閆 芳,謝啟發(fā),馬炳原,劉 順,朱蓉蓉,韓小飛,張小寶

·論著·

氯胺酮預(yù)處理對卵蛋白激活的致敏大鼠肺泡巨噬細(xì)胞丙二醛及超氧化物歧化酶的影響

閆 芳1,謝啟發(fā)1,馬炳原1,劉 順1,朱蓉蓉1,韓小飛1,張小寶2*

目的研究不同劑量氯胺酮對卵蛋白(OVA)刺激致敏的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的影響。方法致敏的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng),氯胺酮(10、100、1 000 μmol/L)預(yù)處理后給予OVA刺激,培養(yǎng)72 h后檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA及SOD水平。結(jié)果與對照組比較,OVA組培養(yǎng)上清液中MDA水平明顯增加,伴有SOD水平下降,而較高濃度氯胺酮預(yù)處理(100、1 000 μmol/L)后可起到一定的抑制作用。結(jié)論氯胺酮預(yù)處理對OVA引起的肺泡巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用。

氯胺酮;卵蛋白;肺泡巨噬細(xì)胞;丙二醛;超氧化物歧化酶

0 引言

氧化應(yīng)激是哮喘的病理機(jī)制之一,同時伴有炎癥反應(yīng)、氧自由基增多、免疫損傷等,造成抗氧化作用失調(diào)。作為主要免疫效應(yīng)細(xì)胞的巨噬細(xì)胞可通過分泌多種炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子、補(bǔ)體、趨化因子等,對炎癥反應(yīng)起到重要的作用，通過影響細(xì)胞因子的表達(dá)降低組織的炎癥反應(yīng)。

氯胺酮作為臨床上兒童麻醉常用的靜脈麻醉藥品,在鎮(zhèn)靜的同時還具有一定的抗炎和支氣管舒張作用,可明顯降低巨噬細(xì)胞TNF-β、IL-6等炎性因子的釋放[1-3],但是氯胺酮對哮喘細(xì)胞模型中巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響尚未見相關(guān)報道。因此,本研究擬探討氯胺酮預(yù)處理對卵蛋白(OVA)引起的氧化應(yīng)激的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠(南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心),體重250 g左右。雞卵蛋白(V級,Sigma,美國)。鹽酸氯胺酮粉末(KET,批號:05051112,江蘇恒瑞醫(yī)藥公司)。超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)試劑盒(南京市建成生物工程研究所)。胎牛血清(杭州市四季青公司)、全自動酶標(biāo)檢測儀(Sunrise,澳大利亞)、RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠分別于第1天和第7天胸部皮下注射1 mL內(nèi)含卵蛋白1 mg的PBS液和Al(OH)3100 mg,第21天用50 mg/kg戊巴比妥鈉于大鼠腹腔內(nèi)注射,麻醉后切開氣管,插入預(yù)制的聚乙烯導(dǎo)管行支氣管肺泡灌洗[4],用預(yù)冷的PBS 20 mL分5次灌洗大鼠雙肺后回收灌洗液,高速離心后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸,洗滌后加入RPMI-1640培養(yǎng)液,然后均勻接種于預(yù)溫的培養(yǎng)板上,培養(yǎng)2 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)上清液中SOD及MDA的檢測 將分離出的肺泡巨噬細(xì)胞按5×106個/mL密度接種于24孔板上,2 mL/孔。24 h后換液,細(xì)胞分為5組。對照組(C組):實(shí)驗(yàn)后于培養(yǎng)液中加入預(yù)溫的PBS;OVA組(O組):于培養(yǎng)液中加入100 μg/mL的OVA對巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激;低、中、高濃度氯胺酮組(K1～K3組):于細(xì)胞培養(yǎng)液中加入預(yù)先配置的氯胺酮(終濃度分別為10、100、1 000 μmol/L),共同培養(yǎng)0.5 h后,再加入OVA刺激。72 h后分離各組的上層培養(yǎng)液,1 200 r/min離心后取上清液,置于-20 ℃冰箱待測。上清液按試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

氯胺酮對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA及SOD的影響：與C組比較,O組刺激后SOD的活性顯著降低,而MDA含量顯著升高(P<0.05)。與O組比較,K1組MDA含量和SOD活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與O組比較,K2組、K3組的MDA含量降低,SOD活性升高(P<0.01)。見表1。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中SOD活性及MDA含量

注：與C組比較,*P<0.05,**P<0.01;與O組比較,##P<0.01

3 討論

OVA可激活肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),氯胺酮預(yù)先給藥可抑制肺泡巨噬細(xì)胞MDA的升高,同時提高SOD的水平。氯胺酮是臨床上常用的麻醉藥品,研究顯示,氯胺酮具有一定的抗炎作用,可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞HMGB-1的分泌,從而起到細(xì)胞保護(hù)作用[4]。在兼具抗炎作用的同時,氯胺酮也有一定的支氣管舒張作用,其機(jī)制可能與激活BKCa和PKG信號通路有關(guān)[5]。

作為氣道炎癥的主要始動細(xì)胞,肺泡巨噬細(xì)胞是最早接觸外界抗原類物質(zhì)和病原微生物的細(xì)胞[6]。當(dāng)巨噬細(xì)胞被病原微生物刺激后,巨噬細(xì)胞可通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的氧自由基,不僅消滅病原微生物,而且對肺內(nèi)其他細(xì)胞也可能產(chǎn)生一定的損傷[7]。其損傷的程度可以用氧化應(yīng)激的指標(biāo)來反映。MDA是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物之一,MDA的增加可導(dǎo)致細(xì)胞膜的損壞;作為抗氧化酶,SOD具有清除自由基和抑制過氧化反應(yīng)的功能。因此,檢測MDA和SOD水平可以反映細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平,從而了解細(xì)胞的損傷程度。

肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)模擬氧化損傷的常用藥物為OVA[8]。Rainer等[9]發(fā)現(xiàn),OVA可致敏小型豬的肺泡巨噬細(xì)胞,當(dāng)用100 μg/mL OVA再次刺激時，其淋巴細(xì)胞的趨化性顯著增高。用20～200 μg的OVA刺激肝臟巨噬細(xì)胞，可引起肝細(xì)胞H2O2顯著升高[10]。

本實(shí)驗(yàn)中OVA激發(fā)可明顯降低SOD水平,同時增加MDA水平,對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生毒性。而氯胺酮可在轉(zhuǎn)錄水平抑制細(xì)胞的炎性反應(yīng)[11],從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)選用3個倍增終濃度(10、100、1 000 μmol/L)的氯胺酮進(jìn)行預(yù)處理,未發(fā)現(xiàn)氯胺酮對細(xì)胞的死亡率有影響,因此排除了氯胺酮對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。同時,結(jié)果顯示,較高濃度的氯胺酮可抑制OVA刺激的致敏巨噬細(xì)胞MDA升高及SOD下降,其抑制效果不具有濃度依賴性。

綜上所述,氯胺酮可抑制OVA引起的致敏大鼠肺泡巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),從而對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

[1] Zhang X,Feng J,Zhu P,et al.Ketamine inhibits calcium elevation and hydroxyl radical and nitric oxide production in lipopolysaccharide-stimulated NR8383 alveolar macrophages[J].Inflammation,2013,36(5):1094-1100.

[2] 顧達(dá)民,陳宇,張小寶,等.氯胺酮對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2008,12(12):1-2,7.

[3] Tan Y,Wang Q,She Y,et al.Ketamine reduces LPS-induced HMGB1 via activation of the Nrf2/HO-1 pathway and NF-κB suppression[J].J Trauma Acute Care Surg,2015,78(4):784-792.

[4] Liu Z,Wang Z,Han G,et al.Ketamine attenuates high mobility group box-1-induced inflammatory responses in endothelial cells[J].J Surg Res,2016,200(2):593-603.

[5] 周述芝,馬楠,李妙齡,等.BKCa和PKG在氯胺酮舒張哮喘大鼠離體氣管平滑肌中的作用[J].中華麻醉學(xué)雜志,2013,33(3):314-316.

[6] Labonte AC,Tosello-Trampont AC,Hahn YS.The role of macrophage polarization in infectious and inflammatory diseases[J].Mol Cells,2014,37(4):275-285.

[7] Hamad SH,Schauer JJ,Antkiewicz DS,et al.ROS production and gene expression in alveolar macrophages exposed to PM(2.5) from Baghdad,Iraq:Seasonal trends and impact of chemical composition[J].Sci Total Environ,2016,543(Pt A):739-745.

[8] Akiyama H,Sakai S,Linhardt RJ,et al.Chondroitin sulphate structure affects its immunological activities on murine splenocytes sensitized with ovalbumin[J].Biochem J,2004,382(Pt 1):269-278.

[9] Kaelin RM,Center DM,Grant MM,et al.Production of lymphocyte chemokinetic activity by stimulated alveolar macrophages[J].Exp Lung Res,1986,10(2):171-186.

[10]Maemura K,Zheng Q,Wada T,et al.Reactive oxygen species are essential mediators in antigen presentation by Kupffer cells[J].Immunol Cell Biol,2005,83(4):336-343.

[11]De Kock M,Loix S,Lavand′homme P.Ketamine and peripheral inflammation[J].CNS Neurosci Ther,2013,19(6):403-410.

Effectsofketaminepretreatmentonmalondialdehyde(MDA)andsuperoxidedismutase(SOD)inalveolarmacrophagesofratssensitizedbyovalbumin

YAN Fang1,XIE Qi-fa1,MA Bing-yuan1,LIU Shun1,ZHU Rong-rong1,HAN Xiao-fei1,ZHANG Xiao-bao2*

(1.Department of Basic Medical Science,Kangda College of Nanjing Medical University,Lianyungang 222000,China;2. Department of Anesthesiology,Lianyungang No.1 Hospital,Lianyungang 222000,China)

ObjectiveTo study the effects of different doses of ketamine on malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in alveolar macrophages of rats sensitized by ovalbumin (OVA).MethodsAlveolar macrophages were isolated and cultured,and pretreated with ketamine at concentration of 10,100 and 1 000 μmol/L,then challenged with OVA.After being cultured for 72 h,the production of SOD and MDA in the supernatant of macrophage was assayed.ResultsCompared with control group,the MDA level in culture supernatants of OVA group was significantly increased with the decreased level of SOD,while higher concentration of ketamine (100 and 1 000 μmol/L) pretreatment could inhibit this response.ConclusionKetamine pretreatment exerts a protective effects on OVA-induced oxidative stress injury of alveolar macrophage.

Ketamine;Ovalbumin (OVA);Alveolar macrophage;Malondialdehyde;Superoxide dismutase

2017-01-17

1.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,連云港 222000; 2.連云港市第一人民醫(yī)院麻醉科,連云港 222000

連云港市科技局課題(SH1402)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201709001