李路 徐以華梁夢琦王玲劉連盟侯雨萱 黎起秦黃世文,*

(1廣西大學 農(nóng)學院，南寧 530003；2中國水稻研究所，杭州 310006；*通訊聯(lián)系人，E-mail：qqli5806@gxu.edu.cn；huangshiwen@caas.cn)

水稻對穗枯病的抗病機理初步研究

李路1,2徐以華1,2梁夢琦2王玲2劉連盟2侯雨萱2黎起秦1,*黃世文1,2,*

(1廣西大學 農(nóng)學院，南寧 530003；2中國水稻研究所，杭州 310006；*通訊聯(lián)系人，E-mail：qqli5806@gxu.edu.cn；huangshiwen@caas.cn)

【目的】水稻在孕穗期比苗期更容易感染穗枯病(Bacterial panicle blight of rice)并出現(xiàn)病癥。本研究旨在探究水稻不同時期對穗枯病的抗性機理，為培育抗病水稻品種奠定基礎?！痉椒ā坎捎脟婌F法和注射法分別對苗期和孕穗期的抗、感病水稻品種接種穎殼伯克氏菌（Burkholderia glumae），測定處理組與對照組的3種抗氧化酶(POD、CAT、SOD)活性的差異，并利用實時熒光定量PCR測定5種防衛(wèi)反應基因(PR1a、PR10b、Rcht、LOX、PAL)的表達量?！窘Y(jié)果】B. glumae的侵染能引起水稻活性氧的積累，提高抗氧化酶活性，使部分防衛(wèi)反應基因大量表達，但是苗期和孕穗期的應答有較大區(qū)別。水稻孕穗期的抗氧化酶(SOD、CAT和POD)活性和防衛(wèi)反應基因(PR10b、Rcht和PAL)的表達量比苗期高，但PR1a和LOX的表達量卻低于苗期?！窘Y(jié)論】B. glumae能誘導孕穗期的水稻產(chǎn)生更多抗病反應，參與抗病反應的主要是水楊酸信號傳導途徑。

水稻；穗枯病；抗氧化酶；防衛(wèi)反應基因；實時熒光定量PCR

水稻穗枯病(Bacterial panicle blight of rice，BPBR)又稱水稻細菌性谷枯病(Bacterial grain rot of rice)，由Goto等[1]于1956年在日本發(fā)現(xiàn)，隨后在亞洲、南北美洲和非洲的20多個國家和地區(qū)均有報道[2]，可造成水稻大幅減產(chǎn)。2007年，水稻穗枯病被我國列為檢疫性病害[3]，但近幾年水稻穗枯病的發(fā)生越來越嚴重[4]。穎殼伯克氏菌(Burkholderia glumae)是穗枯病的病原菌，在水稻苗期和穗期分別引起水稻爛秧、谷粒變色和稻穗枯死[4]。當病原菌群體數(shù)量不大時，被侵染的苗期水稻不會表現(xiàn)明顯的病癥，病原菌潛伏在稻株內(nèi)，到孕穗期才爆發(fā)，引起稻穗枯死，但少量病原菌侵染稻穗，卻可以迅速引起谷粒變色[5]。同一種病原菌在寄主不同生長期侵染不同部位，以及寄主在不同生長期的抗性差異還鮮有報道。

植物在抵御病原菌侵染時能產(chǎn)生并積累活性院所基本科研業(yè)務費專項(2014RG005-2)；浙江省三農(nóng)六方項目(CTZB-F160728AWZ-SNY1-4)。氧(reactive oxygen species，ROS)。過多的ROS使植物體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫，導致細胞膜脂質(zhì)的過氧化，蛋白質(zhì)、色素、酶、核酸的氧化損傷，甚至植物死亡[6]。植物本身的防御機制，如一些酶促反應對ROS的累積進行清除，使ROS處于低水平的動態(tài)平衡，以此來維持植物的正常形態(tài)[7]。其中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)可將超氧陰離子自由基(O2·－)歧化成H2O2和O2，過氧化物酶(peroxidase,POD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)催化H2O2向H2O的轉(zhuǎn)化[8-9]。POD還是木質(zhì)素合成的關鍵酶，它參與木質(zhì)素的合成，促進傷口愈合，參與富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)結(jié)構的形成和將酚類物質(zhì)氧化為醌，增強植株對病原菌的抗性[10]。

