呂佳慧，范文來(lái)，徐巖

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)

基于酶水解法釀酒高粱的結(jié)合態(tài)風(fēng)味研究

呂佳慧，范文來(lái)*，徐巖

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)

為探索白酒主要釀造原料高粱對(duì)酒品質(zhì)的影響，采用固相萃取吸附前體物質(zhì)和β-葡萄糖苷酶水解釋放風(fēng)味成分，應(yīng)用HS-SPME結(jié)合GC-MS技術(shù)定性、定量高粱的結(jié)合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)。在2種高粱中共檢測(cè)到38種結(jié)合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)(其中3種為臨時(shí)性鑒定)，包括6種醇類、6種醛類、9種酮類、3種芳香族、3種萜類、6種酯類、1種硫化物、1種呋喃類和3種酸類化合物。23種化合物首次在高粱的結(jié)合態(tài)風(fēng)味中檢測(cè)到。研究表明酶水解是一種釋放風(fēng)味物質(zhì)較為有效的方式。

高粱；β-葡萄糖苷酶；結(jié)合態(tài)風(fēng)味；酶解產(chǎn)物

結(jié)合態(tài)風(fēng)味(bound aromas)是本身無(wú)風(fēng)味的風(fēng)味前驅(qū)物在酸或酶的作用下釋放出來(lái)的揮發(fā)性風(fēng)味。來(lái)源于原料的風(fēng)味物質(zhì)主要以結(jié)合態(tài)的、不揮發(fā)性的風(fēng)味前驅(qū)物的形式存在和積累的[1]。在白酒生產(chǎn)過(guò)程中，原料中的風(fēng)味前驅(qū)物會(huì)分解、釋放出游離態(tài)風(fēng)味物質(zhì)，成為酒體的風(fēng)味成分。白酒釀造原料豐富多樣，主要是谷類和薯類，如高粱、玉米、甘薯等，而高粱是我國(guó)白酒生產(chǎn)使用最廣泛的原料[2]。醬香型、清香型及濃香型白酒大部分均使用高粱作為單一的原料，即使在多糧型的濃香型白酒生產(chǎn)中，高粱的使用量也占原料之首。

目前我國(guó)對(duì)白酒釀造原料的結(jié)合態(tài)風(fēng)味的研究較少。曾有報(bào)道基于酸水解法研究高粱、小麥、大麥等6種谷物原料的結(jié)合態(tài)風(fēng)味[3]，檢測(cè)到35種結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)，包括醇類、酯類、醛酮類、酸類等7類化合物；日本人研究發(fā)現(xiàn)在甘薯中存在結(jié)合態(tài)形式的里哪醇(linalol)、香葉醇(geraniol)、橙花醇(nerol)和松油醇(α-terpinol)，且單萜醇對(duì)甘薯燒酒的風(fēng)味有一定的感官貢獻(xiàn)[4]。雖曾有對(duì)高粱基于酸水解法的結(jié)合態(tài)風(fēng)味相關(guān)報(bào)道，但未見(jiàn)有對(duì)酶水解途徑的研究。

本研究以釀酒高粱為研究對(duì)象，采用固相萃取吸附前體物質(zhì)，β-葡萄糖苷酶水解釋放結(jié)合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)合HS-SPME-GC-MS技術(shù)研究高粱酶水解途徑的結(jié)合態(tài)風(fēng)味的組成，以期了解高粱結(jié)合態(tài)風(fēng)味對(duì)白酒品質(zhì)的影響。

1 材料和方法

1.1材料和儀器

原料：貴州紅纓子糯高粱(由貴州某酒廠提供)；山東菏澤雜交粳高粱(由山東某酒廠提供)。

NaCl、Na2HPO4、檸檬酸、無(wú)水CaCl2：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)；乙醇、甲醇、2-辛醇、表1中定性定量用到的標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純，Sigma-Aldrich公司；來(lái)源于杏仁的β-葡萄糖苷酶(凍干粉末，酶活力為6 U/mg)：Sigma-Aldrich公司；Milli-Q超純水(實(shí)驗(yàn)用水均為煮沸并冷卻至室溫的超純水)。

