呂 蕾

趙陽陽2,3

劉仁杰3

金永東2

郭志軍1

(1. 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2. 中國科學院長春應用化學研究所，吉林 長春 130022；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118)

基于納米金與適配體的赭曲霉毒素A檢測方法研究

呂 蕾1

趙陽陽2,3

劉仁杰3

金永東2

郭志軍1

(1. 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2. 中國科學院長春應用化學研究所，吉林 長春 130022；3. 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118)

以赭曲霉毒素A適配體作為識別分子熒光素發(fā)射的熒光作為檢測信號、納米金作為熒光信號淬滅劑，建立一種高靈敏度的赭曲霉毒素A熒光檢測方法。結(jié)果表明：該檢測體系檢測限達到10 nmol/L，在25～1 000 nmol/L濃度范圍具有線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.991，具有較好的實用性。該熒光檢測法同傳統(tǒng)方法相比，提高了檢測效率，為更好地進行赭曲霉毒素A檢測控制提供了技術(shù)支持。

納米金；適配體；赭曲霉毒素A；生物傳感器

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是赭曲霉屬和青霉屬真菌產(chǎn)生的一種真菌毒素[1-2]。研究表明，OTA不僅具有肝臟和腎臟毒性[3]，而且具有致癌[4]、致畸[5]、致突變[6]和免疫抑制作用[7]。聯(lián)合國癌癥研究組織也將其列為CLASS 2B類致癌物質(zhì)[4]。OTA廣泛存在于農(nóng)作物、食品原料及食品中，嚴重威脅人類健康[8-10]。目前，中國OTA檢測主要以傳統(tǒng)儀器法為主，包括色譜法[10-11]、質(zhì)譜法[12]、氣相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[14]、高效液相色譜-熒光[15]等。這些傳統(tǒng)的檢測方法往往比較繁瑣，檢測周期長，且需要專業(yè)的操作人員等，在一定程度上限制了它們在OTA檢測中的實際應用。因此，建立靈敏、高效、簡便的OTA檢測控制方法，對保障食品安全及人類健康具有重要意義。

適配體是一類在體外篩選的，能與目標物專一結(jié)合的單鏈寡聚核苷酸序列[16-18]，在一定條件下能與靶物質(zhì)高效地、特異性地識別結(jié)合。因此，在分析檢測領(lǐng)域中具有良好的應用前景。與其他特異性識別元件特別是抗體相比，適配體具有獨特的優(yōu)勢，例如：易獲得，合成快速，成本低；親和力高，特異性強；靶分子范圍廣；易修飾；性質(zhì)穩(wěn)定；分子量小，重復性強等[19]。由于適配體本質(zhì)上只是一段寡核苷酸片段，并不具有信號轉(zhuǎn)換的功能，將其用于檢測各種靶物質(zhì)時，與靶物質(zhì)特異性的識別過程本身并不能產(chǎn)生可檢測的信號。因此，需要經(jīng)過合理設(shè)計和篩選后修飾，將核酸適配體對目標物的識別，轉(zhuǎn)換成為易于檢測的物理化學信號。

納米材料因其具有獨特的光、電、磁及化學性質(zhì)，并且具有小尺寸效應、量子效應、表面效應。特別是納米材料表面富含各種官能團且生物相容性好，能保持生物分子活性，使其在構(gòu)建高靈敏、高通量、高穩(wěn)定的生物傳感器方面表現(xiàn)出巨大潛力。近年來，納米材料被越來越廣泛地用于構(gòu)建靈敏、高效的化學和生物分析工具[20-22]。納米金(AuNPs)因其易于合成以及其獨特的性能，在催化[23]、傳感[24]、電子[25]等領(lǐng)域得到廣泛研究和應用。AuNPs可作為能量受體，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應有效淬滅熒光。因此利用AuNPs進行熒光淬滅被應用于各種傳感器的構(gòu)建[26-27]，但在OTA檢測中以AuNPs作為淬滅劑鮮有報道。本研究擬利用熒光素(FAM)修飾OTA適配體，通過AuNPs對FAM的淬滅作用，將適配體對OTA的識別過程轉(zhuǎn)換為熒光信號進行研究，旨在為OTA檢測提供簡便、高效的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3’端修飾羧基熒光素的OTA適配體(5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAGCAT CGG ACA-FAM-3’)：上海生工生物工程股份有限公司；

