結(jié)合相應(yīng)軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。該技術(shù)因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快等優(yōu)點(diǎn)，在基因表達(dá)水平分析、病原體基因的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用，已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸快速檢測(cè)的主要方法之一[5-6]。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)模版的Ct值與該模版的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系[7]。本研究應(yīng)用精確測(cè)定噬斑單位的病毒作為對(duì)照，將病毒原液進(jìn)行5倍比稀釋，分別提取病毒核酸進(jìn)行型特異的反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光RTPCR（qRT-PCR），檢測(cè)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得回歸方程。利用該方法對(duì)8個(gè)獨(dú)立樣品進(jìn)行多次檢測(cè)，以驗(yàn)證其結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 qRT-PCR方法

藍(lán)舌病qRT-PCR在ABI FAST7500上進(jìn)行。采用一步法RT-PCR TAKARA RR064A試劑盒（大連寶生物），按照試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)液。采用20 μL體系，每個(gè)反應(yīng)加模版 2 μL、引物 0.4 μL、探針 0.4 μL；反應(yīng)條件為42 ℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95 ℃滅活10 s，45個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)包括95 ℃ 5 s，60 ℃延伸34 s。引物和探針按文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行。引物和探針如下：

BTVF-MH：

5′-TGGAYAAAGCGATGTCAAA-3′

BTVR-MH：

5′-ACATCATCACGAAACGCTTC-3′

BTVP-MH：

5′-FAM-ARGCTGCATTCGCATCGTACGCBHQ1-3′

在進(jìn)行PCR前，對(duì)核酸模版需95 ℃ 6 min解開藍(lán)舌病RNA雙鏈，將其結(jié)果用Ct值表示。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和線性相關(guān)分析

應(yīng)用同一批次收獲的病毒作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，進(jìn)行4次噬斑試驗(yàn)，獲得準(zhǔn)確的噬斑含量，分裝，-80 ℃保存，作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照使用。將標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照連續(xù)5倍比稀釋，稀釋倍數(shù)分別為 1、1/5、1/25、1/125、1/625，用高通量核酸（MagMAX）分別進(jìn)行核酸提取，用qRT-PCR方法檢測(cè)各稀釋度的病毒，獲得Ct值；對(duì)每個(gè)稀釋度重復(fù)測(cè)定3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程Y=A+⊿Ct/B。其中，Y為待檢樣品的噬斑單位（log10），A為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的噬斑單位（log10），⊿Ct為待檢樣品Ct值減標(biāo)準(zhǔn)樣品Ct值，B為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.3 病毒核酸提取

用高通量核酸提取儀進(jìn)行樣品核酸提?。∕agMAX EXPRESS），按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。具體步驟為：50 μL樣品中，加130 μL裂解液、20 μL磁珠，放到第1排孔中；加150 μL清洗液，放入第1～3排孔中；加150 μL清洗液放入第2～5排孔中；第6排孔中，加入核酸洗脫液。選擇相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序提取病毒核酸。

1.4 樣品噬斑測(cè)定方法

將病毒10倍比稀釋后接種于長(zhǎng)滿BHK21單層細(xì)胞的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。每個(gè)稀釋度按200 μL量接種于各孔中，吸附30 min后，加入40 ℃預(yù)熱好的4 mL MEM 1%瓊脂糖混合液（含2%胎牛血清），置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。5 d后，移除覆蓋的瓊脂，利用96%乙醇固定6孔板中的BHK21細(xì)胞，用亞甲基藍(lán)染色干燥。對(duì)每個(gè)稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算病毒的噬斑含量。

1.5 qRT-PCR法檢測(cè)病毒含量驗(yàn)證

對(duì)同一批次病毒液分別進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)和噬斑試驗(yàn)檢測(cè)；每種檢測(cè)各進(jìn)行4次，以驗(yàn)證qRT-PCR方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

對(duì)7個(gè)批次的病毒液分別進(jìn)行噬斑試驗(yàn)檢測(cè)和qRT-PCR試驗(yàn)檢測(cè)，以驗(yàn)證qRT-PCR方法和噬斑試驗(yàn)檢測(cè)方法間的差異性，應(yīng)用T-TEST方法進(jìn)行配對(duì)比較。

