郭 慧,倪志海,李東波,秦 多,杜 波

( 1. 大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院,遼寧 大連116021；2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 耳鼻喉科)

RNAi干擾聯(lián)合化療對人喉鱗癌裸鼠移植瘤STAT3信號傳導(dǎo)通路的阻滯作用

郭 慧1,倪志海1,李東波1,秦 多1,杜 波2*

( 1. 大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院,遼寧 大連116021；2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 耳鼻喉科)

目的利用人喉鱗癌裸鼠癌移植瘤，研究RNAi干擾協(xié)同化療對移植瘤中STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。方法建立喉鱗癌裸鼠模型：選擇Balb/c純系裸鼠，在裸鼠的背部注射0.2 ml 2×106喉癌細(xì)胞，移植瘤直徑達(dá)到9-11 mm時(shí)，實(shí)驗(yàn)分組：Ⅰ重組載體+順鉑組；Ⅱ重組載體組；Ⅲ順鉑組；Ⅳ 陰性對照組，3周后處死實(shí)驗(yàn)鼠，利用電子顯微鏡、流式細(xì)胞儀，研究移植瘤抑制、Hep-2細(xì)胞凋亡及STAT3信號傳導(dǎo)通路相關(guān)調(diào)控蛋白的變化情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)鼠皮下注射Hep-2細(xì)胞后，約1個(gè)月移植瘤直徑約11 mm。成瘤達(dá)到97.34%，病理顯示：移植瘤(鱗狀細(xì)胞癌、中分化)。電鏡下：重組載體+順鉑組中的喉癌細(xì)胞核膜銳利凸起，細(xì)胞核中染色質(zhì)高密度濃集，近C型改變，微量細(xì)胞膜圓形腫脹。線粒體水腫，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，嵴無規(guī)則排列，或者消失。免疫組化結(jié)果：細(xì)胞漿中見到高表達(dá)染色成棕褐色物質(zhì)的STAT3，細(xì)胞核中可見棕褐色點(diǎn)狀沉積的p-STAT3。Ⅰ實(shí)驗(yàn)組STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯減弱，其灰度值明顯低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組(P<0.05)。流式細(xì)胞儀顯示Ⅰ實(shí)驗(yàn)組中STAT3、p-STAT3、Bcl-2、CyclinDl蛋白表達(dá)顯著減低，大大低于另外三組，(P<0.05)。結(jié)論通過對活體裸鼠喉癌移植瘤模型的實(shí)驗(yàn)研究，驗(yàn)證了應(yīng)用RNAi沉默STAT3基因?qū)戆┗煹脑雒糇饔谩?/p>

RNA干擾；喉鱗癌裸鼠模型；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3；增敏；化療

(ChinJLabDiagn,2017,21:1414)

研究顯示，在喉癌中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)基因異常表達(dá)有關(guān)[1-3]。另有證據(jù)顯示，持續(xù)高水平活化的STAT3與化療耐藥性密切相關(guān)[4]。所以，抑制STAT3活化是一個(gè)理想的基因治療靶點(diǎn)，可以通過阻斷STAT3信號傳導(dǎo)通路，實(shí)現(xiàn)減少腫瘤細(xì)胞分裂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。通過前期工作我們發(fā)現(xiàn)，RNAi沉默STAT3基因可以提高化療療效，下調(diào)STAT3基因可以在活體外影響STAT3信號傳導(dǎo)通路蛋白p-STAT3、 Bcl-xl、CyclinDl的表達(dá)，可以提高喉癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性[5]。本實(shí)驗(yàn)通過RNAi沉默裸鼠人喉鱗癌移植瘤STAT3基因表達(dá)，進(jìn)一步研究STAT3基因的靶向抑制與化療敏感性之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建STAT3重組載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA， DNA測序鑒定。RPMI1640培養(yǎng)基，脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000，磷酸化STAT3兔抗人單克隆抗體、Cyclin D1蛋白多克隆抗體、B淋巴細(xì)胞2(bcl-2)鼠抗人單克隆抗體。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因轉(zhuǎn)染裸鼠轉(zhuǎn)移瘤聯(lián)合化療進(jìn)行治療 健康純種BALB/c裸鼠購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心， 3-4周齡，重13-19g，雌性，無特定病原體(SPF)環(huán)境下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞約0.2 ml注射于各裸鼠頸背部，移植瘤直徑達(dá)9-11 mm時(shí)隨機(jī)分組， 8只一組：Ⅰ 重組載體+順鉑組；Ⅱ重組載體組；Ⅲ 順鉑組(Cisplatin)；Ⅳ 陰性對照組(Control)。 每次Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組分別注射重組載體、陰性對照質(zhì)粒20 μg/只,腫瘤分散注射，間隔3天注射一次，共8次；隔日Ⅰ、Ⅲ組分別注射順鉑2 mg/kg，注射3周后將實(shí)驗(yàn)鼠脫頸處死，常規(guī)處理移植瘤，觀察和檢測。

