王海艷，趙林立，趙治國(guó)，郭文秀，陳宇飛，劉 佳，任彩霞，敖威華，馬彩霞

（內(nèi)蒙古出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020）

布魯氏菌野毒株A544和疫苗株104M差異蛋白的表達(dá)及抗體制備

王海艷，趙林立，趙治國(guó)，郭文秀，陳宇飛，劉 佳，任彩霞，敖威華，馬彩霞

（內(nèi)蒙古出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020）

選取布魯氏菌差異蛋白部分基因序列，將其克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1中；經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和序列測(cè)定，得到重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-bru；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，用1 mmol/L 異丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）對(duì)轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并用表達(dá)蛋白制備多克隆抗體。結(jié)果：差異蛋白在體外獲得了高效表達(dá)，表達(dá)融合蛋白分子量約為35 kD；誘導(dǎo)5 h后表達(dá)量最高，占菌體總蛋白的30%左右；表達(dá)蛋白能與多克隆抗體發(fā)生免疫印跡反應(yīng)，證明所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。該研究結(jié)果為免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

差異蛋白；布魯氏菌野毒株A544；布魯氏菌疫苗株104M；表達(dá)；抗體制備

Abstract：The variant protein gene from Brucella bovis virulent strain was cloned into the pGEX-6p-1 expression vector. The recombinant plasmid pGEX-6p-1-bru was transformed into E coli Rosetta（DE3）for expression after being identified by PCR，enzyme digestion and sequencing. The transformed bacteria were cultivated and induced with 1 mmol/L isoproyhhio-B-D-galactoside（IPTG），and polyclonal antibody was prepared by the expression protein.The results showed the variant protein was expressed efficiently in fusion protein form，the molecular weight of the fusion protein was 35 kD，the expression level of the fusion protein was the highest after exposure to IPTG for 5 h and accounted for approximately 30% of the total cellular proteins. The expression protein could react with polyclonal antibody，showing that the recombinant protein had a good immunogenicity. This result was a better basic for immunological detection research on Brucellosis.

Key words：variant protein；Brucella bovis virulent strain A544；Brucella abortus vaccine strain 104M；expression；antibody preparation

布魯氏菌?。ㄒ韵潞?jiǎn)稱布病）為人獸共患傳染病，是我國(guó)二類傳染病，主要引起母畜流產(chǎn)及其他并發(fā)癥[1]。1990年，布魯氏菌在海洋哺乳動(dòng)物中被分離到，從而改變了人們一直認(rèn)為布病主要在陸地動(dòng)物中分布的認(rèn)識(shí)，也使人們對(duì)布病的控制措施進(jìn)行了相應(yīng)調(diào)整[2]。自20世紀(jì)90年代開始，布病疫情有回升勢(shì)頭。全球40～50個(gè)國(guó)家和地區(qū)的布病疫情出現(xiàn)不同程度的波動(dòng)。目前，布病疫情回升的地區(qū)主要集中在非洲、亞洲、南美洲及歐洲的部分地區(qū)[3]。目前，全球布病患病總?cè)藬?shù)約有600萬(wàn)，年新發(fā)病人數(shù)約50萬(wàn)[4-5]。

為了建立布病自然感染與疫苗免疫的鑒別診斷方法，本研究先利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，選出野毒株A544和疫苗株104M差異蛋白；然后在A544株中高表達(dá)的赤蘚糖醇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子（蛋白編碼BruAb2-0365）蛋白中，選出與其它野毒株同源性高、與疫苗株同源性低、抗原表位信號(hào)強(qiáng)、包含重要抗原決定簇的序列部分片段，利用pGEX-6P-1表達(dá)載體，對(duì)其進(jìn)行體外表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 載體、菌株

表達(dá)載體pGEX-6P-1質(zhì)粒、表達(dá)菌株Rosetta（DE3），均購(gòu)自上海基音生物有限公司。

1.2 主要試劑

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶及BamH I和 XholI限制性內(nèi)切酶，購(gòu)自Takara公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒與膠回收試劑盒，購(gòu)自Takara公司；羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）緩沖溶液，購(gòu)自Sigma公司；重組蛋白純化系統(tǒng)GSTrap FF，購(gòu)自美國(guó)GE公司；LB培養(yǎng)基，購(gòu)自陸橋公司；葡聚糖凝膠G-20000，購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑廠；弗氏完全佐劑（CAF）和弗氏不完全佐劑（IAF），購(gòu)自GIBCO公司；硫酸銨，購(gòu)自中國(guó)金山化工廠。