儀器：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 GC 6890N-MSD 5975，美國(guó)Agilent 公司；自動(dòng)進(jìn)樣器(MPS2)，德國(guó)Gerstel公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國(guó)Supelco公司；FFAP 毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國(guó)Supelco公司；LC-C18固相萃取柱(2 g，10 mL)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Supelco固相萃取裝置(VisiprepDLSPE)，美國(guó)Supelco公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高粱結(jié)合態(tài)風(fēng)味前體提取和分離

2 g高粱樣品用30 mL乙醇提取，37 ℃搖床過(guò)夜，轉(zhuǎn)速200 r/min，過(guò)濾；30 mL甲醇相同的條件再次提取[5]。合并提取液，35 ℃減壓蒸干，殘留相用30 mL Milli-Q超純水復(fù)溶，12 000 r/min離心30 min，取上清液。

C18反相極性柱按如下步驟純化[6]：10 mL色譜級(jí)甲醇活化柱子；10 mL超純水平衡柱子；30 mL高粱提取液上樣；90 mL超純水清洗去除游離態(tài)的糖和酸；5 mL色譜級(jí)甲醇洗脫并收集洗脫液；緩慢氮吹至干，-20 ℃保存待用。使用前，復(fù)溶到20 mL pH 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中。

1.2.2 高粱結(jié)合態(tài)風(fēng)味前體酶解

取10 mL前體物質(zhì)溶液加入0.04 g β-葡萄糖苷酶，溶液的酶活為24 U/mL，25 ℃反應(yīng)過(guò)夜[3]，反應(yīng)完后加入1%固體氯化鈣滅酶并離心。

1.2.3 酶解產(chǎn)物的定性定量分析

1.2.3.1 HS-SPME條件

取8 mL離心后的酶解液置于頂空瓶中，加入3 g NaCl和5 μL質(zhì)量濃度為81.90 mg/L的內(nèi)標(biāo)2-辛醇溶液，旋緊瓶蓋，HS-SPME-GC-MS分析。DVB/CAR/PDMS三相萃取頭，45 ℃預(yù)熱2.5 min，吸附45 min后直接進(jìn)樣，GC解析5 min[7]。

1.2.3.2 色譜條件

載氣He，流速2 mL/min，不分流進(jìn)樣；色譜柱：DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫升溫程序：初始溫度50 ℃，2 min后以4 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持15 min[7]。

1.2.3.3 質(zhì)譜條件

EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃，全掃描模式，掃描范圍為30.00～500.00 amu。

1.2.3.4 定性

化合物通過(guò)與NIST 05.L庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜及標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)(RI)比對(duì)定性；沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物，參考文獻(xiàn)RI定性，為臨時(shí)鑒定的化合物。

1.2.3.5 定量

將待測(cè)化合物溶液稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)樣品采用相同的處理方法進(jìn)行HS-SPME-GC-MS分析。用選擇離子法(SIM)計(jì)算目標(biāo)化合物的峰面積，以化合物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度之比為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。3-十三酮、2-十四酮、對(duì)甲硫基苯酚為臨時(shí)鑒定、半定量，化合物的質(zhì)量濃度是內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度、化合物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比的乘積。

2 結(jié)果與討論

2.1高粱結(jié)合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)定性分析

本研究在粳、糯高粱酶水解液中共鑒定出38種化合物(見(jiàn)圖1和表1)，包括6種醇類、6種醛類、9種酮類、3種芳香族、3種萜類、6種酯類、1種硫化物、1種呋喃類和3種酸類化合物。其中，23種化合物首次在高粱的結(jié)合態(tài)風(fēng)味中檢測(cè)到。庚酸乙酯僅在糯高粱的酶解液中檢測(cè)到，苯甲醇僅在粳高粱中檢測(cè)到。

圖1 高粱酶水解后揮發(fā)性化合物GC-MS總離子流圖(A，粳高粱；B，糯高粱)Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of sorghums’ volatiles after enzymatic hydrolysis (A,non-glutinous sorghum; B,glutinous sorghum)注：圖中峰號(hào)對(duì)應(yīng)的化合物見(jiàn)表1。

2.2高粱結(jié)合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)定量分析

從酶解產(chǎn)物定量結(jié)果看，粳、糯高粱結(jié)合態(tài)香氣含量分別為28.48、25.73 mg/kg(如表1)。醛酮類是高粱結(jié)合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)中最豐富的化合物，分別占粳、糯高粱總含量的32.29%和36.23%。從單個(gè)化合物來(lái)看，癸酸含量最高，粳、糯高粱中含量分別為3 538、3 559 μg/kg。

