單丹 王利華 張月亮 韓陽春 牛洪濤 潘磊 方繼朝1,,*

(1南京農業(yè)大學 植物保護學院，南京 210095；2江蘇省農業(yè)科學院 植物保護研究所，南京 210014；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail: fangjc126@126.com)

褐飛虱熱激蛋白70在不同溫度脅迫下的差異表達特性研究

單丹1,2,#王利華2,#張月亮2韓陽春2牛洪濤2潘磊2方繼朝1,2,*

(1南京農業(yè)大學 植物保護學院，南京 210095；2江蘇省農業(yè)科學院 植物保護研究所，南京 210014；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail: fangjc126@126.com)

【目的】褐飛虱是我國主要水稻害蟲之一，隨著全球氣候變暖，其越冬范圍逐年擴大。為了明確褐飛虱對溫度的適應機制，研究了其熱激蛋白70基因家族的組成及溫度誘導表達特性?！痉椒ā坷棉D錄組測序和GenBank數據庫獲取熱激蛋白70基因序列，采用MEGA4.1鄰接法構建進化樹，利用實時熒光定量PCR研究其溫度誘導表達特性?！窘Y果】篩選出與熱激蛋白70基因同源性較高且具有完整開放閱讀框的序列共15個，其中8個在正?；驕囟让{迫下表達，可能分布在細胞質/細胞核、內質網、線粒體等器官，且本身表達豐度存在顯著差異。30～44℃高溫脅迫后KX976471、KX976473、KX976475、KX976476、KX976477和KX976478等6個基因的表達量不同程度上調，最大上調倍數為1.72～245.33；0～22℃低溫脅迫后，除KX976475表達量上調2.38倍外，其余基因表達量變化不顯著或下降?！窘Y論】褐飛虱8個熱激蛋白70基因在正常或溫度脅迫下表達，可能分布于細胞質/核、線粒體、內質網；在其高溫適應性中可能起重要作用，但在低溫適應性中的作用有限。

褐飛虱；溫度；熱激蛋白70；誘導表達

褐飛虱是危害我國水稻的三種主要稻飛虱之一。據統(tǒng)計，自20世紀以來，褐飛虱在東亞的暴發(fā)次數超過10次，而且危害有加重的趨勢[1]。江蘇省2004－2013 年的 10 年間，有3年褐飛虱大發(fā)生，3年偏重及偏重至大發(fā)生。廣西省1991－2012年的22年間，褐飛虱偏重或大發(fā)生年份竟占17年，中等發(fā)生年份僅為5年[2]。貴州省江口縣在1977－2007間，大發(fā)生年份有5年，中等偏重發(fā)生年份有5年[3]。

褐飛虱的發(fā)生受多種因素的影響。稻田生態(tài)系統(tǒng)自我調節(jié)能力差、水稻品種敏感、遷入蟲量大、氣候適宜等是褐飛虱大發(fā)生的主要原因[1]。褐飛虱最適發(fā)育溫度為24～28℃[4,5]。28℃時產卵量最高，發(fā)育歷期最短；34℃是其發(fā)育的限制性高溫，該溫度下卵不能孵化[5]。褐飛虱對高溫具有一定的適應性。在一定的范圍內，適當提高溫度有利于褐飛虱繁殖，促進其種群發(fā)展[6,7]。Ghobadifar等[8]發(fā)現(xiàn)，在29～32℃氣溫下田間仍有褐飛虱活動；但是發(fā)生季節(jié)連續(xù)低溫抑制褐飛虱的發(fā)育，導致低齡幼蟲死亡，使其種群數量急劇減少[9]。

