許 玲王元琮何曉蘭 黃益洪 徐照龍 邵宏波張大勇

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所 / 鹽土農(nóng)業(yè)研究中心, 江蘇南京 210014

大豆轉(zhuǎn)錄因子GmMYB52的克隆、表達(dá)及結(jié)合功能分析

許 玲**王元琮**何曉蘭 黃益洪 徐照龍 邵宏波*張大勇*

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所 / 鹽土農(nóng)業(yè)研究中心, 江蘇南京 210014

MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中有重要的調(diào)控作用。依據(jù)課題組前期獲得的鹽脅迫相關(guān)的數(shù)字表達(dá)譜(DGEP)數(shù)據(jù), 獲得鹽脅迫響應(yīng)顯著上調(diào)基因GmMYB52, 利用RT-PCR方法從栽培大豆(Williams 82)中克隆該基因片段, 并與已公布的Williams 82基因組數(shù)據(jù)庫序列比對(duì), 該基因與GmMYB52序列一致。生物信息學(xué)分析表明, GmMYB52編碼區(qū)(CDS)全長(zhǎng)1083 bp, 編碼360個(gè)氨基酸。其編碼的氨基酸序列具有MYB類轉(zhuǎn)錄因子的共同特征, 其距N端110～160氨基酸殘基處有MYB結(jié)構(gòu)域; 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, 該基因編碼的蛋白與GmMYB62、擬南芥AtMYBSt1、苜蓿MtMYB52、水稻OsMYBS3及木豆CcMYB-like protein J的親緣關(guān)系最近; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明, 大豆根部GmMYB52的轉(zhuǎn)錄水平受外界非生物逆境的調(diào)控, 用脫落酸(ABA)和低溫(4℃)處理后12 h明顯上調(diào), 用氯化鈉和PEG處理0.5～24.0 h后檢測(cè)到GmMYB52的轉(zhuǎn)錄水平在50%～600%區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的趨勢(shì)。GmMYB52為組成型表達(dá), 在大豆的幼苗期和開花期表達(dá)較多, 在成熟期表達(dá)相對(duì)較低。GmMYB52在莖葉與開花期的花中表達(dá)較強(qiáng), 在根的表達(dá)較弱, 而在成熟期的豆莢中幾乎不表達(dá)。亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明, GmMYB52定位于細(xì)胞核, 符合典型轉(zhuǎn)錄因子的定位特征。酵母雜交系統(tǒng)檢測(cè)表明, GmMYB52具有轉(zhuǎn)錄激活特征,并且能夠與MYB相關(guān)順式作用元件基序相結(jié)合。本研究結(jié)果表明, GmMYB52編碼典型的MYB轉(zhuǎn)錄因子, 具有轉(zhuǎn)錄激活活性及DNA結(jié)合活性, 在大豆中的表達(dá)可能與大豆的非生物脅迫和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān), 推測(cè)其可能參與了大豆對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)。

大豆; GmMYB52; 表達(dá)分析; 轉(zhuǎn)錄激活功能; 結(jié)合功能

鹽堿、高溫、低溫、高鹽、干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境脅迫因子, 在進(jìn)化中, 植物產(chǎn)生了較為完善的分子機(jī)制, 感受外界環(huán)境的變化, 從而調(diào)整自身基因的表達(dá), 以應(yīng)對(duì)這些逆境。轉(zhuǎn)錄因子與植物的抗逆反應(yīng)密切相關(guān), 當(dāng)植物感受到外界環(huán)境刺激時(shí), 往往會(huì)激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá), 這些被激活的轉(zhuǎn)錄因子會(huì)結(jié)合相應(yīng)的順式元件, 進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá), 從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生理狀態(tài)。對(duì)植物轉(zhuǎn)錄因子的研究有助于幫助揭示目標(biāo)植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的生理和分子機(jī)制。MYB轉(zhuǎn)錄因子是一大類功能多樣的轉(zhuǎn)錄因子, 在各種植物中均有分布[1-2]。第1個(gè)在植物中被克隆出來的MYB基因是玉米中的 MYBC1, 它參與花青素的合成[3]。很多研究表明 MYB類轉(zhuǎn)錄因子與植物響應(yīng)非生物逆境脅迫密切相關(guān), 例如, 擬南芥中的AtMYB15負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的抗寒性, 可以與 ICE1互作來調(diào)控下游CBF基因的表達(dá)[4], AtMYB96參與了由ABA和JA介導(dǎo)的應(yīng)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[5]; AtMYB2可以在干旱脅迫下作為轉(zhuǎn)錄激活因子激活脫落酸(ABA)誘導(dǎo)基因的表達(dá)[6], AtMYB30可以通過與油菜素內(nèi)酯(BR)途徑中的關(guān)鍵基因BES1協(xié)同調(diào)控BR信號(hào)通路中的基因表達(dá)來響應(yīng)非生物脅迫[7]。甘蔗(Saccharum officinarum)中的ScMYBAS1在干旱與高鹽脅迫下會(huì)大幅度上調(diào)表達(dá)[8-9], 水稻(Oryza sativa)中的OsMYB2則參與了對(duì)高鹽、低溫和干旱脅迫的響應(yīng)[10]。