1.2.2 病理檢查 將移植瘤固定于4%甲醛溶液中，石蠟包埋、切片、片厚4 μm，HE染色，病理性質(zhì)確定。

1.2.3 超微結(jié)構(gòu)的觀察 處死實(shí)驗(yàn)鼠，取1 mm3的組織置于4%戊二醛，4℃，1 h。 0.1M磷酸緩沖液(PBS)清洗。1%鋨酸，4℃，2 h。 乙醇梯度脫水；100%丙酮脫水。 丙酮、樹脂的混合液浸透15 min，純樹脂浸透30 min。 樣品放于包埋板中， 置于37℃、45℃、60℃的烤箱中，分別24 h。做成50 mm的超薄切片。醋酸鈾30 min和檸檬酸鉛30 min雙重電子染色，觀察、照像。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測STAT3及相關(guān)調(diào)控蛋白的改變 治療結(jié)束后分別取四組荷瘤小鼠的移植瘤組織約100 mg，剪碎瘤組織，輕搓組織塊。300目銅網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，離心， PBS清洗,冰浴避光40 min，離心5 min，棄上清； PBS清洗，離心，4%多聚甲固定；培養(yǎng)液重懸，冰浴、 離心，依次加入Stat3、P- Stat3、 Bcl-2、CyclinDl鼠抗人單克隆抗體相對應(yīng)的一抗； 冰浴10 min后，離心、 清洗，加入二抗； 避光冰浴、清洗、離心，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Microsoft Excel軟件處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。組間兩兩比較采用LSD- t檢驗(yàn)(方差齊)或者Dunnett T 3(方差不齊)，多組間比較采用單因素方差變量分析， P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 喉鱗癌裸鼠模型的建立

注入0.2 ml 2×106Hep-2細(xì)胞后，3天后實(shí)驗(yàn)鼠背部出現(xiàn)腫瘤生長，約1個(gè)月余腫瘤直徑達(dá)11 mm左右，成瘤率97.34%。

2.2 應(yīng)用RNAi沉默STAT3基因協(xié)同化療對腫瘤的影響

2.2.1 病理學(xué)結(jié)果(HE) 病理示中分化鱗狀細(xì)胞癌，重組載體+順鉑組腫瘤中央呈現(xiàn)較大的壞死組織和細(xì)胞。(見圖1)

圖1 病理結(jié)果(×100)

2.2.2電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果 重組載體+順鉑組電鏡下見凋亡現(xiàn)象：(低倍)喉癌細(xì)胞核膜有的銳利凸起，有的籃球性脹大，細(xì)胞核染色質(zhì)或高密度濃縮于核膜一邊，或C型改變，(高倍)可見線粒體空泡樣改變，部分水腫，嵴呈不規(guī)則改變或者徹底消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯脫顆?，F(xiàn)象(見圖2)。

陰性對照組：(低倍)見細(xì)胞呈橢圓形改變，含有豐富的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核排列極度不規(guī)則，異染色質(zhì)少，常染色質(zhì)豐富，核仁大而明顯。(高倍)線粒體部分空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少許脫顆?，F(xiàn)象(見圖2)。

