陸競(jìng)爭(zhēng)，任順利，諸葛斌*，陸信曜，宗紅，方慧英，宋健

1(江南大學(xué)，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué)，化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)關(guān)鍵基因敲除對(duì)Klebsiellapneumoniae產(chǎn)1,3-丙二醇的影響

陸競(jìng)爭(zhēng)1,2，任順利1,2，諸葛斌1,2*，陸信曜1,2，宗紅1,2，方慧英1,2，宋健3

1(江南大學(xué)，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué)，化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)在以葡萄糖作輔底物發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PDO)過程中，由于細(xì)胞存在碳分解代謝抑制現(xiàn)象，葡萄糖優(yōu)先于甘油被菌體吸收代謝用于細(xì)胞生長(zhǎng)及副產(chǎn)物的累積，影響1,3-PDO的合成?；贙.pneumoniae葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及碳代謝調(diào)控相關(guān)的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system, PTS)，利用Red重組技術(shù)對(duì)PTS系統(tǒng)中與葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因ptsG(編碼葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)膜透性酶EⅡBCGlc)、crr(編碼胞漿可溶性葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)酶EⅡAGlc)分別進(jìn)行敲除，并考察上述基因缺失對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、1,3-PDO合成和副產(chǎn)物代謝的影響。結(jié)果顯示，敲除ptsG、crr基因后，甘油轉(zhuǎn)化率較野生菌分別提高26.2%和42.7%，其中突變株K.pneumoniaeΔcrr的1,3-PDO的產(chǎn)量達(dá)到23.1 g/L，提高35.8%。上述結(jié)果表明，敲除ptsG、crr基因改造PTS系統(tǒng)能夠有效提高底物甘油利用率，強(qiáng)化1,3-PDO合成。

crr；ptsG；磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；克雷伯氏菌；1,3-丙二醇

1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PDO)作為一種重要的化工原料，應(yīng)用于聚合物、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)，特別是作為新型聚酯類纖維聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯(polytrimethylene terephthalate，PTT)單體越來越受關(guān)注[1-2]。在已有的1,3-PDO合成菌株中，克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)因能高效生產(chǎn)1,3-PDO被廣泛研究[3]。但在以葡萄糖作輔底物發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-PDO過程中，K.pneumoniae優(yōu)先代謝葡萄糖用于菌體生長(zhǎng)，同時(shí)阻遏抑制甘油代謝，不利于1,3-PDO的合成[4]。

磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system，PTS)作為葡萄糖主要轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，由EⅠ(ptsH編碼)、HPr(ptsI編碼)、EⅡAGlc(crr編碼)，以及EⅡBCGlc(ptsG編碼)構(gòu)成[4]。如圖1，EI與磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)反應(yīng)獲得磷酸基團(tuán)，并將其加載到HPr上，繼而磷酸基團(tuán)傳遞至EⅡAGlc、EⅡBCGlc，接著EⅡBCGlc將周質(zhì)空間內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)并磷酸化，磷酸化葡萄糖進(jìn)而進(jìn)入分解代謝途徑。其中EⅡAGlc和EⅡBCGlc不僅參與葡萄糖的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)，還具有碳分解代謝抑制調(diào)控作用。

圖1 K. pneumoniae葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)Fig.1 Glucose-specific phosphotransferase system of K. pneumoniae

研究表明，敲除ptsG、crr基因有助于弱化葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)、碳分解代謝抑制作用，從而有效實(shí)現(xiàn)混合碳源共底物發(fā)酵[5-6]。但目前對(duì)于K.pneumoniaePTS系統(tǒng)的碳代謝調(diào)控與細(xì)胞生長(zhǎng)、1,3-PDO的合成及相關(guān)副產(chǎn)物代謝之間的關(guān)系尚未報(bào)道。基于此，本文通過敲除K.pneumoniae的ptsG、crr基因，分析PTS系統(tǒng)基因缺失對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、1,3-PDO合成的影響，對(duì)K.pneumoniae以葡萄糖作輔底物發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-PDO的研究具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

