廖誠(chéng)誠(chéng)，馮珍，黃菲菲，陳琴

迷走神經(jīng)電刺激對(duì)腦外傷昏迷大鼠意識(shí)及前額葉皮質(zhì)γ-氨基丁酸b1受體表達(dá)的影響①

廖誠(chéng)誠(chéng)，馮珍，黃菲菲，陳琴

目的 研究迷走神經(jīng)電刺激(VNS)對(duì)腦外傷(TBI)昏迷大鼠的促醒效果及其機(jī)制。方法 168只健康Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為空白組、TBI組、拮抗劑組和VNS組，每組42只?？瞻捉M不做任何處理，TBI組、VNS組、拮抗劑組撞擊法復(fù)制腦外傷模型，造模后昏迷至少30 min的大鼠入選。VNS組予VNS，拮抗劑組側(cè)腦室注射Orexin A受體1拮抗劑SB334867后加VNS，TBI組予假VNS。分別于干預(yù)后6 h、12 h、24 h觀察大鼠意識(shí)水平，應(yīng)用免疫組化、Western blotting檢測(cè)前額葉皮質(zhì)γ-氨基丁酸b1受體(GABAb1R)表達(dá)水平。結(jié)果 最終空白組42只、TBI組11只、拮抗劑組13只、VNS組28只大鼠覺(jué)醒。Western blotting顯示，干預(yù)后12 h、24 h，GABAb1R蛋白表達(dá)TBI組＞拮抗劑組＞空白組＞VNS組(F＞60.412,P＜0.001)。免疫組化顯示，GABAb1R蛋白表達(dá)TBI組＞拮抗劑組＞VNS組＞空白組(H=15.121,P=0.002)，但不同時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著性差異(H=3.028,P=0.220)。結(jié)論 VNS可促TBI昏迷大鼠覺(jué)醒，其促醒機(jī)制可能與OrexinA介導(dǎo)大鼠前額葉皮質(zhì)GABAb1R表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。

腦外傷；昏迷；迷走神經(jīng)電刺激；促醒；γ-氨基丁酸b1受體；大鼠

腦外傷(traumatic brain injury,TBI)昏迷是世界范圍內(nèi)的重大健康與社會(huì)問(wèn)題，更對(duì)患者本人及家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。TBI住院患者中，約15%出院時(shí)仍處昏迷狀態(tài)[2]。

目前，臨床上用于TBI昏迷促醒的神經(jīng)刺激方法包括經(jīng)顱直流電刺激、經(jīng)顱磁刺激、頸部脊髓硬膜外刺激、正中神經(jīng)電刺激和深部腦刺激等[3-4]，但效果不明顯或副作用大。近年來(lái)，迷走神經(jīng)電刺激(vagus nerve stimulation,VNS)被認(rèn)為具備促醒潛能[5-6]。

VNS是將電極纏繞在左側(cè)頸部迷走神經(jīng)上，通過(guò)脈沖發(fā)生器產(chǎn)生電流，刺激迷走神經(jīng)，直接調(diào)節(jié)皮層重要區(qū)域的功能。VNS被應(yīng)用于許多神經(jīng)精神疾病，特別是癲癇；VNS還可用于改善心功能、認(rèn)知功能，調(diào)節(jié)情緒等[7]。

γ-氨基丁酸 b1 受體(γ-aminobutyric acid b1 receptor,GABAb1R)與意識(shí)抑制狀態(tài)密切相關(guān)[8-9]，Orexin A則在睡眠-覺(jué)醒狀態(tài)轉(zhuǎn)變中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。

本研究觀察VNS對(duì)TBI昏迷的促醒作用，同時(shí)探究前額葉皮質(zhì)GABAb1R及Orexin A是否參與VNS促醒機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

無(wú)特定病源體健康Sprague-Dawley大鼠168只，雌雄不限，體質(zhì)量250～300 g，由南昌大學(xué)動(dòng)物科學(xué)部提供。室溫控制在23℃，自然光照，常規(guī)飼養(yǎng)，大鼠自由進(jìn)食飲水。