防衛(wèi)反應基因在植物體內(nèi)快速累積和大量表達是植物抵抗病原菌侵染的必要條件。防衛(wèi)反應相關基因主要包括與植保素合成相關基因(如苯丙氨酸解氨酶基因PAL、脂氧合酶合成基因LOX)、病程相關基因(如幾丁質(zhì)酶基因Rcht、PR1酸性蛋白基因PR1a、類似核糖核酸酶基因PR10b)、與結(jié)構抗性有關的基因(木質(zhì)素合成有關基因)、核糖體失活蛋白(RIP)基因等。其產(chǎn)物直接作用于病原菌，限制病原的擴展、增殖和對寄主的破壞[11]。病程相關基因(PR基因)的表達是一種廣譜、非專性的抗性[12]。PR基因的誘導和表達與植物信號傳導途徑的啟動有關。目前研究較多的有茉莉酸(jasmonic acid, JA)信號傳導途徑和水楊酸(salicylic acid, SA)信號傳導途徑。JA途徑是亞麻酸通過脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)等酶的反應生成茉莉酸甲酯。SA途徑源于苯丙烷類代謝途徑，苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase, PAL)是與苯丙烷代謝酶途徑相關的關鍵酶[13]，PAL活性增強則進一步促進植物內(nèi)源SA的合成[14]。PAL還參與木質(zhì)素、植保素和酚類化合物的合成，與植物抗病性有密切聯(lián)系[15]。

本研究選用高感穗枯病和中抗水稻品種，通過噴霧法接種幼苗以及注射法接種幼穗，測定了受病原菌侵染后，苗期和穗期的水稻植株抗氧化酶的活性，以及防衛(wèi)反應基因的表達變化，初步探討了水稻不同時期對穗枯病的抗病機理差異。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)

1.1.1 水稻材料和菌種來源

經(jīng)兩年的接種鑒定，我們篩選出對穗枯病表現(xiàn)中抗的水稻品種鄂宜105以及高感品種輻恢838。所用水稻種子由國家水稻種質(zhì)資源中期庫提供。LMG2196(B.glumae)由浙江大學謝關林教授提供。

1.1.2 水稻秧苗培育及種植

水稻種子用3 %過氧化氫消毒24 h，滅菌水浸泡24 h后催芽。播種到含有滅菌土的塑料盒(18 cm×14 cm×12cm)中，置溫室(30℃)中培養(yǎng)。需長至穗期的水稻在苗齡25 d左右進行移栽。

1.1.3 菌懸液配制

將已活化的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中28℃下振蕩培養(yǎng)18 h，此時LMG2196處于生長對數(shù)期。4000 r/min下將菌體離心至管底，加0.9%滅菌生理鹽水稀釋，用分光光度計(UnicoUV-4802，中國)調(diào)菌液濃度至7×108CFU·mL-1(OD600= 0.517)。

1.2 接種及取樣

1.2.1 噴霧接種

于水稻2葉期，將濃度7×108CFU·mL-1的菌懸液均勻噴施在水稻葉片上，以噴施等體積生理鹽水的水稻為對照。

1.2.2 注射接種

水稻孕穗期時，用5 mL注射器將濃度7×108CFU·mL-1的菌懸液注射進穗苞，至穗苞頂部有菌懸液溢出，以注射等體積生理鹽水的水稻為對照。

1.2.3 取樣

試驗設8個時間點取樣，分別為接種后0、6、12、24、48、72、96和120 h。水稻苗期取莖葉，孕穗期取幼穗。樣品取完后放液氮速凍，置－80℃下保存。

1.3 抗氧化酶活性測定

1.3.1 酶液的制備

稱取0.1 g樣品，加0.9 mL滅菌生理鹽水，冰浴勻漿后，4℃、2500 r/min下離心10 min，取上清備用。

1.3.2 過氧化物酶(POD)活性的測定

用POD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)測定樣品中POD的活性。利用POD催化H2O2反應的原理，用分光光度計(UnicoUV-4802，中國)測定420 nm處的OD值，根據(jù)以下公式計算POD活性：