1.3 開放閱讀框的選擇與引物設(shè)計(jì)合成

對(duì)選取的序列（GGGTGCGACCTCGCAATAATCGAGGCCGTAAAGATCGGCCAGACGGTTTTCCAGATCGATGCATTCGGTGATGTCACCGTCGATGGTCACTTTCACCGCGCCGTCGGCAACGGCCTTGGCGATGAGACGATGCGCTTTCACCGAAGGCAGGCCAAGGCGCTTGGCAACGGCAGACTGAGTCATGCCGGCGACGAAATGAAGCCAGGCGGCGCGAAGCGCCAGAGAATCGTCTGCATCTGC）上游加起始密碼子（ATG）和EcoRI酶切位點(diǎn)（GAATTC），下游加X(jué)ho I酶切位點(diǎn)（CTCGAG）。利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增此片段的引物：上游引物為5′-GAATTCATG GCAGCTCTCCTTGTAG-3′，下游引物為5′-CTCGAGGCAGATGCAGACGATT-3′。引物由上?；羯镉邢薰竞铣?。

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以布魯氏菌野毒株A544的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，BamH I/XholI雙酶切回收純化后，將其定向連接到經(jīng)EcoR I/XholI雙酶切的pGEX-6p-1表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21（DE3）Plys細(xì)胞中；對(duì)提取的質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定正確后，選取陽(yáng)性菌進(jìn)行測(cè)序；將重組質(zhì)粒命名為pGEX-6p-1-bru。PCR鑒 定 反 應(yīng) 體 系：Ex Taq（5 U/μL）0.5 μL、10×Ex Taq Buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）5 μL、 上 下 游 引 物（25 nmol/μL） 各 1 μL、質(zhì)粒 0.5 μL，加水至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；94℃ 45 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。酶切鑒定反應(yīng)體系：10×Buffer for EcoR I 2 μL，EcoR I 和 XholI酶各 0.5 μL，BSA 0.5 μL、質(zhì)粒 7 μL，加水至20 μL。

1.5 pGEX-6p-1-bru重組蛋白不同時(shí)間的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳分析

用陽(yáng)性重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-bru（或空質(zhì)粒pGEX-6p-1）轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，將其加入到10 mL含氨芐青霉素的液體LB中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜增菌。取3 mL細(xì)菌培養(yǎng)物接種到50 mL含氨芐青霉素的LB中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0時(shí)，加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別于2、3、4 、5 h后，各取1.5 mL菌液離心，收集細(xì)菌沉淀，用PBS洗2遍；加入150 μL 1×SDS-PAGE凝膠加樣緩沖液，煮沸10 min；冰浴5 min后，取15 μL經(jīng)15 %分離膠的SDS-PAGE電泳分析。將未加入誘導(dǎo)劑的細(xì)菌培養(yǎng)液培養(yǎng)5 h，作空白對(duì)照。

1.6 重組蛋白的親和純化

按照GSTrap FF親和純化系統(tǒng)的操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 多克隆抗體的制備

簡(jiǎn)單步驟：將蛋白大量表達(dá)，并用蛋白純化柱進(jìn)行純化；取500 μg純化蛋白溶于2 mL 弗氏完全佐劑中，使之充分乳化；皮下多點(diǎn)注射新西蘭家兔。加強(qiáng)免疫時(shí)用弗氏不完全佐劑，抗原劑量為首次的1/4。每2～3周加強(qiáng)免疫1 次。在第1 次加強(qiáng)免疫后2 周，從耳緣靜脈取血2～3 mL，分離血清；用間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，至抗體效價(jià)達(dá)到1:10 000以上。2 周后取血約50 mL，室溫凝固后，4 ℃冷藏4 h，離心分離血清。