本研究用到的菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本文使用的菌株和質(zhì)粒

1.2培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5，胰蛋白胨 10，NaCl 10。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油 40，葡萄糖12，酵母粉 6，KH2PO47.5，MgSO42，(NH4)2SO42，F(xiàn)eSO40.005，VB120.015，微量元素溶液10 mL，KOH調(diào)pH至8.0。微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.07，MnCl2·4H2O 0.1，H3BO30.06，CoCl2·6H2O 0.2，CuCl20.02，NiCl2·6H2O 0.025，Na2MoO4·2H2O 0.035。種子培養(yǎng)：1%接種量(體積比)，37 ℃、150 r/min，培養(yǎng)8～10 h。發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL三角瓶50 mL裝液量，4%接種量(體積比)，37 ℃、150 r/min，培養(yǎng)48 h。所有培養(yǎng)基在1×105Pa滅菌15 min。

1.3主要試劑和儀器

氯霉素、硫酸卡那霉素、阿拉伯糖，生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶購自大連寶生物有限公司；液相色譜柱：Aminex HPX-87H column(300 mm×7.8 mm；9 μm)，BioRad公司；PCR儀、電轉(zhuǎn)儀，Eppendorf公司；引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成；1,3-PDO標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4引物設(shè)計(jì)

采用Primer軟件，根據(jù)NCBI已報(bào)道的K.pneumoniae中ptsG、crr基因序列(Gen Bank Accession No.NC_011283.1)設(shè)計(jì)引物見表2。

表2 基因敲除使用的引物

注：下劃線部分為敲除基因的同源臂序列。

1.5缺失菌株的構(gòu)建

基因敲除過程按照文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行[7]。將含氯霉素抗性的pKD46_Cm質(zhì)粒轉(zhuǎn)入K.pneumoniae，轉(zhuǎn)接至液體LB培養(yǎng)基(含氯霉素)，加入阿拉伯糖誘導(dǎo)后制備K.pneumonia敲除電轉(zhuǎn)感受態(tài)。以pKD13作模板進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得crr、ptsG基因敲除盒，回收并電轉(zhuǎn)至K.pneumoniae感受態(tài)，涂布于含有卡那霉素的LB平板篩選，PCR鑒定獲得陽性克隆。導(dǎo)入pCP20質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶消除上述引入的抗性標(biāo)記基因。

1.6測(cè)定方法

生物量用600 nm處光吸收值測(cè)定。以發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照，然后將發(fā)酵液于8 000 r/min離心5 min，并收集菌體，生理鹽水洗滌3次后，將收集的菌體置于105 ℃烘箱中干燥至恒重后稱重，根據(jù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算得出細(xì)胞干重公式：1 OD600= 0.36 g/L。樣品中葡萄糖含量用SBA-40C雙通道生物傳感分析儀進(jìn)行測(cè)定，具體測(cè)定方法參考儀器使用說明書。1,3-PDO及其他代謝產(chǎn)物產(chǎn)量用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定，檢測(cè)條件為：Amines HPX-87H (Bio-Rad) (300 mm × 7.8 mm，9 μm)液相色譜柱，使用示差折光及紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相：5 mmol/L KH2PO4，流速0.6 mL/min，柱溫60 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1PTS系統(tǒng)關(guān)鍵基因敲除

利用Red重組技術(shù)敲除K.pneumoniaePTS系統(tǒng)關(guān)鍵基因ptsG、crr。如圖2，野生菌ptsG、crr基因驗(yàn)證條帶大小分別為1 523和1 054 bp。而缺失菌中對(duì)應(yīng)驗(yàn)證條帶大小分別為762和645 bp，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符，說明基因敲除成功，得到突變株K.pneumoniaΔptsG、K.pneumoniaΔcrr。

M-DL2503 Marker；1-野生菌；2-ptsG敲除菌；3-野生菌；4-crr敲除菌圖2 ptsG基因(A)和crr基因(B)敲除的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR verifications of ptsG (A) and crr(B) gene knockout mutants