熱激蛋白70是熱激蛋白家族主要成員之一，在進化上高度保守。熱激蛋白70家族主要包括4個成員，分別是誘導性熱激蛋白70、組成型熱激蛋白70、葡萄糖調節(jié)蛋白78 和GRP75[10]。其中，誘導性熱激蛋白70正常情況下不表達或者低表達，但在溫度等脅迫因子處理后，其表達量急劇上升；組成型熱激蛋白70在正常環(huán)境下表達，在溫度等脅迫因子作用下，其表達量輕微上升或不變；葡萄糖調節(jié)蛋白78主要位于內質網；GRP75主要位于線粒體內[10]。熱激蛋白70在生物對溫度脅迫的抗逆性中起重要作用。如蘋果實蠅、始紅蝽熱激蛋白70表達量增加使其對高溫或低溫的耐受性增強[11,12]。為了明確褐飛虱對溫度脅迫的適應機制，本研究篩選并克隆了正?；驕囟让{迫下表達的熱激蛋白70家族基因序列，比較了這些基因在高溫和低溫處理后的表達特性，以期為了解溫度脅迫下褐飛虱種群發(fā)展的內在機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試褐飛虱

供試褐飛虱于2006年采自南京，室內采用武運粳7號飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件如下：溫度27±1℃，相對濕度為65%，光周期為14h光照/10h黑暗。

1.2 熱激蛋白70基因的篩選

褐飛虱熱激蛋白70基因序列來源于轉錄組數據庫。首先根據基因注釋，從我們測定的褐飛虱轉錄組數據庫中篩選熱激蛋白70基因，然后再根據基因同源性搜索GenBank 褐飛虱轉錄組數據庫，獲得已登錄的熱激蛋白 70基因序列。在獲得這些序列后，采用Sequencher 4.7組裝排除重復序列。

1.3 褐飛虱溫度相關熱激蛋白70基因的克隆和序列分析

分別采用39℃、14℃溫度處理褐飛虱，收集處理1h試蟲和未處理試蟲，提取總 RNA?？?RNA提取參照Promega公司的總RNA提取試劑盒(SV Total RNA Isolation System)說明書進行。將液氮速凍試蟲研磨后加入175 μL裂解液，然后加入350 μL RNA稀釋緩沖液，70℃下 3 min后，4℃下離心20 min。然后過柱、加入DNA酶后漂洗；最后加入100 μL無核酸酶的雙蒸水洗脫。提取總RNA后使用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(Eppendorf BioPhotometer Plus) 檢測RNA的完整度、純度與濃度，－80℃下超低溫冰箱貯存。

熱激蛋白70基因克隆時將39℃、14℃溫度處理和對照總 RNA等比例混合，反轉錄成cDNA，然后根據熱激蛋白70基因序列，設計引物，克隆溫度相關的熱激蛋白70基因。采用ScanProsite 分析克隆序列的保守區(qū)域，預測其等電點、分子量等，采用DNAssist進行序列比對，利用Mega 4.1構建分子進化樹。

1.4 熱激蛋白70基因表達量分析

1.4.1 試蟲處理

褐飛虱熱激蛋白70基因豐度分析時，試蟲直接取羽化1d的雌成蟲，提總 RNA，然后進行qPCR分析。

溫度誘導熱激蛋白70基因表達特性分析時，收集羽化1d雌成蟲，分別在低溫0、6、10、14、18、22℃和高溫30、33、36、39、42、44℃下處理1h，26℃恢復1h，液氮速凍后存于－80℃冰箱，用于總RNA提取。每處理3次重復，每重復6頭。

1.4.2 總 RNA提取

總 RNA提取采用Promega公司總RNA提取試劑盒(SV Total RNA Isolation System)進行。方法與1.3同。在微量分光光度計測定RNA的濃度后，根據濃度計算cDNA第1鏈合成時所需的模板體積。

1.4.3 cDNA第1鏈的合成

cDNA第1鏈的合成采用TaKaRa的實時定量PCR反轉錄試劑盒[PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)]進行。根據試劑盒說明書，以500 ng總 RNA為模板，加入2 μL 含反轉錄酶預混液(5×PrimeScript RT Master Mix)，然后以無RNA酶雙蒸水補至10 μL，37℃下溫育30 min，85℃下10s滅活反轉錄酶即得到第1鏈cDNA。

表1 褐飛虱熱激蛋白70基因qPCR引物序列Table 1. Primer sequences of heat shock protein 70 genes for qPCR in N. lugens.

表2 從轉錄組數據庫篩選到的褐飛虱熱激蛋白70基因Table 2. Heat shock protein 70 genes of N. lugens screened from transcriptomic database.

