韓東，杜煒，劉東海，林慶祿

(1 單縣中心醫(yī)院，山東菏澤274300；2 濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院；3 中國(guó)人民解放軍第88醫(yī)院)

食管鱗癌組織miR-106b、Smad7表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

韓東1，杜煒1，劉東海2，林慶祿3

(1 單縣中心醫(yī)院，山東菏澤274300；2 濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院；3 中國(guó)人民解放軍第88醫(yī)院)

目的探討組織微小RNA-106b (miR-106b)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7(Smad7)在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法選擇食管鱗癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織各97例份。采用qRT-PCR法檢測(cè)食管鱗癌組織及癌旁正常組織miR-106b、Smad7 mRNA表達(dá)，分析二者的關(guān)系及其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果食管鱗癌組織miR-106b相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織，Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織(P均<0.05)。相關(guān)性分析顯示，食管鱗癌組織miR-106b與Smad7表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.778，P<0.05)。miR-106b、Smad7表達(dá)與食管鱗癌患者臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤直徑及浸潤(rùn)深度均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。生存分析顯示，miR-106b高表達(dá)、Smad7低表達(dá)患者預(yù)后較差(P均<0.05)。結(jié)論miR-106b、Smad7異常表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，Smad7可能是miR-106b的負(fù)性調(diào)控靶基因。

食管腫瘤；鱗狀細(xì)胞癌；微小RNA-106b；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7

食管癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)以食管鱗狀細(xì)胞癌(以下稱(chēng)食管鱗癌)為主[1]。目前，食管癌的治療主要是以手術(shù)、化療、放療等為主的綜合治療，雖然已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但患者預(yù)后仍然較差[2]，絕大多數(shù)患者死于腫瘤的復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來(lái)，分子靶向治療在惡性腫瘤的治療中取得了一定成果，但迄今為止尚無(wú)對(duì)食管癌有效的靶向藥物。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7(Smad7)是抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(Smad)蛋白，可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，在細(xì)胞和組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用[3]，其異常表達(dá)可能參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。近年研究發(fā)現(xiàn)，Smad7與微小RNA(miRNA)關(guān)系密切[4，5]。miR-106b是miRNA家族成員之一，有研究證實(shí)，miR-106b可通過(guò)作用于Smad7調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[6，7]。但miR-106b、Smad7在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況目前研究甚少。本研究探討miR-106b、Smad7在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年1月～2010年12月濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院收治的食管鱗癌患者97例。所有患者行食管癌根治術(shù)，術(shù)后組織病理檢查明確診斷，臨床資料及術(shù)后隨訪資料完整。排除術(shù)前接受過(guò)任何抗腫瘤治療者或合并有其他器官惡性腫瘤者。其中，男70例、女27例，年齡(64.11±4.59)歲，腫瘤直徑：≥5 cm 46例、<5 cm 51例，臨床分期：Ⅰ期4例、Ⅱ期50例、Ⅲ期43例；組織分化程度：低分化40例、中高分化57例；浸潤(rùn)深度：黏膜或黏膜下層9例、肌層或外膜88例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例。本研究經(jīng)濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

1.2 食管鱗癌組織及其癌旁正常組織miR-106b、Smad7 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。取食管鱗癌患者術(shù)后癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣3～5 cm)石蠟包埋標(biāo)本，按照RNeasy石蠟包埋組織RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度，A260/A280為1.9～2.1。根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物序列：miR-106b上游引物：5′-TTTTCGCCCTTAGC-GTGAAGA-3′，下游引物： 5′-GAGGCAGTCGAAGCT-CTCG-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物： 5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-T-3′；Smad7上游引物：5′-TGAGGGUGACCCAATUG-TTTAG-3′，下游引物：5′-GACAGUUUATGTUGTTGGT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物： 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。PCR反應(yīng)體系共15 μL：cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL、Ultra SYBR Mixture 7.5 μL，DEPC水5.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共40個(gè)循環(huán)。分別以U6、GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-106b、Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。分析miR-106b與Smad7表達(dá)的關(guān)系及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.3 預(yù)后情況 所有患者術(shù)后接受隨訪，隨訪截至2016年12月。以手術(shù)日開(kāi)始至末次隨訪時(shí)間計(jì)算生存時(shí)間，研究結(jié)束、失訪及其他原因死亡作為終點(diǎn)事件。以食管鱗癌組織miR-106b、Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量的均值為臨界值，采用Kaplan-Meier法分析miR-106b、Smad7高表達(dá)及低表達(dá)者的預(yù)后情況。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織及其癌旁正常組織miR-106b、Smad7 mRNA表達(dá)比較 食管鱗癌組織miR-106b、Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.98±0.15、0.28±0.09，癌旁正常組織分別為1.02±0.03、1.03±0.02，二者比較P均<0.05。