近年來生態(tài)環(huán)境的不斷惡化, 給大豆的生產(chǎn)造成了巨大的損失。大豆在其生長(zhǎng)過程中, 會(huì)遇到來自環(huán)境中的各種非生物脅迫, 如鹽堿、高鹽、低溫、干旱等。因此, 尋找合適的參與逆境調(diào)控的基因可以為選育優(yōu)良大豆品種提供良好的遺傳基礎(chǔ)。鑒定和分析大豆中的 MYB類轉(zhuǎn)錄因子也是研究的熱點(diǎn)之一。依據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的重復(fù)數(shù), 含有MYB結(jié)構(gòu)域的蛋白主要被分為4大類, 分別命名為1R (R1/2, R3-MYB)、2R (R2R3-MYB)、3R (R1R2R3-MYB)和4R (含有4個(gè)R1/R2-like重復(fù))。在大豆中, 目前已經(jīng)分析預(yù)測(cè)出127個(gè)1R-MYB、244個(gè)2R-MYB和 6個(gè)3R-MYB[11]。很多MYB類轉(zhuǎn)錄因子都參與了逆境脅迫的響應(yīng), Liao等[12]在之前鑒定出的 156個(gè)編碼MYB類轉(zhuǎn)錄因子的基因中, 發(fā)現(xiàn)43個(gè)的表達(dá)會(huì)受到ABA處理, 高鹽, 干旱以及低溫的影響。在擬南芥中過表達(dá) GmMYB76、GmMYB92和GmMYB177可以讓植株不同程度獲得對(duì)這些逆境的抗性。杜海等[13]在大豆中克隆出了 GmMYBJ6和GmMYBJ7, 并發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因的表達(dá)都受到ABA和NAA的誘導(dǎo)。GmMYBJ7的表達(dá)在高鹽、干旱和紫外照射的處理下會(huì)明顯降低, 過表達(dá) GmMYBJ7的煙草中, 類黃酮的含量明顯減少, 推測(cè)可能該基因是通過調(diào)控類黃酮的量參與植物的生理代謝[14]。R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子GmMYB12B2受NaCl與紫外線(UV)的誘導(dǎo), 在擬南芥中過表達(dá) GmMYB12B2不但可以增強(qiáng)擬南芥對(duì)高鹽和 UV的耐受能力, 而且增加了擬南芥的類黃酮含量, 類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)與野生型對(duì)照相比均上調(diào)[15-16]。楊文杰等[17]在大豆中分離并鑒定了GmMYBZ1和GmMYBZ2, 并發(fā)現(xiàn)GmMYBZ2也可能參與類黃酮的調(diào)控。魏麥玲等[18]分離克隆出 GmMYB174, 并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量在ABA和高鹽處理下下調(diào), 在干旱處理下上調(diào)。許玲等[19]從栽培大豆(Williams)中克隆到R2R3類型的轉(zhuǎn)錄因子GmMYB111, 其表達(dá)量受到ABA、高鹽、干旱和低溫的誘導(dǎo)。除了參與大豆對(duì)非生物逆境的響應(yīng)和大豆類黃酮的調(diào)控, MYB類轉(zhuǎn)錄因子還直接參與調(diào)控大豆的生長(zhǎng)發(fā)育, 例如GmMYB-G20-1參與調(diào)控大豆的花瓣顏色, 在病毒誘導(dǎo)沉默GmMYB-G20-1的大豆植株中, 大豆的花瓣顏色由原來的紫色變?yōu)椴糠只蛉炕宜{(lán)色[20]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物中參與了包括胚形態(tài)發(fā)生、次生代謝、開花結(jié)果、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物逆境、非生物逆境響應(yīng)等過程[2,21]。盡管對(duì)MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中的作用已有較多研究, 但是目前尚未有針對(duì)大豆GmMYB52的相關(guān)報(bào)道。本研究在挖掘之前發(fā)表的大豆表達(dá)譜數(shù)據(jù)信息時(shí)發(fā)現(xiàn)GmMYB52在鹽處理前后表達(dá)差異明顯, 因此克隆出了MYB類轉(zhuǎn)錄因子 GmMYB52, 對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析, 鑒定了該基因的亞細(xì)胞定位并驗(yàn)證了其轉(zhuǎn)錄激活活性和結(jié)合功能。這將為進(jìn)一步研究該基因在大豆逆境脅迫中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株和試劑