1.4.4 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR(qPCR)參考王利華等[13]的方法進行，以β-actin(EU179846)為內參[14]，取1 μL稀釋20倍的cDNA為模板，分別加入10 μL含Taq酶的qPCR預混液[ SYBR?Premix Ex Taq?、0.4 μL ROX Reference Dye (50×)]、和0.4 μL 10 μmol/L 上游和下游引物(引物序列見表1)，以水補至20 μL。先95℃下預變性30 s，然后95℃下 5 s，60℃下31 s，共40個循環(huán)，最后進行溶解曲線的擴增。

1.5 數據分析

熱激蛋白相對表達量的計算采用2-ΔΔCT法[15]。豐度比較時，以表達量最低的基因為對照，分別計算其他7個基因的相對表達量。溫度誘導表達量的計算以正常飼養(yǎng)試蟲為對照，結果采用SPSS 19.0ANOVA進行方差分析，最小顯著性差異法在0.05水平上進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 熱激蛋白70基因篩選

從GenBank轉錄組數據庫獲得與熱激蛋白70同源性超過70%的基因序列22個，我們測定的轉錄組數據注釋為熱激蛋白70的序列共12個，排除重復序列后發(fā)現(xiàn)具有完整ORF的熱激蛋白70基因共15個，其中GANM01000978.1等14個基因可以在GenBank轉錄組數據庫中找到同源序列，N1400首次在褐飛虱中發(fā)現(xiàn)。這些基因與熱激蛋白70基因的氨基酸同源性最高達到100%（表2）。進化樹分析結果顯示同一物種不同組織間熱激蛋白70的同源性低于不同物種相同組織。GAYF02039790.1、GAYF02024777.1 與果蠅和人類的內質網熱激蛋白70序列聚為一類，GAYF02024329.1、GAYF02029723.1和GANM01021225.1 與線粒體熱激蛋白70聚為一類（圖1）。

圖1 褐飛虱與黑腹果蠅和人類的熱激蛋白70的進化樹Fig.1. Phylogenetic tree of HSP70 from N. lugens, Homo sapiens and Drosophila melanogaster based on Neighbor-Joining method.

表3 褐飛虱正?；驕囟让{迫下表達的熱激蛋白70序列及特征Table 3. Heat shock protein 70 genes cloned from N. lugens reared in normal condition or treated by high temperature stress.

2.2 褐飛虱正?；驕囟让{迫下表達的熱激蛋白70基因克隆及序列分析

RT-PCR結果表明在正常或溫度脅迫后，褐飛虱體內表達的熱激蛋白70基因共有8個，基因登錄號為KX976471-8。與NCBI轉錄組數據庫中相關重復序列的相似性為95.3%～99.8%。預測這些基因編碼的蛋白質分子量為66 801.97～75 283.42，等電點為4.94～6.15（表3）。所有基因都含有熱激蛋白70的三個標志性序列，N端有ATPase結構域。KX976472 C端還有內質網靶向序列，N端含有信號肽序列（圖2）。KX976477、KX976478 與其他6個基因相比N端ATPase結合區(qū)域前具有更長的堿基序列。

2.3 熱激蛋白70的豐度比較

圖2 克隆的褐飛虱熱激蛋白70氨基酸序列比對Fig. 2. Amino acid alignment of heat shock protein 70 cloned from N. lugens.

褐飛虱熱激蛋白70的豐度如圖3所示。正常情況下，8個熱激蛋白基因的表達存在顯著差異。按從高到低的順序排列依次為KX976471＞KX976472＞ KX976477＞ KX976473＞ KX976475＞KX976478＞ KX976476＞ KX976474。ANOVA數據分析結果顯示KX976471和 KX976472的表達量顯著高于其他6個熱激蛋白70基因。

2.4 溫度對熱激蛋白70的誘導

2.4.1 高溫對熱激蛋白70的誘導

30～44℃高溫處理后，褐飛虱熱激蛋白70的表達量存在顯著差異，KX976473和KX976476表達顯著上升，尤其是KX976473，在42～44℃處理后，其表達量提高200倍以上。KX976472和KX976474在處理前后表達量無顯著變化。其余4個基因KX976471、KX976475、KX976477和KX976478分別在44、30、39、33℃具有最高表達量，但是上升倍數均小于3倍（圖4）。

圖3 褐飛虱熱激蛋白70豐度分析Fig. 3. Comparison of abundance of heat shock protein 70 cloned from N.lugens.