圖2 電鏡檢查結(jié)果

2.2.3RNAi沉默STAT3基因聯(lián)合化療對STAT3、p-STAT3及其相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)影響a.免疫組化PV法染色顯示：胞漿見到棕褐色顆粒濃染、高表達(dá)的STAT3蛋白，細(xì)胞核內(nèi)見到棕褐色顆粒樣沉積p-STAT3。重組載體聯(lián)合順鉑組STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)強(qiáng)度大大降低，其灰度值STAT3(32.67±3.68)、p-STAT3(24.89±3.78)明顯低于其余治療組(F=13.23，F(xiàn)=11.24，P<0.05)(見圖3-4)。

圖3 瘤組織中Stat3的表達(dá)

b.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：重組載體加順鉑組STAT3、p-STAT3、Bcl-xl與CyclinD1的蛋白表達(dá)最低，其相應(yīng)熒光指數(shù)(1.321±0.134，1.278±0.197，1.198±0.123，1.123±0.234)明顯低于另外三組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.23，F(xiàn)=2.34，F(xiàn)=3.78，F(xiàn)=2.18，P<0.05)。

圖4 瘤組織中 p-STAT3的表達(dá)

3 討論

因?yàn)榈脱?、阻滯?xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡等原因引起細(xì)胞生存環(huán)境發(fā)生改變，常導(dǎo)致以喉癌為代表的實(shí)體腫瘤對化療不敏感。研究顯示，腫瘤化療耐藥的機(jī)制之一是腫瘤細(xì)胞對凋亡的耐受，細(xì)胞凋亡因子(如Bcl-2蛋白)的高表達(dá)，可以減低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，控制腫瘤細(xì)胞凋亡；另一方面腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制被破壞，而導(dǎo)致出現(xiàn)失控性增殖。

故通過使細(xì)胞周期阻滯于某一特定時(shí)刻而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可以達(dá)到治療腫瘤的目的。將很少量的某物質(zhì)與化療藥物聯(lián)合使用可以提高化療藥物如順鉑的療效叫做化療增敏或者化療耐藥逆轉(zhuǎn)，這種物質(zhì)叫做化療增敏劑[6,7]。資料顯示，基因治療藥物屬于化療增敏劑之一，大大減少化療毒性，改善患者化療后的生命體征。

STAT3經(jīng)典的激活方式是腫瘤細(xì)胞在生長因子或細(xì)胞因子作用下，受體被二聚化，存在于受體內(nèi)部的酪氨酸激酶被激活，酪氨酸(位于STAT3第705位)磷酸化后形成二聚體，二聚體進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[3-5]。資料顯示阻滯STAT3信號傳導(dǎo)通路中p-STAT3、Bcl-2、Cyclin D1 蛋白的表達(dá)，可以提高腫瘤細(xì)胞化療的敏感性，防止DNA受損，加強(qiáng)DNA損傷后的恢復(fù)。

如何測定某些抗癌藥物是否敏感，人們常用體內(nèi)和體外兩種方法。體內(nèi)方法，常采用移植瘤的模式，因?yàn)橐浦擦隹梢阅M體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生存內(nèi)環(huán)境，觀察到藥物在移植瘤內(nèi)的物質(zhì)代謝過程；同時(shí)因?yàn)橐浦擦鼍邆淞税┘?xì)胞本身的分裂增殖方式、三維空間立體構(gòu)象、細(xì)胞膜本身的滲透壓、解離度、溶解度、表面張力等因素，能比較準(zhǔn)確地反映腫瘤對化療藥物的耐藥或者敏感情況。

實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)鼠背部注射喉癌Hep-2細(xì)胞后，近一個(gè)月長成直徑11 mm的腫瘤，給予重組載體和順鉑治療后，病理檢查移植瘤為中分化鱗狀細(xì)胞癌，表明裸鼠移植瘤模型構(gòu)建成功。將重組載體和順鉑聯(lián)合作用于移植瘤后，裸鼠移植瘤未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察到腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡征象：重組載體+順鉑組的喉癌細(xì)胞大部分細(xì)胞核膜銳性凸起，細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)高密度，邊集于核膜下，形成新月形，另外還有一部分細(xì)胞膜圓形膨大，說明應(yīng)用RNA沉默STAT3基因協(xié)同化療，可明顯阻滯細(xì)胞周期進(jìn)行，抑制DNA合成，細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，大大限制了喉癌裸鼠移植瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)了化療藥物的治療腫瘤作用。

