劉 偉， 單立平， 劉倩倩， 劉 志△

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，遼寧 沈陽 110001； 2中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，遼寧 沈陽 110004)

聯(lián)合氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案對膿毒性休克大鼠腎臟的保護(hù)作用*

劉 偉1， 單立平2， 劉倩倩1， 劉 志1△

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，遼寧 沈陽 110001；2中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，遼寧 沈陽 110004)

目的： 評價聯(lián)合2%氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的膿毒性休克大鼠腎臟的治療效果。方法：60只Wistar大鼠隨機分成4組(每組15只)：正常對照(control)組，膿毒性休克(shock)組，膿毒性休克+液體復(fù)蘇組(fluid組)，膿毒性休克+2%氫氣吸入聯(lián)合液體復(fù)蘇組(fluid+H2組)。大鼠麻醉后予呼吸機輔助通氣，fluid+H2組給予2%氫氣空氣混合氣，其余3組給予單純空氣吸入。10 mg/kg LPS靜脈注射，建立膿毒性休克模型，control組給予等量生理鹽水靜脈注射。Fluid組和fluid+H2組給予相同液體復(fù)蘇方案，維持平均動脈壓于正常水平。4 h后，大鼠經(jīng)腹主動脈放血處死，留取血液及腎臟標(biāo)本。結(jié)果：聯(lián)合2%氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案與單純液體復(fù)蘇比較，血肌酐、尿素氮、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白及腎臟組織TNF-α、IL-6水平明顯降低，氧化應(yīng)激損傷程度明顯減輕。結(jié)論：聯(lián)合2%氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案更能減輕膿毒癥所致急性腎損傷。

膿毒性休克； 急性腎損傷； 液體復(fù)蘇； 氫氣

近年來盡管對膿毒性休克的認(rèn)識和治療進(jìn)展方面取得了很大成就，但膿毒性休克依然具有很高的發(fā)病率和病死率[1]。液體復(fù)蘇是改善膿毒性休克有效循環(huán)血容量不足和降低多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)發(fā)生率的重要手段。大量臨床試驗已經(jīng)證實早期液體復(fù)蘇能明顯改善膿毒性休克患者的預(yù)后[2-3]。然而液體復(fù)蘇本身是一把雙刃劍，在改善有效容量的基礎(chǔ)上，也存在液體過負(fù)荷所導(dǎo)致的間質(zhì)水腫及其隨后可能發(fā)生的器官功能損傷的風(fēng)險[4]。因此，如何有效實施液體復(fù)蘇成為影響膿毒性休克患者預(yù)后的重要因素。

膿毒癥危重癥患者急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的發(fā)病率近65%[5]，膿毒性休克患者若并發(fā)AKI將使死亡率明顯增加[6]。因此保護(hù)膿毒性休克患者腎臟功能顯得尤為重要。然而目前液體復(fù)蘇仍然是臨床上預(yù)防和治療膿毒性休克過程中出現(xiàn)AKI的必要手段，此過程中必將存在由于液體過負(fù)荷導(dǎo)致腎臟功能惡化的風(fēng)險，因此尋求更優(yōu)化的液體復(fù)蘇方案顯得尤為迫切。

氫分子作為一種選擇性的抗氧化劑，在多種疾病的動物模型中均表現(xiàn)出很好的治療效果[7]。氫分子的作用機制主要包括選擇性抗氧化、抑制凋亡和過度的炎癥反應(yīng)。我們以前研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合2%氫氣(hydrogen,H2)吸入的液體復(fù)蘇方案可明顯減輕膿毒性休克所致的急性肺損傷[8]，因此本實驗將再次利用膿毒性休克大鼠模型，探究聯(lián)合2%氫氣吸入的早期液體復(fù)蘇方案對膿毒性休克所致AKI的治療效果及相關(guān)機制。

材料和方法

1材料

1.1動物 60只健康雄性Wistar大鼠(180～200 g)均由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，并在清潔級動物房飼養(yǎng)繁殖。