表1 高粱的結(jié)合態(tài)香氣化合物含量

注：a：無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品，為半定量結(jié)果；n.d.：表示沒(méi)有檢測(cè)到，

高粱結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)中共檢測(cè)到6種醇類，分別是己醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基己醇、辛醇、十二醇和異戊醇。其中，2-乙基己醇含量最高，粳、糯高粱中含量是1 150、1 156 μg/kg。十二醇首次在高粱的結(jié)合態(tài)風(fēng)味中檢測(cè)，粳、糯高粱中含量為1854、1865 μg/kg。C4～C9短鏈烷基β-葡萄糖苷屬于自然存在的糖苷，是一些揮發(fā)性成分和糖分子通過(guò)糖苷鍵連接而成，通常以β-O-葡萄糖苷形式存在[8]。酶解條件下烷基葡萄糖苷的釋放率可達(dá)到90%～100%[9]。

醛酮類化合物最豐富。在酶解液中檢測(cè)到6種醛類和9種酮類化合物。其中，己醛、庚醛、十二醛、2-辛酮、2-壬酮、2-癸酮、2-十一酮、2-十二酮、環(huán)己酮、6-甲基-5庚烯-2-酮、3-十三酮首次在高粱的結(jié)合態(tài)風(fēng)味中鑒定到。在醛類化合物中，癸醛含量最高，粳、糯高粱中含量1 573、1 580 μg/kg。在酮類化合物中，環(huán)己酮含量最高，粳、糯高粱中含量為2 630、2 680 μg/kg。檢測(cè)到的酮類化合物均存在于飲料酒中，呈水果香、花香和柑橘香等香氣[2]。醛酮類化合物可能是對(duì)應(yīng)的糖苷化合物水解產(chǎn)生醇類的氧化產(chǎn)物[9]。

萜類化合物是以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單位倍數(shù)的烴類及其含氧衍生物[2]，是飲料酒中的重要香氣物質(zhì)。在高粱水解液中檢測(cè)到D-樟腦、異佛爾酮和β-大馬酮，其中D-樟腦含量最高并首次在高粱結(jié)合態(tài)風(fēng)味中檢測(cè)到，粳、糯高粱中含量分別是756.7、760.7 μg/kg。β-大馬酮是清香型白酒的特征風(fēng)味成分，粳、糯高粱中含量分別是264.2、254.8 μg/kg。原料中的類胡蘿卜素在酶解和酸解環(huán)境下會(huì)降解產(chǎn)生異佛爾酮和β-大馬酮[10]。

檢測(cè)到的芳香族化合物包括苯乙酮、苯甲醛和苯甲醇，苯乙酮和苯甲醛首次在高粱結(jié)合態(tài)風(fēng)味中檢測(cè)到，苯甲醇只有在粳高粱檢測(cè)到，含量為2 773 μg/kg。苯甲醛、苯乙醛廣泛存在于酒類產(chǎn)品中[2]。在植物中，苯丙烷類糖苷是自然存在的糖苷，被認(rèn)為是風(fēng)味前體物質(zhì)，其中苯甲醇、β-苯乙醇被認(rèn)為是普遍存在的糖苷配基[8]，葡萄和葡萄酒中已經(jīng)檢測(cè)到苯甲基-β-D-葡萄糖苷、2-苯乙基-β-D-葡萄糖苷[11]。

此外，首次在高粱的結(jié)合態(tài)風(fēng)味物質(zhì)中檢測(cè)到1種硫化物對(duì)甲硫基苯酚，之前未有報(bào)道。檢測(cè)到3種酸類，包括壬酸、癸酸和辛酸，其中癸酸含量是所有檢測(cè)到的化合物中最高的。辛酸、壬酸和癸酸均有著不愉快的氣味、山羊臭、奶酪香和脂肪臭[2]。酯類化合物在粳、糯高粱的整體結(jié)合態(tài)香氣中占17.54%和18.99%，可能是酶解條件下的人工產(chǎn)物，有報(bào)道酸可能會(huì)與糖、醛、縮醛或半縮醛等化合物反應(yīng)生成酯類化合物[12]。