圖4 高溫脅迫對褐飛虱熱激蛋白70基因表達量的誘導Fig. 4. Expression of heat chock protein 70 genes induced by high temperature in N. lugens.

圖5 低溫脅迫對褐飛虱熱激蛋白70基因表達量的誘導Fig. 5. Expression of heat chock protein 70 genes induced by low temperatures in N.lugens.

2.4.2 低溫對熱激蛋白70的誘導

低溫脅迫對褐飛虱熱激蛋白70表達的影響與高溫脅迫存在顯著差異。0～22℃低溫脅迫后，除KX976475的表達量在14℃上升2.38倍外，KX976474和KX976477的表達量變化不顯著，其余5個基因KX976471、KX976472、KX976473、KX976476和KX976478的表達被抑制，尤其是KX976473在14℃處理后，表達量下降約17倍(圖5)。

3 討論

昆蟲熱激蛋白70家族成員數量在不同種間差異較大。如家蠶(Bombyx mori)有10個熱激蛋白70基因，其中4個為誘導型，6個為組成型[16]。珍珠邊豹紋蝶(Glanville fritillary)有7個熱激蛋白70基因，其中1個可能位于內質網，6個位于細胞質[17]。褐飛虱熱激蛋白70家族至少包括15個成員，2個可能位于內質網，3個位于線粒體，其余位于細胞質或細胞核。位于內質網和線粒體的熱激蛋白70與一般熱激蛋白70的親緣關系較遠，其遺傳距離大于不同物種間相同器官來源的熱激蛋白70，這與果蠅熱激蛋白70進化特征一致[18]。

正常和溫度脅迫下表達的褐飛虱熱激蛋白70基因有8個，其中KX976473和KX976476為誘導型熱激蛋白70，KX976472位于內質網，KX976477和KX976478位于線粒體，其余4個基因為組成型熱激蛋白70。以溫度脅迫和正常試蟲混合cDNA為模板，尚有7個熱激蛋白70基因沒有克隆出來。這可能有兩方面的原因。一是這些基因表達豐度很低，在檢測下限之下；二是這些基因可能與溫度脅迫保護無關，而是對溫度以外的其他脅迫因子負責。

熱激蛋白70在生物應對高溫、農藥等環(huán)境脅迫中起重要作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)害蟲如梨小食心蟲(Grapholita molesta)、珍珠邊豹紋蝶、柑桔紅螨(Panonychus citri)、三葉草斑潛蠅(Liriomyza trifolii)、煙粉虱(Bemisia tabaci)、蘋果蠹蛾(cydia pomonella)、臭蟲(Cimex lectularius)等熱激蛋白70與其溫度適應性有關，在溫度脅迫后表達量急劇上升[17,20-25]。而且不同器官來源的熱激蛋白70在減少脅迫傷害中具有一定的協(xié)同作用，如內質網和細胞質熱激蛋白70通過協(xié)同作用提高機體對高溫的適應性[26]。線粒體熱激蛋白70 (PnHSP70)在生物高溫、鹽、干旱等環(huán)境脅迫保護中也起重要作用[27]。高溫脅迫后，褐飛虱線粒體熱激蛋白和細胞質/細胞核熱激蛋白70表達量不同程度上升，可能促進其對高溫的適應。