1.6 qRT-PCR在病毒接種量分析中的應(yīng)用

先進(jìn)行BHK21細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后將藍(lán)舌病病毒分別接種于2個(gè)長(zhǎng)滿單層BHK21細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶中。接種量分別為：第1組接種100 cell/PUF（每100個(gè)細(xì)胞接種1個(gè)噬斑形成單位）；第2組接種1 000 cell/PUF。每組每天取上清液進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，并計(jì)算病毒含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

噬斑測(cè)定的結(jié)果用log10 PUF/dose來(lái)表示，1個(gè)dose為1 mL；所有qRT-PCR估計(jì)結(jié)果均表示為噬斑含量log10 PUF/dose。采用平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、CV，按標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用SPSS軟件計(jì)算；采用P＜0.05標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行顯著性比較；由SPSS軟件生成統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對(duì)BTV樣品進(jìn)行了4次獨(dú)立的噬斑含量檢測(cè)，結(jié)果分別為5.0、5.1、5.0、5.0，平均值為5.02。采用準(zhǔn)確滴定毒價(jià)的病毒，按5倍倍比稀釋，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；將病毒稀釋成1、1/5、1/25、1/125、1/625共5個(gè)稀釋度，對(duì)每個(gè)稀釋度均用高通量核酸提取儀提取病毒核酸；每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示：回歸曲線的斜率為5.62，相關(guān)性（R）為0.98，有效性（EFF%）為50%。綜合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果（圖1、圖2），得到的直線回歸方程為Y=5.02-⊿Ct/5.62。其中，Y為待檢樣品的噬斑含量，⊿Ct為待檢樣品的Ct減標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的Ct。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照5倍倍比稀釋檢測(cè)Ct值

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.2 qRT-PCR法檢測(cè)病毒含量驗(yàn)證

重復(fù)性和準(zhǔn)確性檢測(cè)結(jié)果顯示，qRT-PCR方法檢測(cè)的噬斑含量平均值為104.5，噬斑試驗(yàn)方法檢測(cè)的結(jié)果為104.27（表1）。qRT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性均高于噬斑測(cè)定方法（標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.05和0.1，CV分別為1.08%和2.32%）。

表1 qRT-PCR方法重復(fù)性和準(zhǔn)確性的分析

差異性檢測(cè)結(jié)果顯示，兩種方法的平均差異為-0.1（95%置信區(qū)間），二者差異在-0.36～0.01，SIG＞0.05。因此，兩種方法沒有顯著性區(qū)別（表2）。

表2 7個(gè)樣品的噬斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果和qRT-PCR估計(jì)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較（t-test）

2.3 qRT-PCR在病毒接種量分析中的應(yīng)用

病毒接種量分析結(jié)果顯示，兩組最佳病毒收獲時(shí)間均為接種后4 d，其中第2組病毒含量最高，達(dá)5.4 PUF/mL；2組的毒價(jià)均在接種后5 d左右開始下降（圖3）。

圖3 100 cell/PUF和1 000 cell/PUF接種的對(duì)比（SPSS17.0中文版）

3 討論

應(yīng)用藍(lán)舌病qRT-PCR方法進(jìn)行病毒抗原含量測(cè)定，能夠快速得到病毒含量檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)噬斑分析方法比較，無(wú)顯著性差異，但其重復(fù)性、準(zhǔn)確性均高于噬斑分析方法。此外，該方法可在藍(lán)舌病疫苗生產(chǎn)中針對(duì)病毒培養(yǎng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)病毒含量。目前，部分國(guó)家已在生產(chǎn)活疫苗時(shí)采用該方法進(jìn)行抗原定量，并取得了很好的應(yīng)用效果[8-9]。