2.3高粱風(fēng)味前驅(qū)物的酶解產(chǎn)物與報(bào)道的酸解產(chǎn)物的比較

曾有研究人員基于酸水解法檢測(cè)到高粱的35種結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)，其中醇類4種、酯類3種、醛酮類10種、酸類6種、芳香族類4種、萜類6種、雜環(huán)類2種[3]。本研究采用酶法水解高粱，與酸水解比，酶解產(chǎn)物多了3種，尤其是檢測(cè)到更多醛酮類化合物，23種化合物(包括1個(gè)硫化物)首次在高粱的結(jié)合態(tài)風(fēng)味中檢測(cè)到。

結(jié)合態(tài)糖苷類前體的酶解產(chǎn)物與酸解產(chǎn)物種類上的差異可能跟糖苷類前體兩種途徑的斷鍵方式不同有關(guān)(如圖2)。糖苷類風(fēng)味前驅(qū)物是由糖苷配基(即各種揮發(fā)性成分)和糖分子通過(guò)糖苷鍵連接而成，多數(shù)情況下以β-糖苷鍵連接[13]。酶解反應(yīng)的斷鍵方式是糖苷鍵，而酸解反應(yīng)斷鍵方式是酯鍵。酸解反應(yīng)通過(guò)升高溫度而加速結(jié)合態(tài)風(fēng)味的釋放，斷鍵較為徹底，形成的揮發(fā)性物質(zhì)分子量較小，且糖配基的重排會(huì)生成不利的風(fēng)味物質(zhì)，無(wú)法較為真實(shí)地反應(yīng)糖苷類前驅(qū)物的結(jié)構(gòu)[14]。溫和的酶解過(guò)程能有效地產(chǎn)生糖苷配基并保持配基結(jié)構(gòu)不變[15]。在葡萄酒中，糖苷酶的使用是調(diào)整葡萄酒香氣并使某些特殊感官特征得到提升的一個(gè)重要手段，具有一定的商業(yè)化應(yīng)用前景，因而備受關(guān)注[16]。

圖2 結(jié)合態(tài)糖苷類前體酸解(左)和酶解(右)反應(yīng)的斷鍵方式[14]Fig.2 Modes of cleavage of glucosides by acid(left) and enzyme(right)hydrolysis[14]注：R表示氫原子或者其他的糖單元

在白酒生產(chǎn)過(guò)程中，酶對(duì)高粱風(fēng)味前驅(qū)物的水解作用可能存在于酒醅發(fā)酵過(guò)程中。日本曾有研究[4]發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶對(duì)甘薯燒酒的風(fēng)味形成有著重要的作用。在發(fā)酵過(guò)程中，熟甘薯的單萜醇糖苷被酒曲中的糖苷酶水解，產(chǎn)生重要風(fēng)味物質(zhì)。目前我國(guó)尚未對(duì)白酒大曲中的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行研究，而國(guó)外已將這一風(fēng)味修飾機(jī)制運(yùn)用到葡萄酒和果酒生產(chǎn)中。此外，有研究發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶水解生氰糖苷(如亞麻苦苷)有利于去除飲料酒中有害前體氰化物[4]，而氰氫酸是蒸餾酒中氨基甲酸乙酯形成的重要前體[17]。

3 結(jié)論

本研究采用固相萃取結(jié)合HS-SPME-GC-MS技術(shù)定量了38種高粱的結(jié)合態(tài)風(fēng)味化合物，其中23種首次在高粱的結(jié)合態(tài)風(fēng)味中檢測(cè)到。粳、糯高粱結(jié)合態(tài)香氣含量分別為28.48、25.73 mg/kg，醛酮類化合物含量最豐富。從單個(gè)化合物來(lái)看，癸酸含量最高，粳、糯高粱中含量為3 538、3 559 μg/kg。研究表明酶水解是一種釋放結(jié)合態(tài)風(fēng)味較為有效的方式。

[1] GAYON P,GLORIES Y,MAUJEAN A,et al．Handbook of Enology[M].The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments,2006.

[2] 范文來(lái),徐巖．酒類風(fēng)味化學(xué)[M]．北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社,2014.

[3] 朱偉岸,吳群,李記明,等．白酒釀造谷物類原料中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的分離及檢測(cè)分析[J]．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2015,34(5): 456-462.