本實(shí)驗(yàn)所用大豆為Williams 82。用于載體構(gòu)建的菌株 DH5α為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鹽土農(nóng)業(yè)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存, 所用酵母Y187購于Clonetech公司。試驗(yàn)所需的引物為南京金斯瑞公司合成。用于PCR擴(kuò)增的酶和試劑購自東洋坊(Toyobo)公司, 用于載體構(gòu)建的內(nèi)切酶、連接酶, 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試劑, DNA Marker, 反轉(zhuǎn)錄酶等其他試劑購自寶生物(TaKaRa)公司。質(zhì)粒提取, 膠回收試劑盒為捷瑞生物技術(shù)公司生產(chǎn)。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

分別用100 μmol L–1ABA、200 mmol L–1NaCl、4℃低溫和20% PEG-6000處理大豆的三葉期幼苗。在處理后0、0.5、1、3、6、12和24 h取樣, 液氮凍存, 用于逆境處理不同時(shí)間段的表達(dá)分析。取大豆幼苗期的根、莖、葉, 開花期的根、莖、葉、花以及成熟期的根、莖、葉、豆莢, 液氮凍存, 用于GmMYB52的時(shí)空表達(dá)分析。采用 Promega公司的RNA提取試劑盒提取總RNA, 經(jīng)DNA酶(DNase I) 37℃消化 20 min后用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取質(zhì)量。按照購自TaKaRa公司的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明完成模板cDNA的合成。

1.3 基因克隆

根據(jù)之前發(fā)表的鹽處理數(shù)字表達(dá)譜(DGEP)數(shù)據(jù)尋找處理前后表達(dá)差異明顯的基因, 挖掘到GmMYB52[22]。由此設(shè)計(jì)引物, 正向引物為5′-ATGACT CGGCGCTGCTCCCACTGCA-3′, 反向引物為5′-TCA GACAGCTTGAATTGCGTTGTCC-3′, PCR體系含, cDNA 2 μL、10×PCR緩沖液5 μL、2.5 mmol L–1dNTPs 4 μL、2 mmol L–1MgSO43 μL, 10 μmol L–1上下游引物各1.5 μL、KOD DNA聚合酶1 μL, ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR程序?yàn)?8℃ 3 min; 98℃ 5 s, 55℃ 10 s, 68℃ 1min, 35個(gè)循環(huán); 暫停PCR程序, 加入1 μL KOD DNA聚合酶, 68℃ 10 min。電泳檢測(cè)將PCR產(chǎn)物送交南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序, 獲得目的基因序列。

1.4 序列信息分析

利用http://www.soybean.org/網(wǎng)站提供的數(shù)據(jù)庫分析核實(shí)基因序列, 利用 http://www.ncbi.nlm.nih. gov/網(wǎng)站的 BlastP程序分析目的蛋白的結(jié)構(gòu)域和預(yù)測(cè)保守氨基酸。采用 Invitrogen公司的 Vector NTI軟件進(jìn)行多重比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.5 基因表達(dá)分析