1.8 Western blot分析

將細(xì)菌裂解物，經(jīng)SDS-PAGE分析后，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶室溫封閉3 h（或4 ℃過(guò)夜），用PBST洗3次；加多克隆抗體（1:100倍稀釋）室溫作用1 h，PBST緩沖液洗3次；加入羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體 （1:2 500倍稀釋），37 ℃作用30 min，用PBST緩沖液洗3次；在四甲基聯(lián)苯胺（TMB）緩沖溶液中顯色1 min。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物定向連接到pGEX-6p-1表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Rosetta（DE3）細(xì)胞中。對(duì)選取的陽(yáng)性質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定，可擴(kuò)增出約240 bp的片段。酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，測(cè)序結(jié)果也與提供的序列完全一致（圖1、圖2和圖3）。

圖1 陽(yáng)性質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

圖2 陽(yáng)性質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

圖3 陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

2.2 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳及Western blot分析結(jié)果

將不同時(shí)間誘導(dǎo)的菌體裂解后進(jìn)行SDSPAGE電泳及Western blot分析，結(jié)果表明：差異片段在體外獲得了高效表達(dá)，表達(dá)融合蛋白分子量約35 kD，誘導(dǎo)5 h后表達(dá)量最高，占菌體總蛋白的30 %左右；表達(dá)蛋白能與多克隆抗體發(fā)生免疫印跡反應(yīng)，證明所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性（圖4）。

3 討論

目前，外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)較多。其中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、表達(dá)量大、易于純化和工業(yè)化批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)；pGEX-6P-1原核表達(dá)的載體重組蛋白，在折疊時(shí)不易掩蓋被研究蛋白的表位，能夠保持蛋白原本的反應(yīng)性。因此，本試驗(yàn)利用pGEX-6P-1原核表達(dá)載體系統(tǒng)，表達(dá)了以包涵體形式存在的差異蛋白。以包涵體形式表達(dá)的蛋白有其不利的一面：包涵體需要變性溶解、復(fù)性后才能得到溶解的蛋白，而且復(fù)性后蛋白的活性容易降低；但也有其有利的一面：其能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目的蛋白的富集和分離純化。本研究用pGEX-6P-1載體系統(tǒng)中表達(dá)的差異蛋白，經(jīng)變性溶解SDS-PAGE電泳后，用免疫印跡檢測(cè)證明，該重組蛋白依然具有良好的免疫原性。因此，可利用表達(dá)蛋白及制備的多克隆抗體，建立免疫學(xué)檢測(cè)方法。

圖4 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳及Western blot 鑒定結(jié)果

免疫血清質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到使用的效果和研究的成敗，直接影響到試驗(yàn)的準(zhǔn)確性、特異性和敏感性。制備優(yōu)質(zhì)的免疫血清，一方面取決于抗原的種類、純度及其免疫原性；另一方面也取決于動(dòng)物的選擇及動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答的能力。此外，還須考慮注射途徑、抗原劑量、注射次數(shù)、時(shí)間間隔、有無(wú)佐劑以及合理的免疫方法和免疫程序等。

抗原是指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并能與應(yīng)答產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)。一個(gè)完整的抗原應(yīng)包括兩方面的免疫性能：免疫原性，指誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原；免疫反應(yīng)性，指抗原與抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力，亦稱為反應(yīng)原性。有些物質(zhì)在獨(dú)立存在時(shí)，只具有反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性，稱為半抗原，而免疫原通常同時(shí)具有免疫反應(yīng)能力。良好的抗原是產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)免疫血清的重要條件。

動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體的過(guò)程有一定的時(shí)間規(guī)律。一般在首次接觸抗原的7～10 d后，血清中才有抗體出現(xiàn)，并在14～21 d達(dá)到高峰，這段時(shí)間稱為初次反應(yīng)階段。初次應(yīng)答產(chǎn)生的抗體主要是IgM分子，與抗原的結(jié)合力低，為低親和性抗體。若此后一定時(shí)間內(nèi)，再次接觸同一抗原，則特異抗體的量就會(huì)成倍增加，稱為二次反應(yīng)。這個(gè)階段產(chǎn)生的主要為IgG分子，且為高親和性抗體。依據(jù)這一規(guī)律，必須制定合理的免疫次數(shù)和間隔時(shí)間。本研究利用該程序獲得了比較滿意的血清效價(jià)，證明該免疫程序切實(shí)可行。但免疫程序并不是一成不變的，須綜合考慮動(dòng)物的種別、免疫原的種類、免疫途徑及免疫劑量等，必要時(shí)還要根據(jù)具體情況隨時(shí)調(diào)整。