2.2 食管鱗癌組織miR-106b與Smad7表達(dá)的關(guān)系 食管鱗癌組織miR-106b相對(duì)表達(dá)量與Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.778，P<0.05)。

2.3 miR-106b、Smad7表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見(jiàn)表1。

2.4 miR-106b、Smad7表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系 97例患者中miR-106b高表達(dá)55例、低表達(dá)42例，Smad7高表達(dá)40例、低表達(dá)57例。Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-106b高表達(dá)、Smad7低表達(dá)患者預(yù)后較差(P均<0.05)。

3 討論

miRNA是一組高度保守的非編碼單鏈小RNA分子，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸,可特異性與下游靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細(xì)胞增殖、凋亡等生理及病理過(guò)程[8,9]。已有研究證實(shí)，食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展與某些miRNA關(guān)系密切[10,11]。miR-106b是miR-106b～25基因簇家族成員之一，其定位于人染色體7q22，在多種惡性腫瘤中具有癌基因作用，如肝癌、胃癌、喉癌等[12～14]。Smad蛋白家族是TGF-β信號(hào)通路途徑中的中心轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)[15]，而TGF-β信號(hào)通路是EMT中最關(guān)鍵的信號(hào)通路[16]。Smad7是Smads家族的主要成員之一，是TGF-β/Smad信號(hào)通路負(fù)性調(diào)控的主要承擔(dān)者，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[4,5,17,18]。Salot等[19]研究發(fā)現(xiàn)，提高TGF-β通路的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)控因子Smad7的表達(dá)能夠明顯抑制乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。但目前miR-106b、Smad7在食管鱗癌組織中表達(dá)的研究甚少。

表1 miR-106b、Smad7表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：miR-106b、Smad7表達(dá)與食管鱗癌患者臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組織miR-106b相對(duì)表達(dá)量均高于癌旁正常組織，與Xiao等[20]研究結(jié)果一致； 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-106b表達(dá)與患者臨床分期、組織分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示miR-106b與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移可能有關(guān)。miR-106b參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)信號(hào)通路。有研究證實(shí)，miR-106b在乳腺癌中可通過(guò)SIX1抑制Smad7，從而激活下游TGF-β通路，導(dǎo)致上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[7]。Yu等[6]研究證實(shí)，胃癌組織中miR-106b表達(dá)與Smad7表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，共同參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。目前，關(guān)于食管癌組織miR-106b與Smad7表達(dá)的關(guān)系尚不明確。本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組織miR-106b與Smad7表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Smad7表達(dá)與患者臨床分期、組織分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示miR-106b與Smad7共同參與了食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；miR-106b有可能通過(guò)負(fù)性調(diào)控Smad7在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起調(diào)節(jié)作用，有可能成為食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的分子標(biāo)志物及可能的基因治療靶點(diǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-106b高表達(dá)的乳腺癌、肝癌等患者生存時(shí)間較短，預(yù)后較差[21，22]；Smad7低表達(dá)的前列腺癌患者生存時(shí)間較短，預(yù)后較差[23]。本研究結(jié)果顯示，miR-106b高表達(dá)、Smad7低表達(dá)者預(yù)后較差。提示miR-106b、Smad7表達(dá)與惡性腫瘤患者的預(yù)后有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)食管鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)。

綜上所述，食管鱗癌組織中miR-106b高表達(dá)、Smad7低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；miR-106b、Smad7表達(dá)與食管鱗癌組織分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)；二者可能共同參與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，Smad7可能是miR-106b的負(fù)性調(diào)控靶基因。

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林慶祿(E-mail: lin_1011peony@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.032

R571

B

1002-266X(2017)32-0095-03

2017-02-12)