2.2突變株生長(zhǎng)性能分析

以6 g/L葡萄糖為底物，與野生菌相比，crr突變株生物量減半、1,3-PDO產(chǎn)量下降；而ptsG突變株則基本無法生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未列出)。為進(jìn)一步提高產(chǎn)物積累量，對(duì)糖濃度進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)添加12 g/L葡萄糖最利于K.pneumoniaΔcrr和K.pneumoniaΔptsG合成1,3-PDO。此時(shí)，K.pneumoniaΔcrr和K.pneumoniaΔptsG的生物量分別為野生菌的62.7%和23.6%(圖3)?？梢姼咛菨舛饶軌蚋纳萍?xì)胞生長(zhǎng)并部分回補(bǔ)基因缺失對(duì)生物量的影響。上述結(jié)果表明,crr和ptsG基因敲除弱化了PTS系統(tǒng)功能，限制了葡萄糖向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，使得細(xì)胞生物量顯著降低。已有研究發(fā)現(xiàn)，雖然敲除ptsG基因可以提高胞內(nèi)cAMP水平，促進(jìn)cAMP-CRP依賴的碳分解代謝過程的相關(guān)基因的表達(dá)，但ptsG編碼的EⅡBCGlc對(duì)GalP和ManXYZ等其他糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的合成具有正調(diào)控作用[8]。因此，敲除ptsG將嚴(yán)重影響糖轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)顯著下降。而crr基因編碼的EⅡAGlc的高表達(dá)則會(huì)抑制甘油轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝相關(guān)基因表達(dá)[9]。因此，crr基因敲除可以緩解甘油代謝的抑制作用，同時(shí)還可提高胞內(nèi)cAMP水平、激活cAMP-CRP依賴型碳分解代謝過程相關(guān)基因的表達(dá)[10]，從而使得K.pneumoniaΔcrr具有較高的生物量。另一方面，較高的糖濃度可能激活了GalP和MglBAC等其他葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，使得基因缺失對(duì)生物量的影響在12 g/L糖質(zhì)量濃度下出現(xiàn)一定的回補(bǔ)[11]。

圖3 K. pneumoniae及突變株發(fā)酵甘油產(chǎn)1,3-PDO的生物量Fig.3 The biomass of K. pneumoniae and mutants (K. pneumoniae ΔptsG, K. pneumoniae Δcrr) in glycerol fermentation for 1,3-propanediol production

2.3突變株代謝分析

如圖4A，發(fā)酵前4 h野生菌葡萄糖基本耗完，菌體快速生長(zhǎng)。而ptsG、crr突變株由于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受損，糖耗速率明顯下降。其中，crr突變株的葡萄糖16 h基本耗完；而ptsG突變株由于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力嚴(yán)重受損，至發(fā)酵結(jié)束僅消耗一半葡萄糖，使得菌體生物量較其他菌株減少。上述結(jié)果表明，敲除ptsG、crr基因弱化了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，限制了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗。

基因敲除弱化了菌株生長(zhǎng)，使得突變株的甘油消耗速率在發(fā)酵前期均低于野生菌(圖4-B)。其中，K.pneumoniaΔptsG耗甘油量減少34.2%；而crr缺失菌在前期甘油代謝能力稍弱，但耗甘油總量與野生菌相似，表明crr敲除有利于甘油代謝。此外，由于PTS系統(tǒng)關(guān)鍵基因敲除弱化了糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，細(xì)胞可能通過強(qiáng)化甘油歧化途徑進(jìn)行代償，從而使得兩株缺失菌的單位菌體耗甘油量分別提高76%和31.6%，進(jìn)一步表明ptsG、crr敲除使得細(xì)胞甘油代謝能力提高。此外，由于生長(zhǎng)嚴(yán)重受限，突變株K.pneumoniaΔptsG1,3-PDO產(chǎn)量降低32.7%。相比之下，突變株K.pneumoniaΔcrr1,3-PDO產(chǎn)量達(dá)到23.1 g/L，提高35.8%，表明crr敲除有利于產(chǎn)物積累。此外，2株缺失菌的單位菌體產(chǎn)量均提高約80%。另一方面，ptsG和crr突變株的甘油轉(zhuǎn)化率分別提高26.2%和42.7%，表明ptsG、crr敲除使得胞內(nèi)甘油碳流向1,3-PDO合成途徑偏轉(zhuǎn)。

2,3-丁二醇(2,3-Butanediol，BDO)作為主要的副產(chǎn)物之一，在1,3-PDO發(fā)酵生產(chǎn)過程中用于維持胞內(nèi)氧化還原勢(shì)平衡，防止培養(yǎng)基酸化[12]。發(fā)酵前期，葡萄糖代謝旺盛，產(chǎn)生大量的丙酮酸、還原力，促進(jìn)BDO的累積。crr、ptsG基因敲除之后，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，致使菌體糖耗受限，影響葡萄糖代謝，BDO積累較野生菌下降。其中，crr敲除菌BDO產(chǎn)量減少25.7%，ptsG敲除菌BDO基本檢測(cè)不到(圖4-C)，表明crr、ptsG基因敲除可以有效減少BDO累積，致使更多碳流轉(zhuǎn)向1,3-PDO的合成[13]。在發(fā)酵后期，由于BudC催化BDO發(fā)生可逆反應(yīng)，BDO濃度下降，碳源重新進(jìn)入糖酵解途徑，并產(chǎn)生還原力[14]，進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)發(fā)酵后期1,3-PDO的積累。

