石盼盼，李 旭， 魏法山， 謝文佳

（河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河南 鄭州 450002）

肉類摻假的分子生物學(xué)檢測

石盼盼，李 旭， 魏法山， 謝文佳

（河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河南 鄭州 450002）

針對GeneBank中公布的牛羊豬雞鴨線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基基因的特異性序列設(shè)計(jì)引物，建立了肉樣的5種常見牛羊豬雞鴨動(dòng)物源性成分檢測的PCR電泳法體系。采用大連寶生物的豬源牛源羊源雞源性成分檢測試劑盒和廣州迪奧生物的鴨源性成分檢測試劑盒，利用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系對河南省范圍內(nèi)幾個(gè)大型超市的118批次牛肉樣品的5種即豬牛羊雞鴨動(dòng)物源性成分進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示：牛源性成分檢出117批次檢出率99.15%，豬源性成分檢出10批次檢出率8.47%，雞源性成分檢出7批次檢出率5.93%，鴨源性成分檢出1批次檢出率0.85%，沒有檢出羊源性成分，其中熟肉制品摻雜其他源性成分的比例較高。與配料表對比摻假使假樣品共9批次，總摻假率為7.63%。

肉類摻假；PCR；實(shí)時(shí)熒光PCR；檢測

肉類摻假是食品安全面臨的難題。鑒別肉及肉其制品是否摻假已成為食品安全檢測和監(jiān)管機(jī)構(gòu)迫切需要解決的問題，利用基因檢測技術(shù)鑒別動(dòng)物源性成分可迅速準(zhǔn)確地鑒定產(chǎn)品中是否含有其他肉類成分[1-9]。作者依托河南省質(zhì)檢院食品中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)，在長期從事肉制品動(dòng)物源性成分檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，針對標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[10]中實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)靈敏度高易出現(xiàn)假陽性的缺陷，設(shè)計(jì)引物摸索實(shí)驗(yàn)條件，最終建立了肉及肉制品中動(dòng)物源性成分檢測的普通PCR電泳法檢測體系，在實(shí)際檢測中可以作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的補(bǔ)充，進(jìn)一步保障檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[11]。

作者檢測了河南省范圍內(nèi)大型超市118批次牛肉樣品的豬牛羊雞鴨動(dòng)物源性成分，并細(xì)分產(chǎn)品種類了解不同牛肉產(chǎn)品動(dòng)物源性成分檢出情況，通過與配料表對比了解產(chǎn)品的摻假情況，驗(yàn)證了試劑盒的有效性，為相關(guān)檢驗(yàn)工作提供技術(shù)支持。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)的生鮮牛肉，醬牛肉，熟牛肉干制品，速凍調(diào)理牛肉制品4種不同種類產(chǎn)品的動(dòng)物源性成分檢出情況，使消費(fèi)者對不同種類牛肉產(chǎn)品的成分及摻假情況有了更深一步的了解。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑盒特異性和靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)用到的生鮮牛肉，羊肉，豬肉，雞肉，鴨肉為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存，其他生鮮牛肉及醬牛肉，熟牛肉干制品，速凍調(diào)制牛羊肉制品均購自河南省沃爾瑪，家樂福，丹尼斯等各大型超市。溴化乙錠，牛源，豬源，羊源，雞源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒：寶生物（大連）生物工程有限公司產(chǎn)品；鴨源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒：自廣州迪奧生物公司產(chǎn)品；牛羊豬雞鴨源性成分普通PCR引物：寶生物合成。

1.2 主要儀器設(shè)備

Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國密理博公司產(chǎn)品；HFsafe生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；LightCycle480熒光PCR儀：羅氏診斷產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；Colibri Titertek Berthold超微量分光光度計(jì)：上?？迫鹕锟萍加邢薰井a(chǎn)品；水平電泳儀及制膠板、凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；移液器、普通PCR儀，小型離心機(jī)：美國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 PCR反應(yīng)條件

普通PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，10 min；（94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min）x40；72℃，5 min，4℃保存。

熒光定量PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，10 sec；（95℃，5 s；60℃，30 s；）x45；50℃，2 min。

1.4 測定方法

1.4.1 DNA提取 酚氯仿抽提法：多點(diǎn)取樣（對于加工肉制品需用水浸泡去鹽后再取樣），用解剖剪剪碎后，取適量樣品放入研缽中液氮冷凍研磨至粉末狀，稱取50 mg研磨物至1.5 mL離心管中，加入700 μL DNA提取裂解液，置65℃水浴3 h，期間不時(shí)震蕩混勻；12 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 mL離心管中，加入等體積苯酚氯仿與異戊醇（25∶24∶1）的混合溶液，充分混勻后，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉溶液，混勻后加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20℃靜置1～3 h，12 000 r/min離心5 min棄去上清；加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液洗滌1～2次，超凈臺(tái)內(nèi)室溫下晾干后，加50 μL TE緩沖液，最終獲得A260nm/A280nm在1.8～2.0之間的DNA溶液。