根據(jù) GmMYB52序列, 設(shè)計(jì)適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物。F: 5′-GAAGCACAGGTACGTGAT AGAG-3′, R: 5′-GAACTACCAACCGGGACATT-3′,選取大豆看家基因(Glycine max actin-1-like, GmActin登錄號(hào)為XM_003552652)為內(nèi)參基因(F: 5′-CGG TGGTTCTATCTTGGCATC-3′, R: 5′-GTCTTTCGCT TCAATAACCCTA-3′)。采用從TaKaRa公司購買的SYBR Green Super Mix, 參照Roche 2.0 Real-time PCR Detection System設(shè)計(jì)反應(yīng)程序, 所有操作均按說明書進(jìn)行, 試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 GmMYB52的亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)GmMYB52最長(zhǎng)的開放閱讀框設(shè)計(jì)特異性引物, F: 5′-TGCTCTAGA ATGACTCGGCGCTGCTCC CACTGCA-3′和R: 5′-CGCGGATCC GACAGCTTGA ATTGCGTTGTCC-3′ (下畫線處分別為Xba I和BamH I酶切位點(diǎn)), 采用東洋坊公司的KOD高保真酶擴(kuò)增獲得GmMYB52全長(zhǎng)ORF (去除終止密碼子TGA), 與pJIT166-35S-EGFP載體連接構(gòu)建pJIT166-GmMYB52-GFP融合表達(dá)載體, 在 PEG 介導(dǎo)下將 pJIT166-GmMYB52-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體, 25℃培養(yǎng)24 h, 采用激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM-510META, Germany)觀察GFP信號(hào), 確定其亞細(xì)胞定位。

1.7 轉(zhuǎn)錄激活功能驗(yàn)證分析

根據(jù) GmMYB52的編碼區(qū)(CDS)設(shè)計(jì)特異性引物, F: 5′-TCCCCCGGG ATGACTCGGCGCTGCTC CCACTGCA-3′, R: 5′-CGCGGATCC TCAGACAGCT TGAATTGCGTTGTCC-3′ (下畫線處分別為Sma I和BamH I酶切位點(diǎn)), 擴(kuò)增GmMYB52的ORF連入酵母表達(dá)載體pGBKT7, 構(gòu)建與BD (binding domain)翻譯融合的效應(yīng)重組質(zhì)粒 pGBKT7-GmMYB52, 參考Clonetech公司的酵母轉(zhuǎn)化體系說明書, 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后用乙酸鋰沉淀法轉(zhuǎn)入釀酒酵母Y187, 同時(shí)轉(zhuǎn)入響應(yīng)的空載體為對(duì)照。均勻涂于SD/–Trp單缺陷平板上, 結(jié)合菌落PCR 篩選陽性轉(zhuǎn)化子; 將篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子接入 YPDA培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng) 2～3 d后,均勻涂在 SD/–Trp/–His/–Ade三缺陷平板上劃板培養(yǎng), 觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況, 再挑選轉(zhuǎn)化子涂于SD/–Trp/–X-gal顯色平板, 進(jìn)行 β-半乳糖苷酶活性檢測(cè), 并照相記錄。

1.8 DNA結(jié)合功能分析

將GmMYB52的編碼區(qū)與酵母表達(dá)載體pGADT7連接, 構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGADT7-GmMYB52。參照之前的報(bào)道設(shè)計(jì)若干MYB轉(zhuǎn)錄因子基序序列[12,17], 通過引物設(shè)計(jì)將序列連接到酵母載體 pHIS2.1, 構(gòu)建含有目標(biāo)基序的重組質(zhì)粒。測(cè)序驗(yàn)證后用乙酸鋰沉淀法將2個(gè)重組質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入釀酒酵母Y187, 以轉(zhuǎn)入空載體為陰性對(duì)照, 轉(zhuǎn)入帶有 P53的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照, 然后均勻涂于 SD/–Trp/–His雙缺陷平板上, 結(jié)合菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子, 以YPDA培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng) 2～3 d后, 在加有 80 mmol L–1的 3-AT的SD/–Trp/–Leu/–His三缺陷平板上畫線培養(yǎng), 觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況, 并照相記錄。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 t測(cè)驗(yàn)(t-test)測(cè)定數(shù)據(jù)間的差異顯著性, P值小于等于 0.05 (P ≤ 0.05)為差異顯著, P值小于0.01 (P ≤ 0.01)為差異極顯著。方差分析使用SPSS軟件, 采用最小顯著差數(shù)(LSD)法進(jìn)行多重比對(duì), P值小于等于 0.05 (P ≤ 0.05)為差異顯著。試驗(yàn)重復(fù)至少3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmMYB52的克隆和序列分析