免疫劑量需因動(dòng)物種類、抗原分子大小及免疫方案不同進(jìn)行調(diào)整，可分為微量、中等劑量及大劑量。免疫劑量低于一定限度時(shí)，抗體就不能形成，或不能檢出；超過(guò)一定限度時(shí)，抗體的產(chǎn)生就會(huì)受到抑制，使控制免疫系統(tǒng)的神經(jīng)因過(guò)度興奮轉(zhuǎn)為阻抑，產(chǎn)生“免疫麻痹”。因此，掌握好適當(dāng)?shù)膭┝糠浅ｊP(guān)鍵。

免疫途徑的選擇也是相當(dāng)重要的。通常可采用靜脈、腹腔、皮下、皮內(nèi)或肌肉及足掌等途徑注射抗原。經(jīng)靜脈或腹腔注射的抗原能直接或很快進(jìn)入血流，可在短時(shí)間內(nèi)被清除，因此沒(méi)有足夠的時(shí)間刺激抗體形成細(xì)胞，因而也不能獲得效價(jià)滿意的抗血清。但最后一次的經(jīng)靜脈加強(qiáng)免疫能使抗體水平迅速提升。一般情況下，抗原經(jīng)皮下、皮內(nèi)或肌肉注射后，抗原擴(kuò)散速度很慢，貯留時(shí)間長(zhǎng)，有利于抗體的產(chǎn)生和并可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。因此，在免疫動(dòng)物時(shí)，應(yīng)遵循這一原則，以便得到滿意的高效價(jià)血清，從而為下一步研究奠定基礎(chǔ)。

必須根據(jù)抗原的性質(zhì)采用適當(dāng)?shù)拿庖叻椒āＲ话泐w粒性抗原，如紅細(xì)胞、細(xì)菌體等，通常采用無(wú)佐劑免疫法。本研究針對(duì)應(yīng)用的免疫原采用佐劑免疫法，這有利于減緩抗原在體內(nèi)釋放速度，增加抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，糖醇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子蛋白中抗原表位信號(hào)強(qiáng)的包含重要抗原決定簇的序列部分片段進(jìn)行了表達(dá)，從而為布病自然感染與疫苗免疫的鑒別診斷建立一種行之有效的、快速的檢測(cè)方法提供了參考。

[1] PAPPAS G，PAPADIMITRIOU P. Challenges in brucella bacteraemia[J]. Int J Antimicrob，2007，30（S1）：29-31 .

[2] SELEEM M N，JAIN N，POTHAYEE N，et al. Targeting Brucella melitensis with Polymeric nanoparticles containing streptomycin and doxyeyeline[J]. FEMS Microbiol Lett，2009，294（1）：24-31.

[3] REGUERA J M，ALAREON A，MIRALLES F，et al.Brucella endocarditis: elinieal，diagnostie and ther apeutic approach[J]. Eur J Clin，Microbiol Infect Dis，2003，22：647-650.

[4] PAPPAS G，PAPADIMITRIOU P，AKRITIDIS N，et al. The new global map of human brucellosis[J]. Lancet Infeet Dis，2006，6（2）：91-99.

[5] TALESKI V，ZERVA L，KANTARDJIEV T，et al. An overview of the epidemiology and epizootology brucellosis in selected countries of central and southeast Europe[J]. Vet Microbiol 2002，90（1-4）：147-155.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Expression and Antibody Preparation of Variant Protein between Brucella bovis Virulent Strain A544 and Brucella abortus Vaccine Strain 104M

Wang Haiyan，Zhao Linli，Zhao Zhiguo，Guo Wenxiu，Chen Yufei，Liu Jia，Ren Caixia，Ao Weihua，Ma Caixia
（Inner Mongolia Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Huhhot，Inner Mongolia 010020）

S852.65

A

1005-944X（2017）10-0060-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.018

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃（2012IK014、2016IK165）