1.4.2 PCR擴(kuò)增

1）引物 檢測所用引物具體序列見表1。

表1 豬牛羊雞鴨源性成分普通PCR檢測引物列表Table 1 Primers of bovine，ovine，procine，chicken，duck five Animal-derived materials by PCR

2）普通PCR擴(kuò)增 分別提取牛肉，羊肉，豬肉，雞肉，鴨肉樣品的DNA，用牛源性引物擴(kuò)增牛肉樣品DNA，羊豬雞鴨源性引物分別擴(kuò)增羊豬雞鴨肉樣品DNA。25 μL擴(kuò)增體系為：DDW 9.5 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，primer For（10 μmol/L）1 μL，primer Rev（10 μmol/L）1 μL，模板DNA（50～100 ng/ μL）1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，10 min；（94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min）x40；72℃，5 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的瓊脂糖凝膠，水平電泳儀150 V電泳40 min分離擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

3）實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增 按1.3.1方法提取牛肉DNA，依照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。25 μL PCR擴(kuò)增體系：DDW 9.5 μL，2×Premix 12.5 μL，Primer Mix 1 μL，Probe Mix 1 μL，樣品DNA（50 ng/μL左右）1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，10 s；（95℃，5 s；60℃，30 s；）x45；50℃，2 min。擴(kuò)增結(jié)束后用LightCycle480軟件分析CT值和擴(kuò)增曲線，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)和試劑盒說明書判斷擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR電泳法檢測牛羊豬雞鴨肉動(dòng)物源性成分結(jié)果

依1.3.1方法提取各樣品的DNA，提取的牛肉，羊肉，雞肉，豬肉，鴨肉樣品的DNA總質(zhì)量濃度分別為：100、113、107、105、108 ng/μL；調(diào)整使PCR模板濃度達(dá)到50～100 ng/μL，依照1.3.2.2分別用對應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，用牛源性引物可以擴(kuò)增出牛肉樣品約79 bp的條帶，羊源性引物可以擴(kuò)增出羊肉樣品約98 bp的條帶，與目的條帶大小一致（如圖1所示）。同樣如圖2所示，用豬源性引物可以擴(kuò)增出豬肉樣品約71 bp的條帶，雞源性引物可以擴(kuò)增出雞肉樣品約89 bp的條帶，鴨源性引物可以擴(kuò)增出鴨肉樣品約85 bp的條帶，與目的條帶大小一致。電泳條帶清晰單一，此結(jié)果說明構(gòu)建的PCR方法體系可用于鑒定豬牛羊雞鴨肉各自的動(dòng)物源性成分。

2.2 牛源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒特異性和靈敏度檢測結(jié)果

2.2.1 牛源性成分檢測試劑盒特異性檢測結(jié)果提取的牛肉，羊肉，雞肉，豬肉，鴨肉樣品的DNA總質(zhì)量濃度分別為：140、113、107、105、108 ng/μL；用TE緩沖液稀釋至相同且合適的質(zhì)量濃度，分別以5種DNA為模板，按照牛源性檢測試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，只有以牛肉DNA為模板時(shí)才能發(fā)生特異性擴(kuò)增，而其他樣品DNA沒有擴(kuò)增。這說明牛源性檢測試劑盒用來檢測牛肉DNA特異性良好，沒有交叉反應(yīng)。

圖1 牛羊源性DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of bovine and ovine-derived materials

圖2 豬雞鴨源性DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR result of procine，chicken，duck-derived materials

圖3 牛源性檢測試劑盒特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity result of real time PCR Bovine DNA detection kit

2.2.2 牛源性成分檢測試劑盒靈敏度檢測結(jié)果提取牛肉樣品DNA，用TE稀釋，使牛肉DNA分別呈100，10，1，0.1，0.01 ng/μL濃度梯度，用牛源性試劑盒檢測牛肉樣品各梯度DNA，實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果如圖4，從左至右依次是100，10，1，0.1，0.01 ng/ μL牛肉樣品 DNA的擴(kuò)增曲線，CT值依次為16.37，19.33，22.25，29.32，36.49。根據(jù)試劑盒的判定原則，當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為0.01 ng/μL時(shí)CT值大于35，為陰性結(jié)果，所以此結(jié)果表明牛源性試劑盒可以檢測低至0.1 ng/μL質(zhì)量濃度的目標(biāo)DNA。用同樣方法檢測羊豬雞鴨源性試劑盒，結(jié)果顯示檢測最低質(zhì)量濃度也可達(dá)到0.1 ng/μL。

圖4 牛源性檢測試劑盒靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Sensitivity result of real time PCR Bovine DNA detection kit

2.3 牛肉樣品5種牛羊豬雞鴨動(dòng)物源性成分檢驗(yàn)結(jié)果

檢測了河南省大型超市的118批次牛肉樣品的豬牛羊雞鴨5種動(dòng)物源性成分。牛源性成分檢出117份，檢出率為99.15%；豬源性成分檢出10份，檢出率為8.47%；雞源性成分檢出7份，檢出率為5.93%；鴨源性成分檢出1份，檢出率為0.85%；羊源性成分檢出0批次。

