賀星亮 楊武紅

犬血涂片的制作、染色和應(yīng)用

賀星亮 楊武紅

隨著精密的自動化血細(xì)胞分析儀的開發(fā)與使用，大大提高了實驗結(jié)果的精準(zhǔn)性和重復(fù)性，提高了臨床血液學(xué)檢驗的質(zhì)量和效率，但同時又面臨著一個新的問題：儀器對血液細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的識別存在著局限性和不足，甚至是誤導(dǎo)，這就需要傳統(tǒng)的血涂片鏡檢加以識別、確認(rèn)，做出最終判斷，這充分說明了人工細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗不是血液細(xì)胞分析儀所全部能替代的。可以說自動化儀器與傳統(tǒng)血涂片鏡檢是現(xiàn)代與傳統(tǒng)的結(jié)合，它們之間相互彌補，缺一不可。

一、臨床血涂片的作用和面臨的問題

血涂片染色顯微鏡檢查是血液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的基本方法，主要用于紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板形態(tài)等檢查，還可以用于白細(xì)胞、血小板的數(shù)量評估。在臨床應(yīng)用極為廣泛，特別是對于各種血液病的診斷和鑒別診斷，具有重要價值。但我們也面臨一些問題：

血圖片制備不良，染色不佳，常使血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒別和診斷發(fā)生困難，甚至導(dǎo)致錯誤的結(jié)論。如果血膜過厚則使細(xì)胞重疊縮小，血膜太薄易導(dǎo)致細(xì)胞分布不勻，白細(xì)胞多集中于邊緣。因此，制備厚薄適宜、頭體尾分明、染色良好的血涂片，是血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查最基本的要求，必須以認(rèn)真負(fù)責(zé)的態(tài)度注意操作過程中的每一個環(huán)節(jié)。

二、制作血涂片的血液樣品

用作血涂片的血液樣品從前肢靜脈采血，自吸真空管是首選的采血器具，大多數(shù)血液學(xué)檢驗都選用EDTA作為抗凝劑，血液采集后應(yīng)盡快制備血涂片，與EDTA接觸時間長會導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和血小板出現(xiàn)人為異常，紅細(xì)胞與EDTA接觸24小時后容易發(fā)生溶解。檢查血小板和抗凝實驗時，建議選用檸檬酸鈉作為抗凝劑。用自吸真空管采血采血量必須達(dá)到其標(biāo)注容量，以使血液/抗凝劑達(dá)到最佳比例，采集血液后顛倒管子數(shù)次，充分混勻。

三、血涂片的制備

（一）玻片的處理

新購進的玻片常帶有游離堿質(zhì)，必須用濃度約1mol/L HCl 浸泡24小時后，再用清水徹底沖洗，干燥后備用；用過的玻片將其放肥皂或洗衣粉中煮沸20min，用熱水將肥皂和血膜等污物洗去，用自來水反復(fù)沖洗， 再用蒸餾水沖洗3～5次，必要時再置95% 酒精浸泡1h， 然后擦干或烘干備用。使用載玻片時，切勿用手觸及玻片表面，以保持玻片清潔、干燥、中性、無油漬。

（二）血涂片的制備

1.可直接用非抗凝的靜脈血或毛細(xì)血管血，也可以用經(jīng)EDTA抗凝的血液制備。由于EDTA能阻止血小板聚集，顯微鏡下觀察血小板形態(tài)時常采用，但EDTA抗凝血有時能引起紅細(xì)胞皺縮和白細(xì)胞聚集，因此最好使用非抗凝血制備血涂片。

2.臨床上用的普通手工推片法是取血標(biāo)本1滴置載玻片的一端，從血滴前沿方向接觸血液，使血液沿推片散開，通常推片與載玻片保持30～45度夾角，平穩(wěn)地向前推動，血液即在載玻片上形成薄層血膜。一張好的血涂片，要求厚薄適宜、頭體尾分明、邊緣整齊、兩側(cè)應(yīng)留有空隙，圖片質(zhì)量與血滴大小、推片與載玻片間夾角、推片速度、血細(xì)胞比容有關(guān)。

3.推片邊緣要整齊、平滑，推片時， 血滴愈大，角度愈大， 推片速度愈快則血膜愈厚；反之血膜愈薄，血膜分布不勻主要是推片不齊用力不均，玻片不潔所致。血細(xì)胞比容高于正常時，血液粘度較高，保持較小的角度，可得滿意結(jié)果；相反，血細(xì)胞比容低于正常時，血液較稀薄，則用較大角度。

（三）幾種常用的血涂片的染色方法

1.瑞氏染色法：將自然干燥的血涂片置于水平支架上，滴瑞氏染液至覆蓋血膜為止，染色 1～2 min，加等量磷酸鹽緩沖液輕輕吹動，使之混勻，5 min 后用純化水沖洗，自然干燥，鏡檢。