傳統(tǒng)的病毒含量檢測(cè)方法中，最常用的是采用稀釋核酸的方法來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以核酸拷貝數(shù)來(lái)計(jì)算病毒含量。本研究建立的方法是先將病毒稀釋再進(jìn)行核酸提取，進(jìn)而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。雖然在數(shù)值的相關(guān)性上比用稀釋核酸法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線差，但在實(shí)際樣品的檢測(cè)中，該方法更接近實(shí)際病毒液狀態(tài)，其準(zhǔn)確性更高，誤差更低（CV為1%）。同時(shí)，采用直接病毒稀釋繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠減少合成DNA表達(dá)的步驟，縮短qPCR定量方法的研究時(shí)間。在藍(lán)舌病這種毒株血清型較多的疫病研究中，該方法可將結(jié)果快速應(yīng)用于藍(lán)舌病的26個(gè)血清型中，只需要1個(gè)滴度標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，而不需要每個(gè)血清型各表達(dá)1個(gè)cDNA克隆。

本研究應(yīng)用qRT-PCR定量方法進(jìn)行了100 cell/PUF和1 000 cell/PUF接種量的對(duì)比，只需2 h便可獲得結(jié)果。通過(guò)數(shù)據(jù)分析認(rèn)為，利用1 000 cell/PUF接種量，4 d后收獲病毒，效果較好。應(yīng)用qRT-PCR方法進(jìn)行病毒抗原含量測(cè)定，能夠?qū)崿F(xiàn)即時(shí)檢測(cè)，如進(jìn)行病毒培養(yǎng)中的生長(zhǎng)曲線繪制，而傳統(tǒng)方法由于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，很難獲得準(zhǔn)確結(jié)果。因此，該方法在疫苗生產(chǎn)中具有一定的實(shí)用價(jià)值，可為藍(lán)舌病疫苗生產(chǎn)中病毒接種量的標(biāo)準(zhǔn)化和病毒收獲時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)化提供了理論依據(jù)。

[1] SMITH EM，ESTES M K，GRAHAM D Y，et al. A plaque assay for the Simian rotavirus SAII[J]. J. Gen. Virol.1979，43（3）：513-519.

[2] FUKUDA A，SENGUN F，SARPAY H E，et al.Parameters for plaque formation in potency assay of Japanese measles Vaccine[J]. Journal of virological methods，1996，61（2）：1-6.

[3] HOFMANN M，GRIOT C，CHAIGNAT V，et al.Bluetongue disease reaches Switzerland[J]. Schweiz Arch Tierheilkd，2008，150（2）：49-56.

[4] TODD R，PAMELA K M，DANIEL B J，et al.Development and application of a quantitative RT-PCR potency assay for a pentavalent rotavirus vaccine[J]. Journal of virological methods，2006，131（2）：193-201.

[5] 宋志軍，宋長(zhǎng)緒，楊增岐，等. 豬生殖與呼吸綜合征病毒TaqMan熒光定量RT -PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（2）：98-102.

[6] SCHALK J A，VAN D E C，OVELG?NNE H，et al.Estimation of the number of infectious measles viruses in live virus vaccines using quantitative real-time PCR[J]. Journal of virological methods，2004，117（2）：179-187.

[7] HIGUCHI R，F(xiàn)OCKLER C，DOLLINGER G，et al. Kinetic PCR analysis：real-time monitoring of DNA amplifications[J].Biotechnology，1993，11（9）：1026-1030.

[8] Roussel Y，Harris A，Ming H L，et al. Novel methods of quantitative real-time PCR data analysis in a murine Helicobacter pylori vaccine model[J]. Vaccine，2007，25（15）：2919-2929.

[9] LIU C C，CHANG H W，YANG G，et al. Development of a quantitative enzyme linked immunosorbent assay for monitoring the Enterovirus 71 vaccine manufacturing process[J]. Journal of virological methods，2011，176（1/2）：60-68.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

The Rapid Quantitative Research of Bluetongue Antigen by qRT-PCR

Liao Defang，Miao Haisheng，Li Huachun，Gao Lin，Kou Meiling，Li Le
（Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Disease Laboratory，Yunnan Animal Science and Veterinary Institute，Kunming，Yunan 650224）

S851.3

A

1005-944X（2017）10-0090-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.024

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303035）；云南省技術(shù)創(chuàng)新人才培養(yǎng)對(duì)象（2013HB130）；云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016FA005）

并列第一作者：廖德芳、苗海生

李 樂(lè)