赭曲霉毒素A、檸檬酸鈉、氯金酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)：分析純，美國Sigma公司；

鹽酸、氯化鈣、氯化鉀：分析純，北京化工廠；

葡萄酒：煙臺張裕集團有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光光譜儀：Fluoromax-4型，美國Horiba公司；

紫外可見分光光度計：UV-2600型，日本島津公司；

透射電子顯微鏡：Hitachi 600型，日立公司；

電子天平：AL204型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納米金的制備 利用經(jīng)典的檸檬酸鈉還原氯金酸法制備AuNPs[28-29]。在攪拌、沸騰條件下，向50 mL濃度為1 mmol/L的氯金酸溶液中迅速注入5 mL濃度為1%的檸檬酸鈉溶液，持續(xù)煮沸，攪拌15 min，溶液最終呈酒紅色。移除熱源，攪拌冷卻至室溫，10 000 r/min離心20 min，棄上清液，將沉淀重懸于超純水中，4 ℃保存。

1.3.2 納米金的表征 將離心重懸好的AuNPs超聲3 min，用UV-vis在350～800 nm處測其吸光度值，根據(jù)其最大吸收峰位置可以表征AuNPs的粒徑，并計算濃度。同時利用HRTEM對其粒徑、均一性以及單分散性進行表征。

1.3.3 OTA檢測原理 經(jīng)FAM標記的適配體在激發(fā)波長為492 nm的條件下，F(xiàn)AM會發(fā)射熒光，具體原理見圖1。當體系中不存在OTA時，F(xiàn)AM染料標記的適配體單鏈吸附到AuNPs表面，AuNPs與熒光染料分子之間產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應，使得適配體上標記的FAM熒光信號淬滅；反之當體系中存在OTA時，熒光標記的適配體與赭曲霉毒素A識別結(jié)合并形成折疊結(jié)構(gòu)，該折疊結(jié)構(gòu)能抵抗AuNPs的吸附，AuNPs與FAM染料分子之間不能產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應，使得熒光信號得以保留。因此，可以通過檢測到的熒光信號強弱與體系中的OTA濃度的關(guān)系，實現(xiàn)OTA的定量檢測。

1.3.4 納米金濃度優(yōu)化 AuNPs濃度是影響檢測效果的重要因素，因此需要對其濃度進行優(yōu)化。AuNPs濃度過低將導致游離的適配體標記的FAM染料分子熒光信號未被完全淬滅，使得背景過強影響檢測效果。具體過程：取18支1.5 mL離心管，分別加入400 μL，pH 8.0 的10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(含20 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl)，隨后分別加入200 μL，200 nmol/L 適配體溶液，室溫放置30 min，最后分別加入200 μL濃度為 0，2，4，6，8，10 nmol/L的AuNPs溶液(每個濃度做3個平行試驗)，室溫放置1.5 h后進行熒光測定，所有過程均在避光條件下進行。

圖1 基于AuNPs淬滅FAM-適配體選擇性檢測OTA的原理圖

1.3.5 OTA定量檢測 利用AuNPs對FAM標記的適配體熒光信號進行淬滅，通過檢測其發(fā)射熒光信號的強弱可以實現(xiàn)對OTA的定量檢測。由AuNPs與適配體濃度優(yōu)化可知，最佳AuNPs濃度為2 nmol/L。因此在隨后試驗中，AuNPs濃度均為2 nmol/L。在本試驗中，取27支1.5 mL離心管，每3支為一組平行樣，共9組。分別向9組中加入400 μL 濃度為0，20，50，100，200，400，1 000，2 000，10 000 nmol/L的OTA溶液(均用上述pH 8.0的Tris-HCl配制)，隨后分別向每管中加入200 μL，200 nmol/L適配體溶液，室溫靜置30 min，再分別向每管中加入2 nmol/L的AuNPs溶液200 μL，室溫放置1.5 h，操作在避光條件下進行。最后進行熒光測試，熒光光譜儀條件為：激發(fā)波長492 nm，發(fā)射波長范圍500～630 nm，入射狹縫10 nm，出射狹縫10 nm，根據(jù)520 nm處的熒光信號強度檢測OTA。