2.姬姆薩染色法：干燥的血涂片經(jīng)甲醇固定后，直立于姬姆薩染液缸中，60 min 后取出鏡檢。

3.瑞-姬混合染色法：將自然干燥的血涂片置于水平支架上，滴瑞-姬混合染色液至覆蓋血膜為止，染色 10 min，沖洗，鏡檢。

4.羅曼斯基染色法：取10ml的Ⅰ液用 50mlⅡ液稀釋，染色10 min。

（四）常用染色法的特點

1.瑞氏染色法：紅細(xì)胞呈桔紅色紫紅色，中性顆粒呈淺紅色，嗜酸性顆粒呈桔紅色，淋巴細(xì)胞胞質(zhì)呈淺藍(lán)色，單核細(xì)胞胞質(zhì)呈藍(lán)灰色。

2.姬姆薩染色法：紅細(xì)胞呈淺紫紅色，白細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，中性顆粒呈淺紅色，嗜酸性顆粒呈桔紅色，淋巴細(xì)胞胞質(zhì)呈淺藍(lán)色，單核細(xì)胞胞質(zhì)呈灰藍(lán)色。

3.瑞-姬混合染色法：紅細(xì)胞呈紫紅色，白細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，中性顆粒呈淺紅色，嗜酸性顆粒呈桔紅色，淋巴細(xì)胞胞質(zhì)呈淺藍(lán)色，單核細(xì)胞胞質(zhì)呈藍(lán)灰色。

4.羅曼斯基染色法：紅細(xì)胞呈粉紅色，白細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染色淺，嗜酸、嗜堿顆粒分明。

四、血液涂片在臨床上的應(yīng)用

（一）溶血性疾病

海因茨小體性貧血：循環(huán)中的氧化劑作用于紅細(xì)胞血紅蛋白的兩個基本位點，珠蛋白中氨基酸的巰基和亞鐵。珠蛋白氧化可生成沉淀并形成海因茨小體，鐵氧化可形成高鐵血紅蛋白血癥，高鐵血紅蛋白血癥和海因茨小體可以發(fā)生于同一個患病動物，但通常一個占主導(dǎo)地位。

發(fā)生原因：攝入了氧化物引起的，如洋蔥；或者是一些藥物的氧化作用導(dǎo)致的，如對乙酰氨基酚。

特征：氧化的血紅蛋白沉淀附著于紅細(xì)胞膜，呈鼻狀突起；海因茨小體已經(jīng)脫離的也能觀察到，這些細(xì)胞稱為咬損紅細(xì)胞；偏心紅細(xì)胞，是缺乏中央灰白區(qū)域的紅細(xì)胞，所有的血紅蛋白都集中于紅細(xì)胞的一側(cè)，紅細(xì)胞的另一側(cè)，在清晰的細(xì)胞膜旁邊是一小塊未著色的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域(圖1）。

（二）犬巴貝西蟲病

是蜱傳播的犬血液原蟲病，病原為犬巴貝西蟲或吉氏巴貝西蟲，巴貝西可引起血管內(nèi)溶血性貧血，通常以血紅蛋白血癥和血紅蛋白尿為特征，在外周血液涂片中，巴貝西以淚滴狀存在于紅細(xì)胞內(nèi)，長約3um（犬巴貝西蟲、圖2）、1.5um(吉氏巴貝西、圖3）。

圖1 犬采食洋蔥后紅細(xì)胞出現(xiàn)海因茨小體

圖2 犬巴貝西蟲感染

圖3 犬吉氏巴貝西蟲感染

（三）中毒性嗜中性粒細(xì)胞

犬發(fā)生嚴(yán)重炎性疾病和毒血癥時，嗜中性粒細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化十分明顯，形態(tài)學(xué)變化的程度與炎癥和毒血癥的強度成比例。中毒性嗜中性粒細(xì)胞的形態(tài)特征：細(xì)胞質(zhì)呈彌散性嗜堿性——細(xì)胞質(zhì)顏色變?yōu)樗{(lán)灰色；細(xì)胞質(zhì)空泡化——細(xì)胞質(zhì)形成不規(guī)則的空泡；Dohle小體——一個或多個不規(guī)則的嗜堿性細(xì)胞質(zhì)包涵體（圖4）；細(xì)胞核形狀異?！灰?guī)則分葉或出現(xiàn)環(huán)形核。

圖4 中毒犬嗜堿性細(xì)胞Dohle小體

（四）傳染源性嗜中性粒細(xì)胞

犬埃立希體、犬肝簇蟲和組織胞漿菌，在其嗜中性粒細(xì)胞中可以觀察到相應(yīng)的微生物（圖5）；在嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的胞漿內(nèi)偶爾可以觀察到犬瘟熱包涵體（圖6）。

圖5 犬埃利希體感染

圖6 犬瘟熱感染嗜中性粒細(xì)胞包涵體

（作者單位：賀星亮，公安部南京警犬研究所，210012；楊武紅，湖南省公安廳警犬基地，410000）

（本文照片由作者提供）

（編輯：李 冰）