大鼠編號(hào)001～168，利用隨機(jī)數(shù)字表分為4組，每組42只。空白組不做任何處理，TBI組造模后予假VNS處理，VNS組造模后予VNS，拮抗劑組造模后側(cè)腦室注射Orexin A受體1(Orexin A receptor 1,OXR1)拮抗劑SB334867并予VNS。若實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠死亡，則選擇新大鼠補(bǔ)充后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

大鼠飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)遵守本地實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要儀器及試劑

ZS-BS腦立體定位儀：北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司。ES-420電刺激儀：日本伊藤超短波株式會(huì)社。RM2015切片機(jī)：LEICA公司。5804-R低溫高速離心機(jī)：EPPENDOF公司。ChemiDocTMMP Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)：北京博雅創(chuàng)新科技發(fā)展有限公司。CWB10組織蛋白抽提試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司?？笹ABAb1R抗體(ab131417)、免疫組化用兔抗GABAb1R抗體(ab75239)：ABCAM有限公司。抗β-actin單克隆抗體(TA-09)、山羊抗大鼠IgG(ZB-2305)、山羊抗兔IgG(ZB-2301)及相關(guān)二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SB334867：北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司。Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑、化學(xué)發(fā)光底物：天根生化科技有限公司。

1.3 造模

采用自由落體撞擊法構(gòu)建TBI動(dòng)物模型[11]。大鼠置玻璃標(biāo)本缸內(nèi)，注入乙醚1～2 ml，1～1.5 min后，大鼠出現(xiàn)軟癱，晃動(dòng)標(biāo)本缸大鼠無(wú)反應(yīng)但有呼吸時(shí)，立即取出，麻醉成功。頭頂部備皮消毒，切開(kāi)并分離頭頂部皮膚、骨膜，暴露頂骨；以顱頂冠狀縫與人字縫交點(diǎn)為中點(diǎn)，固定一鐵制圓板。待Sprague-Dawley大鼠恢復(fù)后爪疼痛刺激反射時(shí)，將直徑10 mm、質(zhì)量400 g圓柱形金屬撞擊錘從40～44 cm高度沿垂直金屬桿自由下落，撞擊鐵質(zhì)圓盤上。下落高度依據(jù)大鼠體質(zhì)量整，金屬桿每隔1 cm開(kāi)口，以減少下落時(shí)管內(nèi)空氣阻力。30 min后根據(jù)大鼠的感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)情況[12]，將大鼠意識(shí)狀態(tài)分6級(jí)：Ⅰ級(jí)，籠內(nèi)正?；顒?dòng)；Ⅱ級(jí)，籠內(nèi)活動(dòng)減少；Ⅲ級(jí)，籠內(nèi)活動(dòng)減少，能站立但運(yùn)動(dòng)失調(diào)；Ⅳ級(jí)，翻正反射存在但不能站立；Ⅴ級(jí)，翻正反射消失，后爪疼痛反射存在；Ⅵ級(jí)，疼痛反射消失。大鼠Ⅴ級(jí)、Ⅵ級(jí)持續(xù)至少30 min被認(rèn)為是昏迷狀態(tài)。

1.4 側(cè)腦室注射SB334867

拮抗劑組昏迷時(shí)間達(dá)30 min，即造模成功后，立即側(cè)腦室注射。大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥位，頭部固定于腦立體定位儀上，頭頂皮膚剃毛消毒。正中切口，長(zhǎng)約1 cm。剝離顱骨上附屬組織，清除顱骨表面血跡，暴露前囟，在前囟后1.0 mm、中線旁開(kāi)1.5 mm，用牙科鉆鉆孔至硬腦膜，消毒針尖刺破硬腦膜，垂直插入約4.5 mm，微量注射器以2.5 μl/min速度注入 SB334867 溶液5 μl(SB334867粉末10 mg/kg溶于60∶40 DMSO中)；留針2 min后拔針?？p合頭皮，消毒后返籠。