以栽培大豆的cDNA為模板, 利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出 GmMYB52的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)。將獲得序列與公布的Williams 82數(shù)據(jù)庫比對(duì)顯示, 編碼 GmMYB52的基因序列位于大豆的第15條染色體。其mRNA全長(zhǎng)為1367 nt, 編碼區(qū)(CDS)為1083 bp。編碼區(qū)內(nèi)有2個(gè)內(nèi)含子, 分別長(zhǎng)1426 bp和216 bp (圖1)。

圖1 GmMYB52結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Gene structure of GmMYB52

GmMYB52編碼蛋白共有 360個(gè)氨基酸, 與NCBI的數(shù)據(jù)庫比對(duì)顯示, 該蛋白與大豆蛋白GmMYB62, 木豆蛋白 MYB-like Protein J, 苜蓿蛋白 MtMYB52, 擬南芥蛋白 AtMYBSt1, 水稻蛋白OsMYBS3相似度較高, 其相似性分別為91%、82%、75%、56%和50%。生物信息學(xué)分析顯示, 它們的N端具有一個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)域(圖2中標(biāo)*號(hào)部分), 位于GmMYB52的R4-P20; 中間都有R1一個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域(圖2中下畫線部分), 位于GmMYB52的P116-Y159。GmMYB52屬于第一類MYB蛋白(1R-MYB)。

利用軟件對(duì)相關(guān)MYB類蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,表明, GmMYB52與GmMYB62的親緣關(guān)系最近, 與木豆中的 CcMYB-like Protein J、擬南芥中的AtMYBSt1親緣關(guān)系也比較近(圖3)。推測(cè)這類蛋白有類似的功能。

2.2 GmMYB52的表達(dá)分析

分別用高鹽、PEG (模擬干旱)、低溫(4℃)以及脫落酸(ABA)處理大豆, 并在不同時(shí)間段提取根部RNA, 用 Real-time PCR監(jiān)測(cè) GmMYB52的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示, 100 μmol L–1ABA處理和4℃處理, 會(huì)使得GmMYB52轉(zhuǎn)錄水平在處理后0.5 h開始上調(diào),在處理后12 h達(dá)到最高峰(圖4)。用200 mmol L–1的NaCl和20% PEG處理時(shí), GmMYB52的轉(zhuǎn)錄水平在處理0.5～1.0 h后呈現(xiàn)出先上調(diào)再下調(diào)的振蕩模式,其中用NaCl處理后在0.5 h發(fā)生微弱下調(diào), 在6 h上調(diào)約6倍, 12 h明顯下調(diào), 24 h又明顯上調(diào)(圖4);用20% PEG處理在0.5～1.0 h就出現(xiàn)了上調(diào), 隨后出現(xiàn)波動(dòng)升降, 處理后24 h表達(dá)量最高, 約為0 h的6倍(圖4)。

用 Real-time PCR檢測(cè)大豆不同生長(zhǎng)時(shí)期組織的GmMYB52的RNA, 顯示轉(zhuǎn)錄水平在幼苗期和開花期相對(duì)較高, 在成熟期相對(duì)較低。GmMYB52在莖、葉、花中有較高的表達(dá), 在根中表達(dá)相對(duì)較低,在豆莢和成熟期的根中幾乎不表達(dá)(圖5)。

2.3 GmMYB52定位于細(xì)胞核部位

構(gòu)建 pJIT166-GmMYB52-GFP重組質(zhì)粒, 通過PEG介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體。在25℃條件下培養(yǎng) 24 h, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察。顯示, pJIT166-GFP空載體可以在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞膜中檢測(cè)到 GFP的熒光信號(hào), 而 pJIT166-GmMYB52-GFP的信號(hào)幾乎都集中在細(xì)胞核中(圖6), 符合轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。

圖2 GmMYB52與其他MYB類同源蛋白序列多重比對(duì)Fig. 2 Multi-alignment of GmMYB52 with other MYB type proteins