重組載體聯(lián)合順鉑作用于移植瘤1天后，免疫組化PV法染色顯示：STAT3于胞漿中高表達(dá)，胞漿中見有棕褐色顆粒濃染，p-STAT3于胞核中表達(dá)，胞核內(nèi)可見棕褐色顆粒沉積，重組質(zhì)粒載體+順鉑組 STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)受到了明顯抑制，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示重組載體聯(lián)合順鉑組STAT3及其相關(guān)調(diào)控蛋白p-STAT3、CyclinDl、Bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，其蛋白熒光指數(shù)與其他三組均存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果提示聯(lián)合應(yīng)用化療及RNAi干擾技術(shù)可阻斷抑制STAT3信號傳導(dǎo)通路相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增加腫瘤對化療藥物的敏感性。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因一方面是因?yàn)轫樸K直接作用于腫瘤細(xì)胞，造成腫瘤細(xì)胞壞死，另一方面RNAi沉默STAT3基因，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，本次通過對裸鼠喉鱗癌移植瘤模型的研究，從體內(nèi)客觀驗(yàn)證了應(yīng)用RNA干擾STAT3基因可提高喉癌對化療藥物的敏感性，為腫瘤研發(fā)新的聯(lián)合治療方案提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。增加化療藥物的療效，減少其毒副反應(yīng)是治療腫瘤的原則之一，加快化療增敏劑的開發(fā)和研究及使用將會為腫瘤治療帶來新的希望。

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TheinfluenceofRNAisilencecombinedchemotherapyforSTAT3signalingpathwaysinnudemicetransplantationtumor

GUOHui,NIZhi-hai,LIDong-bo,etal.

(DalianUniversityaffiliatedXinhuaHospital,Dalian116021,China)

ObjectiveBy using Human laryngeal squamous carcinoma nude mice transplantation tumor model,to study the influence of RNA interference in combined chemotherapy for nude mouse transplantation tumor STAT3 signal transduction pathway.MethodsEstablish laryngeal squamous carcinoma in nude mice model:choose pure Balb/c nude mice,in the back subcutaneous injection of 0.2 ml 2×106hep- 2 cells,when the tumor will be 9-11 mm long,study groups:ⅠRestructuring carrier + cisplatin; ⅡRestructuring carrier group; ⅢThe negative control group; ⅣCisplatin group,chemotherapy the nice will be treated on execution after 3 weeks, the tumor suppressor ,tumor cell apoptosis and changes of STAT3 signaling pathways regulatory proteins will be observed by flow cytometry and electron microscope.ResultsAfter injection of laryngeal cancer cells,experimental mice grown to 11 mm size long by nearly one month .Tumor rate was 97.34%,pathologic examination:intermediate differentiation,squamous cell carcinoma.Electron microscopy results :Restructuring carrier + cisplatin group of laryngeal cancer cells in the nuclear membrane sharp protuberance,chromatin in the nucleus of high concentration,nearly C type change,trace round cell membrane swelling.Mitochondria edema,rough endoplasmic reticulum degranulation,crest arrangement without rules,or disappear.Immunohistochemical method showed that:Meet high expression in cytoplasmic staining into brown substances of STAT3,seen in the nuclei brown dot sedimentary p-STAT3.ⅠSTAT3,p-STAT3 protein expression decreased significantly,the grey value significantly below Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ group (P<0.05).Flow cytometry instrument displayⅠ STAT3 ,p - STAT3,Bcl - 2,CyclinDl protein expression significantly lower in the experimental group,much lower than the other three groups,(P<0.05).ConclusionIt is demonstrated that applying RNAi to silence STAT3 gene can enhance chemosensitivity by studying therapeutical effect of human laryngeal squamous carcinoma in nude mice.

RNA interference； laryngeal squamous carcinoma in nude mice mode；signal transduction and activators of transcription 3 (STAT3); Sensitization; chemotherapy

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1414-04

R739.65

：A

2016-12-19)