POD活性(U/mg)=(A測定管－A空白管)/(12×樣品蛋白濃度) ×4000/3

1.3.3 過氧化氫酶(CAT)活性的測定

用CAT測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)測定樣品中CAT的活性。CAT分解H2O2可被H8MoN2O4迅速中止，剩余的H2O2與H8MoN2O4產(chǎn)生淡黃色絡合物，測定其在405 nm處的OD值，根據(jù)以下公式計算CAT的活性。

表1 熒光定量PCR的引物Table 1. Specific primers for real-time PCR

CAT活力(U/mg)=(A對照管－A測定管)/60×271/(取樣量×樣品蛋白濃度)

1.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

用SOD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)測定樣品中SOD的活性。O2·－氧化羥胺形成亞硝酸鹽，加入顯色劑后呈現(xiàn)紫紅色。測定其在550 nm處的吸光值，根據(jù)以下公式計算總SOD活力。

總SOD活力(U/mg)=2×(A對照管－A測定管)/ A對照管×反應液總體積/(取樣量×樣品蛋白濃度)

1.4 防衛(wèi)基因表達量分析

1.4.1 RNA提取及檢測

采用Trizol法提取葉片的總RNA[16]。葉片用液氮研磨后加入1 mL的Trizol(Invitrogen，美國)混勻，12 000 r/min、4℃下離心5 min，取上清加500 μL氯仿混勻，12 000 r/min、4℃下離心15 min，取上清加入500 μL異丙醇混勻，12 000 r/min、4℃下離心10 min，棄上清，加入1 mL 80 %乙醇(－80℃提前預冷)混勻，12 000 r/min、4℃下離心2 min，棄乙醇，加入適量 DEPC ddH2O溶解。取1 μL用Nanodrop 2000(ThermoScientific，美國)測定RNA的濃度。剩余RNA 保存于－80℃下備用。

1.4.2 cDNA合成

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kit, ToYoBo，日本)的步驟，將總RNA加DEPC水至12 μL，65℃下變性后放冰上冷卻2 min，加4 μL 4倍濃度的降解預混液(4× DNA Master Mix)與基因組DNA清除劑(gDNA Remover)的混合物，37℃下放置15 min，去除總RNA中的gDNA，加4 μL 5倍濃度的反轉(zhuǎn)錄預混液(5×RT Master Mix Ⅱ)，37℃下放置15 min，50℃下放置5 min，最后98℃下放置5 min。

1.4.3 目的基因的實時PCR擴增

試驗所用的引物列在表1，其中泛素基因(Ubq)為內(nèi)參基因。PCR擴增反應體系為20 μL，其中包括1 μL模板，10 μL 2倍濃度的SYBR Green染色法PCR預混液( 2×SYBR Green PCR Master Mix, VazymeAceQTM，中國)，0.2 μL引物(10 μmol/L)和8.6 μL ddH2O。擴增條件如下：95℃下5 min；95℃下5 s，55℃/58℃ 下10 s，72℃下15 s，40個循環(huán)。擴增結(jié)束后，Bio-Rad FX96熒光定量PCR(Bio-Rad，德國)自動顯示Ct值。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析

水稻苗期以未接種病原菌的處理(－Bg)為對照，采用相對定量2－△△Ct法[17]計算接種病原菌處理(+Bg)中各基因的相對表達量。孕穗期以苗期表達量為對照，計算孕穗期相對苗期的各基因表達量變化。取3個重復的平均值計算樣品和對照處理的差異表達比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期和穗期不同抗性水稻品種抗氧化酶的活性