1.2主要儀器 HX300動物呼吸機、HP便攜式心電監(jiān)護(hù)儀和OMNI血氣分析儀(AVL)；光學(xué)顯微鏡及電鏡(Olympus)。

1.3主要試劑 脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)購自Sigma；丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superroxide dismutase，SOD)及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)ELISA 試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；2%氫氣、21%空氣和77%氮氣混合氣體由中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)用氣體站提供。

2方法

2.1動物分組及模型制作 實驗動物隨機分成4組，每組15只，正常對照組(control組)、膿毒性休克對照組(shock組)、液體復(fù)蘇組(fluid組) 和液體復(fù)蘇+2%氫氣吸入組(fluid+H2組)。10%水合氯醛(300 mg/kg)經(jīng)腹腔注射對大鼠進(jìn)行麻醉，氣管切開接呼吸機輔助通氣，呼吸頻率100次/分，潮氣量10 mL/kg，fluid+H2組大鼠吸入氣體為2%氫氣空氣混合氣，其余3組吸入氣體均為空氣。左頸動脈穿刺，連接監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測心率及平均動脈壓( mean arterial pressure，MAP)；股靜脈穿刺留置導(dǎo)管，以備給藥及補液，電熱器維持體溫。大鼠狀態(tài)穩(wěn)定 30 min 后， 除control組外，其余3組均靜脈注射LPS 10 mg/kg(配制濃度10 g/L，推注時間不少于2 min，推注完畢再推入0.2 mL生理鹽水將注射器內(nèi)殘存的LPS完全注入)，建立膿毒性休克大鼠模型。control組靜脈注入等量生理鹽水。液體復(fù)蘇方案: 每15 min給予生理鹽水10 mL/kg，30 min后根據(jù)MAP水平，應(yīng)用去甲腎上腺素(0.5～6 μg·kg-1·min-1) 維持MAP于正常水平[9]。記錄各組大鼠的生命體征、補液量及去甲腎上腺素的用量。所有大鼠于模型建立成功4 h后經(jīng)頸動脈放血處死，留取動脈血1 mL行血氣分析，剩余血液3 000×g離心10 min，留取血清行肌酐(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)及NGAL檢測。切除左腎，經(jīng)PBS充分清洗后，以腎門為中心，向外放射狀均勻切成4塊，1塊以4%多聚甲醛固定，留作光鏡檢測，1塊以2.5%戊二醛固定留作電鏡檢測，剩余-80 ℃保存待檢測氧化還原指標(biāo)及炎性介質(zhì)水平。

2.2腎功能檢測 血清Cr及BUN水平用于評估大鼠腎臟功能，應(yīng)用COBAS Mira化學(xué)檢測儀(Roche)檢測，具體步驟參照所購試劑盒說明書。

2.3NGAL的檢測 應(yīng)用ELISA試劑盒檢測血清NGAL濃度，參照說明書進(jìn)行操作。

2.4腎臟組織病理學(xué)觀察 腎臟組織以4%多聚甲醛浸泡24 h以上，常規(guī)脫水、包埋，切成4 μm切片，用蘇木素伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腎臟組織病理改變。另一個腎標(biāo)本用2.5%戊二醛固定，脫水，嵌入環(huán)氧樹脂，并制成超薄切片，用透射電鏡觀察細(xì)胞器的變化。

2.5腎臟組織中MDA、MPO、SOD 活力的測定 取腎臟組織勻漿，12 000×g離心20 min， 取上清液采用分光光度法測定MDA、MPO、SOD活性，檢測步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

2.6腎臟組織中炎性介質(zhì)檢測 將凍存的腎臟組織在冰上解凍、勻漿，4℃離心(3 000×g、15 min)，ELISA法檢測勻漿上清中TNF-α、IL-6和IL-10水平(檢測步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作)。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1MAP、血氧分壓(PO2)、補液量及去甲腎上腺素的用量

本實驗中MAP在靜脈注射LPS后20 min降至正常的80%，fluid組和fluid+H2組在整個實驗過程中MAP值無明顯差異。fluid+H2組液體量和去甲腎上腺素用量明顯少于fluid組。PO2在shock組明顯降低，兩種液體復(fù)蘇方案均使PO2升高，但fluid+H2組升高的更為明顯(P<0.05)，見表1。

表1 各組MAP、PO2、補液量及去甲腎上腺素用量的比較

*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsshock;#P<0.05vsfluid.