2.4 GmMYB52具有轉(zhuǎn)錄激活功能

構(gòu)建具有GAL4 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的pGBKT7-GmMYB52酵母表達(dá)重組質(zhì)粒, 分別將 pGBKT7-GmMYB52、pGBKT7 (陰性對(duì)照)、pGBKT7-P53 (陽性對(duì)照)轉(zhuǎn)入酵母菌株Y187中。三者在酵母單缺培養(yǎng)基 S D (–T r p)中均能夠正常生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)入pGBKT7-P53和pGBKT7-GmMYB52的酵母菌株可以在二缺培養(yǎng)基 SD (–Trp, –His)中生長(zhǎng), 陰性對(duì)照轉(zhuǎn)入pGBKT7的酵母菌株無法在二缺培養(yǎng)基中生長(zhǎng),說明效應(yīng)基因都能夠正常表達(dá), 激活了下游的 his3報(bào)告基因, 使其能夠在His缺陷培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。將含有這3種轉(zhuǎn)化子的菌株在SD (–Trp/–X-Gal)進(jìn)行顯色反應(yīng), 轉(zhuǎn)入pGBKT7-P53和pGBKT7-GmMYB52的酵母菌株顯藍(lán)色, 轉(zhuǎn)入空載體pGBKT7的酵母菌株不顯色(圖7)。以上結(jié)果表明, GmMYB52具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖3 GmMYB52和其他植物MYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of GmMYB52 and MYBs from other plants

圖4 GmMYB52在不同處理下的表達(dá)Fig. 4 Expression of GmMYB52 in soybean under different treatments

圖5 GmMYB52的時(shí)空表達(dá)Fig. 5 Spatiotemporal expression of GmMYB52

2.5 GmMYB52可以結(jié)合MYB結(jié)合基序

為進(jìn)一步分析GmMYB52可能的結(jié)合位點(diǎn), 將GmMYB52連入 pGADT7載體, 同時(shí)選擇一系列MYB結(jié)合系列序列[12], 連入了pHIS2.1, 將pGADT7-GmMYB52與連入相應(yīng)序列的pHIS2.1共同轉(zhuǎn)入酵母 Y187中, 檢測(cè) His報(bào)告基因的表達(dá)來分析GmMYB52的結(jié)合活性。有趣的是, 我們發(fā)現(xiàn)GmMYB52可以激活pHis2.1空載體的His報(bào)告基因的表達(dá)。因此, 我們將pHis2.1的多克隆位點(diǎn)序列在網(wǎng)站http://jaspar.genereg.net/進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)分析, 發(fā)現(xiàn)其多克隆位點(diǎn)(MCS)上含有潛在的 MYB結(jié)合基序 AGTGGATCCA (圖 8加粗斜體部分)。除了pHIS2.1空載體外, GmMYB52還與mMBSI、MRE4、MYB-motif[12,19]有較強(qiáng)的結(jié)合活性。與 MRE1、mMRE1、MRE3、mMRE4也有一定結(jié)合活性, 與MBS1、mMRE3沒有結(jié)合活性(圖 8)。以上結(jié)果表明, GmMYB52可以與特定的基序相結(jié)合, 并調(diào)控下游基因的表達(dá)。

圖6 GmMYB52的亞細(xì)胞定位Fig. 6 Sub-cellular localization of GmMYB52

圖7 GmMYB52蛋白在酵母單雜交系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄激活活性分析Fig. 7 Assay of transcriptional activation ability of the GmMYB52 protein by yeast expression system