2.1.1 POD的活性

接種病原菌后，兩個水稻品種的POD活性總體高于同期對照。苗期，非親和反應比親和反應的POD活性更強且相對于對照的凈增加值也更大。非親和反應在接種6 h和96 h有兩次高峰，而親和反應只在6 h有最高峰(圖1-A)。水稻孕穗期的POD活性高于苗期，親和反應與非親和反應的POD在接種后24 h有最高活性，非親和反應在72 h后有上升趨勢(圖1-B)。說明水稻孕穗期的POD活性凈增加量高于苗期，非親和反應中的POD活性高于親和反應。

圖1 不同抗性水稻品種中過氧化物酶(POD)的活性Fig. 1. Activity of peroxidase(POD) in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

圖2 不同抗性水稻品種中過氧化氫酶(CAT)的活性Fig. 2. Activity of catalase(CAT) in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

2.1.2 CAT的活性

接種B. glumae后，水稻苗期和孕穗期的CAT活性都處于低水平，非親和反應中的活性更高，凈增加值更大。苗期接種后，非親和反應的CAT活力在24 h有最高峰，親和反應相比對照的增幅不大(圖2-A)。在孕穗期接種后，非親和反應在6 h和96 h有較高活性，親和反應在24 h和96 h的活性較高，但增長量小于非親和反應(圖2-B)。說明非親和反應中CAT活性的增強比親和反應更快，凈增加量更高；水稻孕穗期的CAT活性高于苗期。

2.1.3 SOD的活性

苗期接種后，兩個水稻品種的SOD活性均在6～12 h較高，此后親和反應的變化與對照相似，而非親和反應在48～120 h中高于對照(圖3-A)。孕穗期接種后，親和反應的SOD在72 h有最大活性，非親和反應在24 h活性最高，并從72 h開始呈上升趨勢(圖3-B)。說明非親和反應中的SOD活性上升速度更快，凈增加量也高于親和反應；水稻孕穗期的SOD凈增加量高于苗期。

2.2 苗期和穗期不同抗性水稻品種防衛(wèi)基因的表達2.2.1 PR1a的表達量

苗期接種后，非親和反應的PR1a在接種后6～12 h的表達量均為對照的1.5倍以上，而親和反應在病原菌侵染前期都處于低水平，120 h才約為對照1.7倍。孕穗期接種后，非親和反應與親和反應的PR1a均為下調(diào)表達(圖4)。說明苗期的非親和反應比親和反應中PR1a的表達量更高，表達時間更早；B. glumae的侵染對PR1a的誘導作用不大。

圖3 不同抗性水稻品種中超氧化物歧化酶(SOD)的活性Fig. 3. Activity of superoxide dismutase(SOD) in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

圖4 不同抗性水稻品種中PR1a相對表達量Fig. 4. Relative expression of PR1a in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

圖5 不同抗性水稻品種中PR10b相對表達量Fig. 5. Relative expression of PR10b in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

2.2.2 PR10b的表達量

苗期接種后，非親和反應的PR10b在6 h表達量約為對照的9倍，在24～48 h和96 h也有很高的表達；而親和反應在12 h和120 h約為對照1.8倍。孕穗期接種后，非親和反應的PR10b在6～96 h比苗期有更高的表達量；親和反應在6～72 h的表達也高于苗期(圖5)。以上結(jié)果說明，B. glumae的侵染能誘導水稻PR10b的大量表達，且孕穗期的表達量高于苗期；非親和反應比親和反應中PR10b的表達量更高且表達時間更早。

2.2.3 Rcht的表達量

苗期接種后，非親和反應中Rcht在6～12 h的表達量是對照的2.31～3.78倍，而親和反應在72～96 h才有高水平表達。孕穗期接種后，非親和反應中Rcht在6～24 h和72～120 h的表達均高于苗期，而親和反應僅在6 h和96 h有約為苗期2倍的表達量(圖6)。可見，B. glumae與水稻互作時能誘導Rcht的大量表達，其表達量與水稻品種和生長時期有關，非親和反應比親和反應的Rcht表達量更高且表達時間更早，水稻孕穗期的表達量高于苗期。

2.2.4 LOX的表達量

苗期接種后，非親和反應的LOX在接種24 h后有對照1.86倍的表達量；親和反應在接種后6 h的表達量為對照的1.53倍。兩個組合中的LOX在孕穗期的表達都顯著低于苗期（圖7）。說明B. glumae不能通過誘導LOX的表達來啟動水稻的JA信號傳導途徑。