1.5 VNS

拮抗劑組側(cè)腦室注射完畢，VNS組與拮抗劑組大鼠同時(shí)開(kāi)始VNS。大鼠仰臥位固定，清除頸毛。沿正中線在大鼠喉和胸骨之間開(kāi)一個(gè)長(zhǎng)2.5～4 cm切口，將胸骨舌骨肌與胸骨甲狀肌用止血鉗分離并固定；定位頸動(dòng)脈鞘，固定頸部皮膚和肌肉，止血鉗鈍性分離左側(cè)迷走神經(jīng)3～4 cm。打開(kāi)電刺激儀，將電極連接到左迷走神經(jīng)。刺激參數(shù)：頻率20 Hz，脈寬0.5 ms，電流1.0 mA，開(kāi)30 s、關(guān)5 min，循環(huán)10次，刺激總時(shí)間5 min[13]。移除電極，消毒傷口，縫合，放回籠內(nèi)。

TBI組行相同手術(shù)，但無(wú)電流輸出。

1.6 觀察指標(biāo)

VNS結(jié)束后6 h、12 h、24 h再次評(píng)定大鼠意識(shí)狀態(tài)，大鼠出現(xiàn)翻正反射定義為覺(jué)醒。評(píng)定意識(shí)狀態(tài)后大鼠立即10%水合氯醛過(guò)量灌注處死。取前額葉皮質(zhì)，每組選8只用于Western blotting檢測(cè)，6只用于免疫組化檢測(cè)。

1.6.1 Western blotting

冰面上分離前額葉皮質(zhì)組織，蛋白抽屜試劑盒提取蛋白，分裝于小管后置于液氮罐內(nèi)備用。每個(gè)樣本取等量蛋白加入裝載有4×蛋白上樣緩沖液的小管，蛋白質(zhì)與緩沖液3∶1混合，沸水煮5 min；10%SDS凝膠分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜上；室溫下用含5%牛奶的TBST溶液(150 mmol/L氯化鈉150 ml、三羥甲基氨基甲烷鹽酸20 ml、0.1%Tween 20 ml，pH=7.4)封閉4 h。加兔抗GABA bR1多克隆抗體(1∶500)、鼠抗?-actin單克隆抗體4℃過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加相應(yīng)二抗，室溫1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。加化學(xué)發(fā)光底物浸泡，使用分子成像儀量化條帶蛋白。目的蛋白的灰度與?-actin灰度的比值作為GABAbR1的表達(dá)量。

1.6.2 免疫組化

生理鹽水100 ml灌注，4%多聚甲醛300～500 ml灌注至組織變硬。取出大腦，切成1.0×1.0×1.0 cm小塊，4%多聚甲醛固定8 h，石蠟包埋，滑動(dòng)切片機(jī)切成厚40μm薄片。脫蠟，3%H2O2室溫浸泡抗原修復(fù)，山羊血清封閉，室溫20 min。滴加兔抗GABAb1R抗體(1∶200)，4℃孵育過(guò)夜；PBS漂洗，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h，加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素30 min。加顯色劑，蘇木精復(fù)染1 min；清水沖洗，中性樹(shù)膠封片，通風(fēng)柜中晾干。400倍顯微鏡下拍照，計(jì)算免疫組化(IHC)評(píng)分。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：A代表陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)，0～1%=0、1% ～10%=1、 10% ～50%=2、 50% ～80%=3、 80% ～100%=4；B代表陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度分級(jí)，0=陰性、1=弱陽(yáng)性、2=陽(yáng)性、3=強(qiáng)陽(yáng)性；IHC=A×B[14]。陽(yáng)性染色表現(xiàn)為棕色或棕褐色的著色膜。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。GABAb1R表達(dá)Western blotting結(jié)果滿足方差齊性，數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，行單因素方差分析；IHC評(píng)分以秩值表示，采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 意識(shí)狀態(tài)