2血清Cr、BUN及NGAL水平

Shock組與control組比較，血清Cr、BUN及NGAL水平明顯升高，兩種液體復(fù)蘇方案明顯降低了血清Cr、BUN及NGAL水平，但fluid+H2組降低的更為明顯(P<0.05)。雖然液體復(fù)蘇降低了Cr和BUN水平，但BUN/Cr比值(control、shock、fluid及fluid+H2組BUN/Cr比值分別為0.18±0.05、0.19±0.06、0.17±0.04及0.17±0.05)在4組中的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1。

Figure 1. The levels of serum Cr (A)， BUN (B) and NGAL (C) in different groups. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsshock;#P<0.05vsfluid.

圖1各組血清Cr水平、BUN水平和NGAL表達(dá)水平的比較

3腎臟組織病理學(xué)觀察

Control組光鏡下見正常腎小球及腎小管形態(tài)；shock組腎小管上皮細(xì)胞明顯水腫、刷狀緣破壞，間質(zhì)水腫伴出血及炎性細(xì)胞侵潤；fluid組和fluid+H2組光鏡下腎小管上皮細(xì)胞損傷明顯減輕，尤其是fluid+H2組損傷最輕。電鏡下可見腎小球濾過膜由腎小球基底膜、偽足和內(nèi)皮細(xì)胞組成：control組腎小球基底膜連續(xù)、厚度均勻，偽足排列整齊，內(nèi)皮細(xì)胞清晰；shock組腎小球基底膜蜷曲、厚度不均，大部分偽足和內(nèi)皮細(xì)胞融合，提示腎小球濾過膜損傷嚴(yán)重；fluid組和fluid+H2組腎小球濾過膜損傷明顯改善，尤其fluid+H2組改善更明顯,見圖2。

4腎臟組織MDA、MPO和SOD水平的變化

Shock組與control組比較，MDA和MPO水平明顯升高且伴隨有SOD明顯下降，液體復(fù)蘇后MDA和MPO表達(dá)明顯下降并伴隨SOD升高，但此變化趨勢在fluid+H2組更為明顯，見圖3。

5腎臟組織炎癥介質(zhì)的表達(dá)

ELISA檢測結(jié)果顯示shock組腎臟組織的TNF-α和IL-6表達(dá)與control組比較明顯升高，液體復(fù)蘇后TNF-α和IL-6表達(dá)明顯下降，fluid+H2組與fluid組比較下降得更為明顯(P<0.05)；IL-10的表達(dá)在shock組、fluid組和fluid+H2組均明顯升高，但3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；IL-6/ IL-10比值在fluid組和fluid+H2組明顯下降，尤其在fluid+H2組下降更為明顯(P<0.05)，見圖4。

討 論

本實驗結(jié)果提示聯(lián)合2%氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案與單純液體復(fù)蘇比較，顯著降低維持正常MAP所需的液體及去甲腎上腺素用量。正如我們所知，過量的液體有導(dǎo)致器官水腫致靶器官功能惡化的風(fēng)險，因此，聯(lián)合氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案更大的優(yōu)化了膿毒性休克液體復(fù)蘇的治療效果，而減輕了其可能導(dǎo)致的弊端(液體過量)。

Figure 2. The images of kidney tissues with HE staining (A, ×200) and transmission electron microscopic analysis of glomerular filtration membrane (B, ×5 000) in different groups.

圖2腎臟組織的HE染色和電鏡下的超微結(jié)構(gòu)觀察

Figure 3. The changes of MPO (A), MDA (B) and SOD (C) in the renal tissues of different groups. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsshock；#P<0.05vsfluid.