2.2.5 PAL的表達量

苗期接種后，非親和反應的PAL的表達量與對照相似；但親和反應在24和72 h的表達量分別為對照1.63和1.58倍。孕穗期接種后，PAL的表達量顯著高于苗期。非親和反應中PAL的表達在0～96 h均顯著高于苗期；親和反應中PAL在0～24和96 h也有很高表達，但表達量小于非親和反應（圖8）?？梢?，孕穗期的PAL在兩個水稻品種中都有很高的表達，且非親和反應的表達量高于親和反應。可推斷PAL參與的SA信號傳導途徑在水稻孕穗期抵抗B. glumae的侵染中有重要作用。

圖6 不同抗性水稻品種中Rcht相對表達量Fig. 6. Relative expression of Rcht in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

3 討論

植物體內(nèi)的抗氧化性酶主要由SOD、CAT和POD等組成，SOD清除O2·－、POD和CAT都能分解H2O2，酶活較低時，植物大量積累O2·－，與H2O2發(fā)生Harber-Weiss反應，產(chǎn)生更具毒性的·OH，引起膜脂過氧化反應，從而使寄主表現(xiàn)病癥[18-19]。由于寄主與病原物的不同組合，植物的抗病機制會有所差異[20]。在稻瘟菌(Magnaporthe grisea)與水稻互作過程中，POD的活性與抗稻瘟病的能力正相關，但其他酶的作用說法不一。宋海超等[20]提出，早期的SOD和CAT活性與抗稻瘟病的能力呈負相關。而葛秀春等[21]的結(jié)果表明SOD和CAT活性與對照相似。楊民和等[22]對稻瘟菌(M. grisea)侵染的水稻組織中的CAT進行了定位觀察，發(fā)現(xiàn)CAT主要產(chǎn)生于細胞壁、細胞質(zhì)和囊泡膜上，并且非親和性互作中的累積量更高。植物在生長過程中，各種酶的活性都是動態(tài)變化的，并且不同生育期的水稻抗氧化酶活性也有差異[15]。本研究以未接種病原菌的水稻作為對照，排除了水稻自身氧化酶表達變化的影響。研究發(fā)現(xiàn)，POD、SOD和CAT在非親和反應中的凈增加量高于親和反應，并且水稻孕穗期的活性更高。各類酶在水稻苗期出現(xiàn)的最高值時間與水稻品種無關，但SOD和CAT在孕穗期的非親和反應中上升速度更快。因此，推測水稻孕穗期的抗病反應比苗期更強，抗病品種與感病品種的抗病性差異在孕穗期更為明顯。

圖7 不同抗性水稻品種中LOX相對表達量Fig. 7. Relative expression of LOX in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

圖8 不同抗性水稻品種中PAL相對表達量Fig. 8. Relative expression of PAL in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

本研究中，CAT的活性在接種病原菌后的增量并不高。Baker等[9]報道，細胞中H2O2水平很低時，CAT的清除能力也很低。因此對兩個時期接種后的水稻H2O2水平進行測試，發(fā)現(xiàn)兩個時期的H2O2含量均處于低水平，且孕穗期的H2O2含量比苗期高，非親和反應高于親和反應(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。推測CAT的低活性可能是因為水稻體內(nèi)H2O2的含量不夠高。

稻瘟病菌(M. grisea)侵染后，水稻的LOX和PAL都能高度表達，因此JA和SA信號傳導途徑能迅速啟動[13]，而細條病菌(Xanthomonas. oryzae pv. oryzicola)侵染后的水稻只能啟動JA信號途徑[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，JA途徑的關鍵酶脂氧合酶的基因表達量非常低，而SA途徑的關鍵酶苯丙氨酸解氨酶的基因表達量非常高，這個現(xiàn)象在孕穗期尤其明顯。因此，推測SA途徑是水稻抵御穎殼伯克氏菌(B. glumae)侵染的過程中的主要信號傳導途徑。但B. glumae侵染后的水稻是否能通過其他通路誘導啟動JA途徑還需要更多研究去證實。據(jù)報道，SA與具有CAT活性的蛋白(SABP)結(jié)合能抑制CAT活性，使其失去催化H2O2的能力[24]。這可能是本研究中CAT活性較低的另一個原因。