118 批次樣品分為4類，分別統(tǒng)計(jì)各類產(chǎn)品的動(dòng)物源性成分檢出情況，并與樣品配料表對比，了解摻假情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示：生鮮牛肉18批次，全部僅檢出牛源性成分檢出率為100%。醬牛肉50批次，47批次僅檢出牛源性成分，2批次同時(shí)檢出牛源和雞源成分另有1批次樣品僅檢出豬源性成分，牛源雞源豬源的檢出率分別為98%，6%和2%；同時(shí)檢出牛源雞源的2批次樣品因無法排除配料中添加的雞精對檢出雞源性的影響，判定為合格品，僅檢出豬源成分的1批次樣品配料標(biāo)注為牛肉，判定為不合格品。熟肉干制品共38批次，27批次僅檢出牛源性成分，3批次同時(shí)檢出牛源雞源性成分，8批次同時(shí)檢出牛源豬源性成分，牛源雞源豬源的檢出率分別為100%，7.89和21.05%；檢出牛源豬源的8批次樣品配料中沒有豬肉成分，判斷為摻假品。速凍調(diào)制肉制品12批次，9批次僅檢出牛源性成分，其中1批次牛肉丸同時(shí)檢出牛源豬源雞源鴨源；另2批次為復(fù)合牛肉片同時(shí)檢出牛源和豬源，牛源雞源豬源的檢出率分別為100%，7.89和21.05%；樣品檢出情況與配料標(biāo)注一致，故全部為合格品。

表2 4類牛肉樣品檢測情況匯總表Table 2 Testing summary table of four kinds of samples

3 結(jié)語

鑒于實(shí)時(shí)熒光PCR其靈敏度極高，在實(shí)際檢驗(yàn)中有時(shí)無法排除因包裝運(yùn)輸及檢測過程中污染出現(xiàn)的假陽性結(jié)果[12]，作者建立了常見肉類動(dòng)物源性成分檢測的普通PCR電泳法，可以實(shí)現(xiàn)對牛羊豬雞鴨肉樣品的種屬鑒定，在實(shí)際檢驗(yàn)中可作為實(shí)時(shí)熒光PCR法的補(bǔ)充，使得樣品的檢驗(yàn)更嚴(yán)謹(jǐn)。同時(shí)驗(yàn)證了TAKARA牛源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒檢測樣品的特異性和靈敏度，方法有效，結(jié)果良好。

總而言之，大型超市的牛肉產(chǎn)品摻雜豬肉雞肉情況比較嚴(yán)重，主要是加工牛肉制品，其中熟肉干制品是牛肉摻假的重災(zāi)區(qū)。監(jiān)管部門可做專項(xiàng)監(jiān)管整治，對于消費(fèi)者，在選購時(shí)最好挑選正規(guī)場所大品牌的牛肉產(chǎn)品，并且看清配料表。

本次118批次牛肉樣品中每種牛肉產(chǎn)品批次不等，樣本量太小如速凍調(diào)制共12批次，導(dǎo)致結(jié)論可能不具有普遍意義。另外采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法靈敏度高，當(dāng)產(chǎn)品為了增加口感添加極少量其他動(dòng)物源性成分如非清真食品的醬牛肉，鹵汁中可能含有少量雞源或豬源成分，牛肉干表面添加雞精雞粉，這些會(huì)導(dǎo)致牛肉樣品中檢出豬源雞源成分，難以判斷是否是摻假樣品，食品標(biāo)簽管理需要進(jìn)一步完善。如果可以找到合適的物種基因組中特異性單拷貝基因，以之為靶基因，通過熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對樣品各種動(dòng)物源性成分的基因水平定量檢測，對肉品的摻假情況把控會(huì)更加的精準(zhǔn)[13-15]。

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Molecular Biological Detection for Adulterated Meat

SHI Panpan， LI Xu， WEI Fashan， XIE Wenjia
（Institute of Products Quality Supervision and Inspection in Henan Province，Zhengzhou 450002，China）

This article estiblished PCR examination system for five bovine，ovine，procine，chicken，duck-derived materials of meat.Five animal-derived materials of 118 batches beef samples at several big supermarkets in Henan Province were detected by using TAKARA and Deaou real-time PCR detection kit，And result showed that 117 batch samples had bovine-derived material for 99.15%，10 batch samples had procine-derived material for 8.47%，7batch samples had chicken-derived material for 5.93% ，just 1batch sample had duck-derived material for 99.15%and no sample had ovine-derived material，The adulteration ratio of done meat products is higher.There are 9 batches of adulteration with the ratio of 7.63%.

meat adulteration，PCR，real-time PCR，detection

TS 251

：A

：1673—1689（2017）07—0773—05

2015-08-14

石盼盼（1987—），女，河南洛陽人，助理工程師，主要從事食品檢驗(yàn)研究。E-mail：523150920@qq.com

石盼盼，李旭，魏法山，等.肉類摻假的分子生物學(xué)檢測[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（07）：773-777.