1.3.6 特異性檢測 用熒光素標記的適配體檢測OTA時，OTA的一些類似物如OTB、OTC等也可能會對結(jié)果產(chǎn)生影響。為驗證該方法的特異性，設(shè)計如下試驗：取24支1.5 mL 離心管，每3個一組，共8組，分別標號1～8號，首先向1號離心管中加入400 μL 上述緩沖液，2～8號離心管中分別加入400 μL均由上述緩沖溶液配置的1 000 nmol/L的AFB1、OTB、OTC、NAP、Warfarin、ZEN、OTA，隨后每支離心管中都加入200 nmol/L 適配體溶液200 μL。室溫靜置30 min，再向每支離心管加入2 nmol/L AuNPs溶液200 μL，靜置1.5 h，所有操作均需在避光條件下進行。最后進行熒光測試，測試條件同1.3.5。

1.3.7 實際樣品檢測 為了驗證該方法的實用性，以紅酒為對象進行檢測體系的實用性考查。具體步驟：將1%的紅酒加入到緩沖體系，用含1%紅酒的緩沖體系將OTA標準溶液稀釋成濃度為0，50，100，200，400，1 000，2 000 nmol/L的樣品溶液，然后取21支1.5 mL離心管，每3個一組，共7組，標號為1～7。分別將上述不同標準濃度OTA的溶液分別取400 μL加入1～7號離心管中，然后加入200 nmol/L 適配體溶液200 μL，室溫放置30 min，再向每支離心管加入2 nmol/L AuNPs溶液200 μL，靜置1.5 h，所有操作均需在避光條件下進行。隨后進行熒光測試，測試條件同1.3.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米金的表征

采用檸檬酸鈉還原氯金酸方法制備的AuNPs呈酒紅色。利用UV-vis和HRTEM對其進行表征，結(jié)果見圖2。在350～800 nm波長范圍用UV-vis方法對其濃度進行表征，其最大吸收值在520 nm處[見圖2(a)]。此方法合成的AuNPs粒子直徑為13 nm左右，且其消光系數(shù)為2.7×108L/(mol·cm)[30]，根據(jù)消光系數(shù)計算其原始濃度為11 nmol/L。通過透射電鏡表征，結(jié)果顯示該方法制備的AuNPs粒徑均一，分散性好 [見圖2(b)]。經(jīng)過統(tǒng)計，其粒徑集中分布在(13.5±3.0) nm，滿足該試驗的需要[見圖2(c)]。

圖2 AuNPs的表征

2.2 納米金濃度的優(yōu)化

AuNPs與FAM標記的適配體濃度比例在很大程度上影響到所構(gòu)建檢測體系的靈敏度，因此二者適當?shù)臐舛缺确浅Ｖ匾Ｓ蓤D3可知，在適配體濃度為200 nmol/L的緩沖溶液中，熒光強度隨AuNPs濃度的增加逐漸降低，當加入的AuNPs濃度到達2 nmol/L時，F(xiàn)AM修飾的適配體的熒光強度降低80%，之后AuNPs濃度對適配體熒光的淬滅效果沒有顯著影響，且過高的AuNPs濃度會降低傳感器的靈敏度，因此選用2 nmol/L作為在后續(xù)試驗中AuNPs的濃度。