圖3各組腎臟組織MPO、MDA和SOD水平的變化

本實驗結(jié)果提示膿毒性休克誘導(dǎo)了明顯的腎臟功能損傷，雖然2種液體復(fù)蘇方案均明顯降低了血Cr和BUN水平，但是BUN/Cr比值在4組中無明顯變化。眾所周知，BUN/Cr比值通常被用來區(qū)分腎前性或腎性氮質(zhì)血癥，在膿毒性休克時腎臟血流量明顯下降，導(dǎo)致腎前性腎臟損傷。與此同時，LPS和缺血又可以誘導(dǎo)腎臟局部過量促炎介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致腎實質(zhì)性損傷。正如我們的實驗結(jié)果所示，膿毒性休克組不但出現(xiàn)了血流動力學(xué)改變，腎臟病理及超微結(jié)構(gòu)亦出現(xiàn)了明顯的改變，這就解釋了為何BUN/Cr比值在4組中無明顯變化，即膿毒性休克致AKI既有腎前性因素又有腎性因素參與。

NGAL屬于脂蛋白超級家族一員，生理情況下在上皮細(xì)胞中微量表達(dá)，而在腎小管損傷中，其可以出現(xiàn)明顯表達(dá)升高，是AKI早期的生物標(biāo)記物[10]。本實驗中膿毒性休克組，NGAL明顯升高，提示出現(xiàn)了明顯的腎小管上皮細(xì)胞損傷，兩種液體復(fù)蘇方案均降低了NGAL的表達(dá)水平，但聯(lián)合氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案組NGAL降低的更明顯，提示對腎小管更具保護(hù)作用。電鏡結(jié)果提示膿毒性休克組腎小球濾過膜超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的損傷，雖然兩組液體復(fù)蘇方案均改善了腎小球濾過膜的損傷，但聯(lián)合氫氣吸入組改善程度更為顯著。因此聯(lián)合氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案與單純液體復(fù)蘇比較，更進(jìn)一步減輕了腎小管上皮細(xì)胞及腎小球濾過膜的損傷程度，更能減輕AKI。

在膿毒癥時，LPS激活中性粒細(xì)胞、巨噬/單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等，釋放大量炎性介質(zhì)及活性氧族，從多方面對膿毒性休克患者的預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響[3]。同時腎小球入球小動脈收縮使腎血流減慢進(jìn)一步繼發(fā)中性粒細(xì)胞黏附和聚集。當(dāng)?shù)脱獕撼掷m(xù)存在時，腎小球入球小動脈進(jìn)一步收縮，導(dǎo)致腎臟缺氧和腎血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子高表達(dá)，這些更加促進(jìn)中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。活化的中性粒細(xì)胞釋放大量促炎介質(zhì)和氧自由基，進(jìn)一步加重腎臟缺氧和損傷[11]。因此改善氧合和降低氧化應(yīng)激損傷對保護(hù)膿毒性休克所致AKI至關(guān)重要。本實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案與單純液體復(fù)蘇比較，不僅明顯提高了血氧分壓的水平，還使MPO、MDA表達(dá)明顯下降，SOD表達(dá)明顯升高，提示聯(lián)合氫氣吸入的液體復(fù)蘇方案不僅顯著改善的機體氧合，還明顯降低了氧化應(yīng)激損傷，對AKI具有顯著的改善作用。

Figure 4. The levels of TNF-α (A), IL-6 (B), IL-10 (C) and ratio of IL-6/IL-10 (D) in the renal tissues of different groups. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsshock;#P<0.05vsfluid.