[4] OHTA T,OMORI T,SHIMOJO H,et al．Identification of monoterpene alcohol beta-glucosidases in sweet-potatoes and purification of a shiro-koji beta-glucosidase[J]．Agricultural and Biological Chemistry,1991,55(7): 1 811-1 816.

[5] CAI Ji-bao,LIU Bai-zhan,LING Ping,et al．Analysis of free and bound volatiles by gas chromatography and gas chromatography-mass spectrometry[J]．Journal of Chromatography A,2002,947: 267-275.

[6] VILLENA M A,PEREZ J D,UBEDA J F,et al．A rapid method for quantifying aroma precursors: Application to grape extract,musts and wines made from several varieties[J]．Food Chemistry,2006,99(1): 183-190.

[7] KANG Wen-huai,XU Yan,QIN Ling,et al．Effects of different β-D-glycosidases on bound aroma compounds in muscat grape determined by HS-SPME and GC-MS[J]．Journal of the Institute of Brewing,2010,116(1): 70-77.

[8] JERKOVIC I,MASTELIC J．GC-MS Characterization of acetylated β-D-glucopyranosides transglucosylation of volatile alcohols using almond β-glucosidase[J]．Croatica Chemica Acta,2004,77(3):529-535

[9] HAMPEL D,ROBISON A L,JOHNSON A J,et al．Direct hydrolysis and analysis of glycosidically bound aroma compounds in grapes and wines: comparison of hydrolysis conditions and sample preparation methods[J]．Australian Journal of Grape and Wine Research,2014,20(3): 361-377.

[10] WANG Shu-lin,JIAO Ling-xiao,LI Ya-hui,et al．Degradation of β-carotene to volatile compounds in an aqueous model system to simulate the production of sea buckthorn wine[J]．International Journal of Food Properties,2012,15(6): 1 381-1 393.

[11] VOIRIN S C G,BAUMES R L,SAPIS J-C,et al．Analytical methods for monoterpene glycosides in grape and wine II．Qualitative and quantitative determination of monoterpene glycosides in grape[J]．Journal of Chromatography,1992,595(1-2):269.

[12] STAHLBISKUP E,INTERT F,HOLTHUIJZEN J,et al．Glycosidically Bound Volatiles: A Review[J]．Flavour and Fragrance Journal,1993,8: 61-80.

[13] 汪東風(fēng)．高級(jí)食品化學(xué)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社: 2009.

[14] PUGLISI C J．The role of acetylenic and allenic precursors in the formation of β-damascenone[D]．Flinders University,2007.

[15] WILLIAMS P J,SEFTON M A,FRANCIS I L．Glycosidic precursors of varietal grape and wine flavor[J]．ACS Symposium Series,1992,202(34):74-86.

[16] 王玉霞,張超．葡萄酒風(fēng)味提升酶的研究進(jìn)展[J]．釀酒科技,2013 (11): 4.

[17] 張順榮．白酒中氨基甲酸乙酯形成的氰化物途徑研究[D]．無(wú)錫：江南大學(xué),2016.

ResearchofboundaromasbasedonenzymehydrolysisofsorghumsforbrewingChineseliquor

LV Jia-hui,FANen-lai*,XU Yan

(Lab of Brewing Microbiology and Applied Enzymology,Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi,214122，China)

In order to explore the effect of sorghums on Chinese liquor’s quality,the SPE column was employed to adsorb bound precursors,and then,which were hydrolyzed by β-glucosidase to release aroma compounds.The HS-SPME coupled with GC-MS was used to identify and quantify the volatile hydrolysate.38 kinds of volatile aroma compounds were detected in two kinds of sorghums,including 6 kinds of alcohols,6 kinds of aldehydes,9 kinds of ketones,3 kinds of aromatic compounds,3 kinds of terpenoids,6 kinds of esters,1 kind of sulfide,1 kind of furan,and 3 kinds of acids.Among these,23 kinds of volatile compounds were first detected in the enzymatic hydrolysate of sorghums,and 3 kinds of volatiles were tentatively identified.The results suggested that enzymatic hydrolysis was an effective way to release bound aromas.

sorghum; β-glucosidase; bound aromas; enzymatic hydrolysate

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013867

碩士研究生(范文來(lái)研究員為通訊作者,E-mail:wenlai.fan@163.com)。

十三五國(guó)家重大專項(xiàng)(2016YFD0400500)

2017-01-17，改回日期：2017-02-19