空白組42只覺(jué)醒，TBI組大鼠11只覺(jué)醒，拮抗劑組13只覺(jué)醒，VNS組28只覺(jué)醒。

2.2 Western blotting

VNS后6 h，前額葉皮質(zhì)GABAb1R表達(dá)水平拮抗劑組＞TBI組＞VNS組＞空白組，各TBI組與空白組相比有顯著性差異(P＜0.05)；VNS后12 h和24 h，TBI組＞拮抗劑組＞空白組＞VNS組，各組與TBI組相比有顯著性差異(P＜0.05)，拮抗劑組與VNS組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Western blotting各組不同時(shí)間點(diǎn)GABAb1R的表達(dá)(相對(duì)表達(dá)量)

2.3 免疫組化

前額葉皮質(zhì)GABAb1R分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞間隙(圖1)，各組間GABAb1R表達(dá)比較有非常顯著性差異(P＜0.01)。見(jiàn)表2。但不同時(shí)間點(diǎn)間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組前額葉皮質(zhì)GABAb1R表達(dá)

表3 不同時(shí)間點(diǎn)前額葉皮質(zhì)GABAb1R表達(dá)

圖1 前額葉皮質(zhì)GABAb1R在不同組別和時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)(免疫組化染色，400×)

3 討論

迷走神經(jīng)是混合型神經(jīng)纖維，在中樞廣泛投射，其傳入纖維通過(guò)孤束核及其上行網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，到達(dá)下丘腦、杏仁核、海馬，并彌散性投射至大腦皮質(zhì)。該解剖特點(diǎn)可能是其治療各類神經(jīng)系統(tǒng)疾病的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1997年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)VNS應(yīng)用于治療癲癇，2005年批準(zhǔn)用于治療抑郁。目前VNS也應(yīng)用于治療其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如焦慮、偏頭痛、帕金森病和阿爾茨海默病[15-17]。Kumaria等[5]提出，VNS也可用于治療TBI；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)VNS可改善TBI預(yù)后，增加大鼠認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)功能[18-20]。VNS對(duì)TBI動(dòng)物可表現(xiàn)出抗水腫[21]、保護(hù)神經(jīng)元、減少血腦屏障破壞[22]的效應(yīng)，還可降低炎癥壞死因子及增加腦血流[6,23]。在VNS在改善TBI后意識(shí)水平方面，僅有個(gè)別報(bào)道[6]。

本研究用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討VNS對(duì)TBI昏迷的促醒作用及相關(guān)機(jī)制。電刺激參數(shù)參考Shi等[6]的參數(shù)；Smith等也用相同的VNS參數(shù)治療TBI[24]。

研究發(fā)現(xiàn)，VNS有促醒效果，與董曉陽(yáng)等[25]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。VNS的促醒機(jī)理可能在于迷走神經(jīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)投射廣泛，包括控制覺(jué)醒的重要區(qū)域，如小腦、中縫背核、臂旁核、下丘腦、網(wǎng)狀系統(tǒng)等[26-27]，VNS通過(guò)激活這些區(qū)域促進(jìn)昏迷大鼠覺(jué)醒；同時(shí)，VNS具有抗炎抗水腫作用[5]，有利于大腦結(jié)構(gòu)功能恢復(fù)，促進(jìn)覺(jué)醒。

本研究發(fā)現(xiàn)，TBI后大鼠前額葉皮質(zhì)GABAb1R表達(dá)上調(diào)，VNS干預(yù)后該GABAb1R下調(diào)，VNS的促醒作用可能與下調(diào)前額葉皮質(zhì)GABAb1R表達(dá)有關(guān)。GABAbR廣泛分布于哺乳動(dòng)物中樞經(jīng)系統(tǒng)[28]，參與癲癇、焦慮、抑郁、傷害感、成癮及睡眠等病理或生理過(guò)程[29-30]；GABAbR還參與維持睡眠狀態(tài)[8-9]。VNS下調(diào)這一抑制性遞質(zhì)受體，使中樞趨于活躍，有利于消除TBI后皮層抑制，促進(jìn)覺(jué)醒。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，VNS的促醒與上調(diào)大鼠前額葉Orexin A有關(guān)。本研究顯示，當(dāng)大鼠Orexin A被阻斷后，VNS下調(diào)GABAb1R作用減弱。Orexin A是下丘腦外側(cè)區(qū)生成的小分子神經(jīng)肽，屬興奮性遞質(zhì)，它對(duì)其他興奮性神經(jīng)元，如單胺能及膽堿能神經(jīng)元存在投射，可調(diào)節(jié)其他神經(jīng)遞質(zhì)分泌。Orexin A在TBI昏迷促醒中可能起“開(kāi)關(guān)”作用，介導(dǎo)VNS下調(diào)GABAb1R，從而促醒。