如圖4-D，由于ptsG、crr基因敲除影響PTS系統(tǒng)的碳源轉(zhuǎn)運(yùn)能力，部分碳源由非PTS系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，通過ATP磷酸化激活進(jìn)入代謝途徑，加大了細(xì)胞對(duì)能量的需求[15-16]，中間代謝物可能經(jīng)乙酸合成途徑生成乙酸產(chǎn)生ATP以補(bǔ)償細(xì)胞能量需求，導(dǎo)致單位菌體乙酸產(chǎn)量有所提高。但由于生物量下降，乙酸終產(chǎn)量分別減少39.7%、18.2%，表明敲除ptsG、crr基因弱化乙酸積累。

圖4 K. pneumoniae及突變株發(fā)酵甘油產(chǎn)1,3-PDO發(fā)酵過程中(A)剩余葡萄糖、(B)1,3-丙二醇、剩余甘油、(C)2,3-丁二醇、(D)乙酸Fig.4 (A) Residual glucose,(B) 1,3-PDO, residual glycerol, (C) 2,3-BDO, (D) Acetatein fermentation of K. pneumoniaeand mutants that produced 1,3-propanediol from glycerol

3 結(jié)論

本研究對(duì)K.pneumoniaePTS系統(tǒng)中與葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的ptsG、crr基因分別進(jìn)行敲除，并考察了細(xì)胞生長(zhǎng)、1,3-PDO的合成及副產(chǎn)物代謝的變化。結(jié)果表明，基因敲除能夠改善底物代謝能力，提高甘油轉(zhuǎn)化率。其中，crr基因敲除對(duì)生物量影響相對(duì)較弱，1,3-PDO產(chǎn)量提高35.8%，甘油轉(zhuǎn)化率提高42.7%，同時(shí)減少了BDO、乙酸等副產(chǎn)物積累。綜上可知，敲除PTS系統(tǒng)中與葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因可以有效改善底物代謝能力，減少副產(chǎn)物積累，促進(jìn)1,3-PDO的合成，為后續(xù)進(jìn)一步改造提高甘油發(fā)酵合成1,3-PDO提供思路和借鑒。

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Theeffectsofknockingoutkeygenesinphosphotransferasesystemon1,3-propanediolproductionofKlebsiellapneumoniae

LU Jing-zheng1,2, REN Shun-li1,2,ZHUGEBin1,2*,LU Xin-yao1,2,ZONG Hong1,2,FANG Hui-ying1,2,SONG Jian3

1(The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, School of Biotechnology,Research Centre of Industrial Microbiology, Wuxi 214122, China) 3(School of Chemistry and Material, Jiangnan University,Wuxi 214122, China)

During production of 1,3-propanediol from glycerol byKlebsiellapneumoniaewith glucose as co-substrate, glucose has the priority of being used for accumulated biomass and byproducts due to the carbon catabolism repression (CCR), which results in an obstacle on 1,3-propanediol production. Based on the phosphotransferase system (PTS) involved in glucose specific transferance and corresponding carbon metabolic regulation,ptsGgene encoding EⅡBCGlcandcrrgene encoding EⅡAGlcwere respectively knocked out by Red disruption system in this study. The effects ofptsG,crr-deficient PTS on cell growth, 1,3-propanediol production, and byproducts accumulation were examined. It was observed that after knocking outptsGandcrrgenes, the yields of glycerol increased by 26.2%, 42.7% compared with the parent strains, respectively. A yield of 23.1 g/L 1,3-propanediol byK.pneumoniaeΔcrrwas achieved with increase of 35.8%. The results above demonstrated that modification of PTS by disruption ofptsGandcrrgenes could improve the yield of glycerol and enhance the 1,3-propanediol production.

crr;ptsG; phosphotransferase system (PTS);Klebsiellapneumoniae; 1,3-propanediol

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013991

碩士研究生(諸葛斌教授為通訊作者,E-mail:bzhuge@163.com)。

2017-02-06，改回日期：2017-03-14