圖4腎臟組織TNF-α、IL-6、IL-10和IL-6/IL-10比值的變化

雖然膿毒性休克所致AKI具體機制仍不十分清楚，但過度炎癥反應(yīng)在此過程中扮演重要角色[12]。研究表明AKI時，TNF-α在腎小管上皮細(xì)胞過度表達(dá)伴隨大量炎性細(xì)胞侵潤并加重腎損傷，而應(yīng)用TNF-α受體拮抗劑可以明顯改善腎損傷程度[13]。IL-6在AKI時亦明顯高表達(dá)，并且會同時加重腎臟和肺臟的損傷[14]。抑制TNF-α和IL-6的過度表達(dá)可顯著減輕AKI。IL-10是重要的抗炎介質(zhì)，能抑制促炎介質(zhì)如TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-8的表達(dá)，并且代表了機體代償性抗炎反應(yīng)(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)的能力。嚙齒類動物模型顯示，應(yīng)用外源性IL-10對AKI具有明顯治療效果[15]。本實驗中，膿毒性休克組TNF-α和IL-6表達(dá)明顯升高，提示過度炎癥反應(yīng)參與AKI的發(fā)病過程，兩種液體復(fù)蘇方案均明顯降低了TNF-α和IL-6的表達(dá)，但在聯(lián)合氫氣的液體復(fù)蘇組降低的更為明顯。CARS在膿毒癥中通常被描述為遲發(fā)的炎癥反應(yīng)，但在本實驗中IL-10的表達(dá)與TNF-α和IL-6幾乎同步，即在實驗終點時間均明顯升高，且在膿毒性休克組和兩種液體復(fù)蘇組表達(dá)無明顯差異。但是IL-6/IL-10比值在液體復(fù)蘇后明顯降低，尤其在聯(lián)合氫氣的液體復(fù)蘇組。有研究報道IL-6/IL-10比值升高與膿毒癥預(yù)后不良具有明顯相關(guān)性[16]。因此本實驗結(jié)果提示聯(lián)合氫氣的液體復(fù)蘇方案與單純液體復(fù)蘇比較，不但進(jìn)一步降低了促炎介質(zhì)的表達(dá)，還更好的維持了促炎/抗炎的平衡，更能減輕AKI。

膿毒性休克過程中，微循環(huán)或毛細(xì)血管功能障礙直接影響液體復(fù)蘇的效果。毛細(xì)血管透過度增加可引起滲漏致組織間隙的液體增加，導(dǎo)致器官水腫和有效循環(huán)血容量的不足，最終進(jìn)一步加重器官缺血、缺氧和持續(xù)的低血壓。早期液體復(fù)蘇是治療膿毒性休克的重要手段，但是如果治療不當(dāng)，復(fù)蘇所用液體會導(dǎo)致器官水腫加重和器官功能衰竭。氫分子因為具有抗氧化、抑制凋亡和過度炎癥反應(yīng)的作用，在液體復(fù)蘇過程中可能通過改善毛細(xì)血管的功能，減少了滲漏致組織間隙的液體量，因而更加優(yōu)化了液體復(fù)蘇積極的治療效果，而減少了液體過量所致的弊端，對膿毒性休克所致AKI具有更好的治療效果。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Liquid resuscitation combined with hydrogen inhalation reduce acute kidney injury during septic shock in rats

LIU Wei1, SHAN Li-ping2, LIU Qian-qian1, LIU Zhi1

(1Department of Emergency, First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China;2Department of Urologic Surgery, Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, China. E-mail: lzsy2014@163.com)

AIM: To investigate the therapeutic effects of a novel fluid resuscitation protocol (early fluid resuscitation plus 2% hydrogen inhalation) on acute kidney injury during septic shock induced by lipopolysaccharide (LPS) in rats.METHODS: Male Wistar rats were randomly divided into 4 groups (15 rats per group): control group, septic shock group, septic shock with early fluid resuscitation group (fluid group) and septic shock with early fluid resuscitation plus 2% hydrogen inhalation group (fluid+H2group). The rats were ventilated, and a 2% hydrogen mixture was used in fluid+H2group. LPS (10 mg/kg) was administered to establish the septic shock model in rats and fluid resuscitation was performed in fluid group and fluid+H2group.RESULTS: Fluid resuscitation with 2% hydrogen inhalation decreased the le-vels of serum creatinine, blood urea nitrogen and neutrophil gelatinase-associated lipocalin. It also reduced oxidative stress injury and decreased renal tumor necrosis factor-α and interleukin-6 levels compared with fluid resuscitation alone.CONCLUSION: Early fluid resuscitation plus 2% hydrogen inhalation provided more protection against acute kidney injury du-ring septic shock.

Septic shock; Acute kidney injury; Fluid resuscitation; Hydrogen

1000- 4718(2017)09- 1703- 06

2016- 07- 27 [

] 2017- 03- 11

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81571882)

R515.3;R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.027

△通訊作者 Tel: 024-83283055; E-mail: lzsy2014@163.com