3 討論

MYB類轉(zhuǎn)錄因子作為植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 在植物的生長(zhǎng)發(fā)育, 激素信號(hào)通路, 逆境脅迫響應(yīng)中都起重要的作用。本研究分離鑒定出的GmMYB52屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族當(dāng)中的1R-MYB,該類 MYB蛋白與之前利用同一表達(dá)譜克隆出的2R(R2R3)類 GmMYB111分屬于不同家族。一般認(rèn)為, 1R類家族的基因一般參與胚形態(tài)發(fā)生、次生代謝途徑、生物鐘、磷饑餓以及花和果實(shí)的發(fā)育[21]。2R類MYB是植物MYB家族類最大的一個(gè)亞類, 主要參與調(diào)節(jié)初生和次生代謝, 生長(zhǎng)發(fā)育以及響應(yīng)生物和非生物脅迫[2,23-24]。我們的結(jié)果顯示, 盡管GmMYB52屬于1R類MYB轉(zhuǎn)錄因子, 仍然能夠受到各種非生物逆境的誘導(dǎo), 但 GmMYB52在逆境脅迫下的表達(dá)模式與GmMYB111不盡相同, GmMYB52在ABA的處理下, 并沒有表現(xiàn)出GmMYB111的明顯振蕩模式, 而是先上調(diào)后下調(diào)。在高鹽處理下, GmMYB52和GmMYB111都表現(xiàn)出一定的振蕩模式。在干旱處理下, GmMYB52的轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)出一定的振蕩模式, GmMYB111則是先上調(diào)后下調(diào), 在低溫處理下, GmMYB111和GmMYB52的表達(dá)均上調(diào)。以上結(jié)果暗示了1R類MYB轉(zhuǎn)錄因子和2R類MYB轉(zhuǎn)錄因子在功能上既有重疊, 也有不同, 且GmMYB52也有可能參與非生物逆境的響應(yīng)。時(shí)空表達(dá)模式的結(jié)果表明, GmMYB52在幼苗期和開花期的表達(dá)較高,在根莖葉花中的表達(dá)較高, 暗示 GmMYB52主要參與植株早期的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。這與之前發(fā)表的GmMYB111表達(dá)模式相似[19]。

圖8 GmMYB52蛋白在酵母單雜交系統(tǒng)中的結(jié)合基序分析Fig. 8 Motif sequence binding analysis of GmMYB52 by one-hybrid system

對(duì)植物中 MYB轉(zhuǎn)錄因子的特定結(jié)合基序已經(jīng)有了較為廣泛的研究。一般認(rèn)為, MYB轉(zhuǎn)錄因子均可以結(jié)合一個(gè)或多個(gè)順式 DNA序列。不同類型的MYB蛋白可以結(jié)合不同的基序。擬南芥中的AtMYB2和哺乳動(dòng)物中的 MYB類轉(zhuǎn)錄因子(如c-MYB、A-MYB、B-MYB)都可以結(jié)合MBSI基序。大豆中的MYB類轉(zhuǎn)錄因子GmMYB76、GmMYB92、GmMYB177也可以與MBSI結(jié)合[12,25-26]。在本實(shí)驗(yàn)中, GmMYB52與MBSI序列沒有結(jié)合, 但是與其相應(yīng)的突變基序mMBSI卻有較強(qiáng)的結(jié)合活性。這很可能意味著GmMYB52與之前報(bào)道的GmMYB76、GmMYB92和GmMYB177調(diào)控不同類型的下游基因。除了MBSI和mMRE3以外, GmMYB52與包括空載體多克隆位點(diǎn)在內(nèi)的 DNA序列均有不同程度的結(jié)合, 說明GmMYB52參與調(diào)控的下游基因可能比較廣泛。

大部分MYB類轉(zhuǎn)錄因子都具有轉(zhuǎn)錄激活活性,一般來說, 相對(duì)于DNA結(jié)合域, 轉(zhuǎn)錄激活區(qū)都在蛋白的中部或 C端, 富含酸性氨基酸[27]。但是相對(duì)于N端, C端的序列變化較大, 很可能是因?yàn)榧せ钣虻牡鞍捉Y(jié)構(gòu)較為多變。并非所有的 MYB類轉(zhuǎn)錄因子都一定要具備轉(zhuǎn)錄激活功能, 也有研究表明, 有一些 MYB類轉(zhuǎn)錄因子可能具有轉(zhuǎn)錄抑制的功能[25]。本研究顯示, GmMYB52具有轉(zhuǎn)錄激活功能。與GmMYB52同源性較高的MYB類轉(zhuǎn)錄因子C端保守區(qū)均富含谷氨酰胺(Q)和脯氨酸(P), 我們推測(cè)這個(gè)區(qū)域在激活下游基因方面起關(guān)鍵作用。

基因組分析顯示, 大豆中共有206個(gè)MYB類蛋白, 進(jìn)一步的研究確證了其中的156個(gè)[12,28]。這156個(gè)MYB蛋白中有55個(gè)與擬南芥中的很多MYB蛋白有較多的同源性。我們的結(jié)果顯示, GmMYB52在擬南芥、水稻、苜蓿中都能找到相似度較高的同源蛋白, 這表明MYB類蛋白在進(jìn)化中的功能相對(duì)保守。