熱激蛋白70家族不同成員具有不同的脅迫保護譜。蘋果蠹蛾CpHsp70-1對高溫脅迫具有保護作用，在高溫脅迫后表達量顯著上升，但對殺蟲劑脅迫不敏感[20]。珍珠邊豹紋蝶Hsp70和Hsc70在高溫熱激后表達量顯著上升，但低溫脅迫后，Hsp70表達量不變，Hsc70表達量僅輕微上升[17]。西花薊馬Fo-HSP70 的表達量與誘導溫度有關；0℃脅迫時表達量顯著上升；－4℃脅迫其表達量顯著下降；31～46℃高溫脅迫其表達量顯著上升[28]。柑桔紅螨3個熱激蛋白70基因對冷脅迫無反應，但PcHsp70-2在熱激后表達上調[22]。褐飛虱Nlhsc70在高溫脅迫后表達量顯著上升，但低溫脅迫后表達量變化不大[29]。本研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱8個熱激蛋白70中，僅有2個對高溫脅迫不敏感，其余6個基因在高溫處理后其表達量不同程度上升；而低溫脅迫后，除1個基因表達量輕微上調外，其余基因表達下降或無顯著變化。尤其是KX976473在高溫脅迫時表達量急劇上升，但低溫脅迫時顯著下降。這些結果說明褐飛虱高溫和低溫脅迫的保護機制可能存在差異，熱激蛋白70在褐飛虱高溫脅迫保護中起重要作用，但在低溫脅迫傷害中的作用不大。這可能與褐飛虱的生物學特性有關。褐飛虱是一種遷飛性害蟲，其越冬北界隨各年冬季氣溫高低而擺動于北緯21～25℃間，這些地區(qū)冬季日均最低氣溫在15℃左右，所以褐飛虱野外生存中一般不需應對極端低溫，因此，在進化上較少保留應對低溫脅迫的基因。

綜上所述，本研究通過轉錄組獲取了15個褐飛虱熱激蛋白70基因，其中8個可能與其溫度適應性有關。這些與溫度相關的熱激蛋白70基因可能分布在細胞質/細胞核、內質網、線粒體等器官，在褐飛虱溫度適應性中起不同的作用。正常情況或溫度脅迫后，這些基因的表達量存在顯著差異。大部分基因在高溫脅迫后表達量上升，低溫脅迫后下降或無變化，說明這些熱激蛋白70基因在高溫脅迫中可能起重要作用，但對低溫脅迫不敏感。

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Induced Expression Profiles of Hsp70s in Brown Planthoppers, Nilaparvata lugens, Under Different Temperatures

SHAN Dan1,2,#, WANG Lihua2,#, ZHANG Yueliang2, HAN Yangchun2, NIU Hongtao2, PAN Lei2, FANG Jichao1,2,*

(1College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: fangjc126@126.com)

【Objective】The brown planthopper (BPH), Nilaparvata lugens, is one of the major insect pests on rice in China. In recent years, the overwintering area of BPH expanded with global warming. In order to explore the response mechanisms of BPH to temperature, the hsp70s were cloned and the induced expression profiles of these genes were analyzed. 【Method】 The nucleotide sequences of hsp70s were gotten from transcriptome sequencing and GenBank database, the phylogenetic tree of HSP70 was based on neighbor-joining method by MEGA4.1, and the induced expression profiles were analyzed by real-time quantitative PCR. 【Result】 It was found that fifteen hsp70 homologous genes with complete open reading frame were gotten in BPH, and 8 out of 15 genes were expressed in normal conditions or temperature stress. These eight hsp70s were distributed in the cytoplasm/nucleus, endoplasmic reticulum or mitochondria, and had significantly different expression in normal conditions. After 30-44°C high temperature treatment, the expression levels of KX976471, KX976473, KX976475, KX976476, KX976477 and KX976478 were up-regulated, and the maximum increased times was 1.72-245.33. However, only the expression level of KX976475 increased by 2.38 times, the other seven were not changed or even significantly decreased in expression level after 0-22°C temperature treatment.【Conclusion】It was found that eight hsp70s were expressed in normal conditions or temperature stress in the cytoplasm/nucleus, endoplasmic reticulum or mitochondria. These hsp70s might play an important role in high temperature adaptation, but a limited role in cold adaptation in BPH.

Nilaparvata lugens; temperature; heat shock protein 70; induced expression

Q786; S435.112+.4

A

1001-7216(2017)05-0533-09

2016-12-23； 修改稿收到日期：2017-02-17。

國家自然科學基金資助項目（31572004；31301660）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK20130711），江蘇省農業(yè)自主創(chuàng)新資金資助項目（6111608）。