VNS前需在頸部分離出迷走神經(jīng)，此過(guò)程引起大鼠呼吸道分泌物增多、呼吸不暢甚至窒息。后期將探索無(wú)創(chuàng)VNS的可能。本研究?jī)H探討了VNS對(duì)TBI昏迷大鼠前額葉皮質(zhì)GABAb1R表達(dá)的影響，尚未涉及其他興奮性遞質(zhì)表達(dá)。后期將進(jìn)一步探索VNS促醒機(jī)制。

綜上所述，VNS可促TBI后昏迷的覺(jué)醒，其機(jī)制可能與Orexin A介導(dǎo)下調(diào)大鼠前額葉皮質(zhì)GABAb1R表達(dá)有關(guān)。其具體的作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of Vagus Nerve Stimulation on Wake-promoting and Expression of γ-aminobutyric Acid b1 Receptor in Prefrontal Cortex of Coma Rats post Traumatic Brain Injury

LIAO Cheng-cheng,FENG Zhen,HUANG Fei-fei,CHEN Qin
Department of Rehabilitation Medicine,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi 330006,China

FENG Zhen.E-mail:fengzhenly@sina.com

Objective To investigate the wake-promoting effect of vagus nerve stimulation(VNS)on coma rats after traumatic brain injury(TBI),and the related mechanism.Methods A total of 168 healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank group,TBI group,antagonist group and VNS group,42 rats in each group.The latter three groups were established TBI model with impact,and the rats in coma at least 30 minutes were included.VNS group accepted VNS,the antagonist group were injected intralateroventricularly Orexin A receptor 1(OXR1)antagonist SB334867,and TBI group accepted sham VNS.Their behaviors were observed to determine the level of consciousness six,twelve and 24 hours after intervention,while the expression of γ-aminobutyric acid b1 receptor(GABAb1R)in prefrontal cortex was detected with immunohistochemistry and Western blotting.Results There were 42 rats in the blank group,11 rats in TBI group,13 rats in the antagonist group,and 28 rats in VNS group awakened finally.The expression of GABAb1R in prefrontal cortex ranged as TBI group,antagonist group,blank group and VNS group from more to less twelve and 24 hours after intervention under Western blotting(F＞60.412,P＜0.001),and it ranged as TBI group,antagonist group,VNS group and blank group under immunohistochemistry(H=15.121,P=0.002),with no significant difference among time points(H=3.028,P=0.220).Conclusion VNS can promote waking from coma in rats after TBI,which may relate with the decrease of GABAb1R in prefrontal cortex that induced by OrexinA.

traumatic brain injury;coma;vagus nerve stimulation;wake-promoting;γ-aminobutyric acid b1 receptor;rats

R651.1

A

1006-9771(2017)09-1037-06

2016-11-05

2017-05-11)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.09.010

[本文著錄格式] 廖誠(chéng)誠(chéng)，馮珍，黃菲菲，等.迷走神經(jīng)電刺激對(duì)腦外傷昏迷大鼠意識(shí)及前額葉皮質(zhì)γ-氨基丁酸b1受體表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(9):1037-1042.

CITED AS:Liao CC,Feng Z,Huang FF,et al.Effect of vagus nerve stimulation on wake-promoting and expression of γ-aminobutyric acid b1 receptor in prefrontal cortex of coma rats post traumatic brain injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(9):1037-1042.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81260295)。

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，江西南昌市330006。作者簡(jiǎn)介：廖誠(chéng)誠(chéng)(1988-)，女，漢族，江西贛州市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)。通訊作者：馮珍，女，江西南昌市人，教授，主任醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)。E-mail:fengzhenly@sina.com。