植物在其生長(zhǎng)過程中, 需要應(yīng)對(duì)外界的各種非生物脅迫, 轉(zhuǎn)錄因子在其中起著非常重要的調(diào)控作用。研究顯示, 編碼156個(gè)MYB蛋白的基因中有大約27%受到ABA, 高鹽、低溫和干旱逆境的誘導(dǎo)[12],說明 MYB類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物應(yīng)答非生物脅迫非常關(guān)鍵。GmMYB52也同樣受到這四種常見的非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。這說明GmMYB52很可能也參與植物響應(yīng)這些非生物脅迫的信號(hào)通路。對(duì)GmMYB52的詳細(xì)生物學(xué)功能仍需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

分離和鑒定了大豆中的 MYB類轉(zhuǎn)錄因子GmMYB52, 該基因?qū)儆?1R類 MYB轉(zhuǎn)錄因子。GmMYB52在植物中有組成型表達(dá), 其在根部的表達(dá)受ABA、干旱、高鹽、低溫的誘導(dǎo)。GmMYB52定位于細(xì)胞核, 有轉(zhuǎn)錄激活活性, 并可以結(jié)合若干MYB相關(guān)順式轉(zhuǎn)錄原件。推測(cè) GmMYB52可能與ABA信號(hào)、非生物脅迫應(yīng)答和苗期及開花期的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。

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Isolation, Expression and Binding Function Analysis of the Transcription Factor GmMYB52 in Soybean

XU Ling**, WANG Yuan-Cong**, HE Xiao-Lan, HUANG Yi-Hong, XU Zhao-Long, SHAO Hong-Bo*, and ZHANG Da-Yong*

Institute of Agricultural Resources and Environment, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Salt-soil Agricultural Research Center, Nanjing 210014, China

The MYB type transcription factors are involved in plant development and response to abiotic stress. GmMYB52 was significantly up-regulated after salt treatment. In order to gain more information about GmMYB52, GmMYB52 of Williams 82 was cloned by RT-PCR. Bioinformatic analysis showed the CDS of GmMYB52 was 1083 bp, encoding 360 amino acid residues. A MYB domain was found in the region of 110 to 160 amino acid residues from N-terminal. Blast results showed that GmMYB52 are highly homologous to GmMYB62, AtMYBSt1 from Arabidopsis, MtMYB52 from Medicago sativa, OsMYBS3 from Oryza sativa, and CcMYB-like protein J from Cajanus cajan. Quantitative PCR (qPCR) results indicated that the transcription level of GmMYB52 was upregulated under ABA and low temperature stresses, under salt, drought and cold stresses, show a bimodalpattern. GmMYB52 was nearly expressed in all detected tissues, except in pods at maturing stage, and its expression level was relatively higher at seedling or flowering stages than those at maturing stage. The transcription level of GmMYB52 was high in stem, leaf, and flower, during seedling and blooming stages, and low in root and pods during maturity stage. Subcellular localization results showed that GmMYB52 was located in the nucleus which is in agreement with the localization characteristics of typical transcription factors. Yeast hybrid assay indicated that GmMYB52 had transcriptional activation functions and could bind to several MYB cis-acting element motifs. In conclusion GmMYB52 is a typical 1R-MYB transcription factor, and able to bind MYB cis-acting element motifs. We speculate GmMYB52 is involved in response to the abiotic stress and ABA signal transduction pathway.

Soybean; GmMYB52; Expression analysis; MYB motif; Transcriptional activation activity

(

): 2017-02-08; Accepted(接受日期): 2017-04-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-05-11.

10.3724/SP.J.1006.2017.01458

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31600211, 31101166), 江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20151364)和江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目(CX(15)1005)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31600211, 31101166), the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, and the Independent Innovation Project for Agricultural Science and Technology of Jiangsu Province [CX(15)1005].

*通訊作者(Corresponding authors): 張大勇, E-mail: cotton.z@126.com, Tel: 025-84391105; 邵宏波, E-mail: shaohongbochu@126.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

聯(lián)系方式: E-mail: xuling@jaas.ac.cn, Tel: 025-84390351

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170511.1152.006.html