與其他寄主與病原菌互作過程相似，B. glumae侵染水稻后，PR基因能不同程度地被誘導表達來激活防御反應，非親和反應中的表達水平高于親和反應，并且表達時序也有差異。B. glumae能誘導PR10b和Rcht的顯著上調(diào)表達，但對PR1a的誘導作用不大。說明水稻與B. glumae互作的前期，不是所有抗病基因都能被誘導表達。但前期未表達的基因能否在后期被誘導，還需要進一步驗證。

在寄主與病原互作時，植物的生長與其抗病性的關聯(lián)性還不清楚[25]。Hugot等[26]報道，煙草被霜霉(Peronospora tabacina)侵染時，其抗性從營養(yǎng)期到生殖期表現(xiàn)出增加的趨勢。Kus[27]研究發(fā)現(xiàn)，成熟的擬南芥植株比幼苗對丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性更強，但是Chen等[28]的試驗沒有發(fā)現(xiàn)這個差異。本研究中，水稻孕穗期的抗病性比苗期更強，這個現(xiàn)象可能與植物不同生育期的抗病性有關，也可能與B. glumae的侵染方式有關。據(jù)報道，水稻孕穗期之前，若病原菌群體數(shù)量不大，B. glumae侵入稻株后可以潛伏在水稻體內(nèi)，對水稻不會造成較大傷害，但在孕穗期開始急劇增殖并對寄主造成毀滅性破壞[5]。說明病原菌的群體數(shù)量或者群體感應對寄主的抗病性有重要作用。因此，不同時期的水稻對穗枯病的抗性差異可能與B. glumae的侵染方式有關。水稻苗期抗穗枯病而穗期感病的機制揭示，對培育抗穗枯病的水稻材料具有科學借鑒意義。

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A Primary Study on the Mechanism Behind Resistance to Bacterial Panicle Blight of Rice

LI Lu1,2, XU Yihua1,2, LIANG Mengqi2, WANG Ling2, LIU Lianmeng2, HOU Yuxuan2, LI Qiqin1,*, HUANG Shiwen1,2,*

(1College of Agronomy, Guangxi University, Nanning 530003, China；2China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006，China；*Corresponding author, E-mail: qqli5806@gxu.edu.cn, huangshiwen@caas.cn）

【Objective】Rice is more susceptible to bacterial panicle blight at the booting stage than seedling stage. The objective of the study is to understand the resistant mechanism in different growing stage of rice and lay a basis for breeding rice varieties with high resistance.【Method】The spraying and injection method were used to inoculate seedlings and panicles of resistant and susceptible rice with Burkholderia glumae, respectively. The activities of three antioxidant enzymes (peroxidase, catalase and superoxide dismutase) of treatments and control were investigated. Real-time PCR was used to detect the expression of five defense response genes (PR1a, PR10b, Rcht, LOX and PAL).【Result】The infection of B. glumae induced the accumulation of reactive oxygen species, the increase of antioxidant enzymes activities and the higher expression of some defense genes. However, the defense response was different at the seedling stage and booting stage of rice. At the booting stage, the activities of antioxidant enzymes (peroxidase, catalase and superoxide dismutase) and the expression of PR10b, Rcht and PAL were higher, but the expression levels of PR1a and LOX were lower than those at the seedling stage.【Conclusion】B. glumae could induce more defense response of rice in booting stage, salicylic acid signaling pathway played an important role during the defense.

rice; bacterial panicle blight; antioxidant enzyme; defense gene; real-time fluorescence quantitative PCR

S435.111.4+5

A

1001-7216（2017）05-0551-08

2016-12-20；修改稿收到日期：2017-02-14。

國家重點研發(fā)計劃資助項目(2016YFD0200801)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程資助項目(CAAS-ASTIP-2013-CNRRI)；中央級公益性科研