圖3 AuNPs濃度對熒光強度的影響

2.3 定量檢測OTA

在0～10 000 nmol/L范圍內(nèi)取不同濃度的OTA做相關(guān)性研究，利用FAM標記的OTA適配體在520 nm處有最強熒光發(fā)射峰，對其進行測試，結(jié)果見圖4。以濃度對數(shù)為橫坐標，以520 nm處相對熒光強度(F-F0)/F0為縱坐標繪制曲線見圖5(a)。由圖5(b)可知，其線性范圍是25～1 000 nmol/L，線性方程為：(F-F0)/F0=0.391 56 lgCOTA-0.505 35，相關(guān)系數(shù)為0.991。其檢測限為能夠?qū)瞻谉晒庑盘柈a(chǎn)生影響的最低OTA濃度(10 nmol/L)。

從下往上OTA濃度依次為0，20，50，100，200，400，1 000，2 000，10 000 nmol/L

圖4 不同濃度OTA的熒光光譜

Figure 4 Fluorescence spectra obtained with different concentration of OTA

F. 在520 nm處含有OTA的各個樣品的熒光強度F0. 空白在520 nm處的熒光強度

圖5 OTA濃度變化與相對熒光強度的關(guān)系

Figure 5 Dependence of the variation of (F-F0)/F0on the concentration of OTA

2.4 方法特異性考查

由圖6可知，當加入1 000 nmol/L 的OTA時，其相對熒光強度增加非常明顯，但是當用1 000 nmol/L的其他類似物代替OTA時，其相對熒光強度沒有出現(xiàn)明顯的增加。說明構(gòu)建的適配體-AuNPs傳感器對OTA的檢測具有高度的特異性。

圖6 方法特異性考查

2.5 方法實用性考查

由圖7可知，相對熒光強度隨OTA濃度增加而增強，以520 nm處相對熒光強度為縱坐標，OTA濃度對數(shù)為橫坐標繪制的校正曲線。該曲線具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.993，說明該傳感器適用于實際樣品檢測。

3 結(jié)論

該研究利用標記有熒光素的核酸適配體與淬滅劑AuNPs構(gòu)建了一種通過熒光信號變化進行OTA檢測的方法。該方法具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好等特點，在實際樣品檢測中表現(xiàn)出了較高的靈敏度，說明其在食品安全檢測中具有較強的實用性。該試驗建立的方法為真菌毒素檢測提供了一種新的思路，同時也可為構(gòu)建簡便、快捷的適用于食品其他有害因子的檢測方法提供參考。

F. 加入不同濃度的OTA標準后，各個樣品在520 nm處的熒光強度

F0. 未加入OTA標準溶液在520 nm處的熒光強度

圖7 在1%紅酒樣品中OTA檢測效果

Figure 7 Application of aptasensor for OTA determination in red wine samples

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Study on detection method for ochratoxin A based on gold nanoparticle and aptamer

LULei1

ZHAOYang-yang2，3

LIURen-jie3

JINYong-dong2

GUOZhi-jun1

(1.AgriculturalCollege,YanbianUniversity,YanJi,Jilin133002,China; 2.ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun,Jilin130022,China; 3.CollegeofLifeScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

A high sensitivity fluorescence detection method for ochratoxin A (OTA) based on OTA aptamers and gold nanoparticle (AuNPs) was established, which employed OTA aptamers as recognition element and AuNPs to quench the fluorescence emission from fluorescein. The results indicated that the detection limit is 10 nmol/L and a linear relationship between the fluorescent intensity ratio and the logarithm of OTA concentration was plotted in the range of 25～1 000 nmol/L (R2=0.991). The detection method showed high feasibility and reliability. Compared with traditional method, this method greatly improved the detection efficiency and provided technical support for more effective identification of OTA.

gold nanoparticle; aptamer; ochratoxin A; biosensor

吉林省科技廳青年科研基金項目(編號：20160520047 JH)；吉林省教育廳科學技術(shù)研究項目(編號：吉教科合字[2016]第252號)；國家自然科學基金項目(編號：31360384, 31460423)

呂蕾，女，延邊大學農(nóng)學院實驗師，博士。

金永東(1971—)，男，中國科學院長春應用化學研究所研究員，博士。E-mail：ydjin@ciac.jl.cn 郭志軍(1980—)，男，延邊大學農(nóng)學院副教授，博士。 E-mail：guozhijunvip@163.com

2017—05—07

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.012