曹學(xué)鋒， 白振忠， 馬 蘭， 馬 爽， 格日力

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

慢性高原病患者血清GC-TOF-MS代謝組學(xué)的初步研究*

曹學(xué)鋒， 白振忠， 馬 蘭， 馬 爽， 格日力△

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

目的： 研究慢性高原病患者氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)代謝組學(xué)的變化，并鑒定血清代謝圖譜的內(nèi)源性代謝物，探討青海玉樹(shù)世居藏族居民潛在的差異性代謝標(biāo)志物。方法: 收集10例青海玉樹(shù)世居藏族慢性高原病患者(CMS組)和10例世居高原健康藏族居民(control組)血清，利用GC-TOF-MS代謝組學(xué)和多元回歸分析方法，如主成分分析法(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)模式識(shí)別分析各代謝物的變化。結(jié)果: PCA、PLS-DA和OPLS-DA模式判別分析結(jié)果顯示，兩組血清代謝組均表現(xiàn)出明顯聚類型分布。CMS組血清中延胡索酸、肌苷、植烷酸、2,2-二甲基丁二酸、β-酮己二酸、異亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、L-半胱氨酸、瓜氨酸、三甲基賴氨酸、1-磷酸葡萄糖和核糖水平顯著高于control組；CMS組血清中下降的代謝物有硫酸、草酸、谷氨酰胺和來(lái)蘇糖。結(jié)論: 慢性高原病患者和高原健康藏族居民血清代謝物水平有顯著性差異，這些血清代謝物的改變可能參與了慢性高原病的發(fā)生與發(fā)展。

慢性高原??； 氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜； 代謝組學(xué)

青藏高原 、內(nèi)蒙古高原 、黃土高原和云貴高原上有大約6 000～8 000萬(wàn)人口居住在海拔2 500 m以上的高原地區(qū)。在北美、墨西哥、美國(guó)西部高原地區(qū)世居人口相對(duì)較少，但高海拔地區(qū)進(jìn)入人口在逐年增加，估計(jì)其居民罹患慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)的概率將增加5%～10%[1]。慢性高原病是長(zhǎng)期生活在海拔2 500 m以上高原的世居者或移居者,對(duì)高原低氧環(huán)境逐漸失習(xí)服而導(dǎo)致的臨床綜合征,主要表現(xiàn)為紅細(xì)胞增多(女性 Hb ≥190 g/L, 男性Hb ≥210 g/L)，當(dāng)患者移居到低海拔地區(qū)后，其臨床癥狀逐漸消失，如果再返回高海拔地區(qū)則病情復(fù)發(fā)[2-4]。

慢性高原病的發(fā)生伴隨著患者機(jī)體的病理生理變化，使得機(jī)體的代謝物也隨之發(fā)生相應(yīng)變化。系統(tǒng)生物學(xué)的出現(xiàn)為研究高原習(xí)服失敗相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制提供了新的思路，基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等組學(xué)相關(guān)分析方法為系統(tǒng)生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具。代謝組學(xué)的研究?jī)?nèi)容是生物體對(duì)病理生理刺激或基因修飾產(chǎn)生的代謝物質(zhì)的質(zhì)和量的動(dòng)態(tài)變化。作為全新的研究手段己被廣泛應(yīng)用于生理、病理、藥物毒性研究等方面。代謝組學(xué)研究最主要兩個(gè)技術(shù)平臺(tái)是磁共振技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)[5]。

目前對(duì)慢性高原病發(fā)病機(jī)制的研究表明，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程并不是一個(gè)臟器的問(wèn)題，而是全身各系統(tǒng)相互作用的結(jié)果，如高原紅細(xì)胞增多癥、高原心臟病、高原高血壓等都屬于慢性高原病范疇[4]。本課題的研究目的為運(yùn)用代謝組學(xué)方法研究慢性高原病代謝組學(xué)改變，以期為慢性高原病的發(fā)病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1研究對(duì)象和血樣采集

本課題研究對(duì)象為青海省玉樹(shù)州清水河地區(qū)(4 300 m)世居藏族人群，分為世居藏族CMS組(男8例，女2例)，同海拔地區(qū)世居藏族健康居民(男3例，女7例)設(shè)為對(duì)照(control)組。慢性高原病的診斷依2004年發(fā)布的國(guó)際慢性高原病標(biāo)準(zhǔn)[2]“青海標(biāo)準(zhǔn)”，即女性Hb≥190 g/L， 男性Hb≥210 g/L，且排除有心肺疾患的病人。Control組女性Hb≤150 g/L， 男性Hb≤160 g/L。本課題研究對(duì)象簽訂知情同意書(shū)并獲得青海大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

研究對(duì)象在安靜狀態(tài)下檢測(cè)血氧飽和度并采集7～10 mL靜脈血，將血樣4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液到凍存管，于液氮中保存，汽車運(yùn)送至西寧進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2主要試劑和儀器

L-2-氯苯丙氨酸購(gòu)自上海恒柏生物科技有限公司；衍生化試劑BSTFA(含1% TMCS)購(gòu)自 REGIS Technologies；甲醇、乙腈、正庚烷均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氧銨鹽、吡啶購(gòu)自Sigma；GC色譜儀(Agilent)；質(zhì)譜儀(LECO)；明澈純水儀(Millpore)。

3主要方法

3.1代謝物萃取 取100 μL血清樣本，加入0.4 mL甲醇，再加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸，漩渦混勻；緊接著將樣本4 ℃、12 000 r/min離心15 min；小心地取出0.39 mL上清于2 mL進(jìn)樣瓶(甲烷硅基化)中。每個(gè)樣本各取13 μL混合成質(zhì)量控制(quality control，QC)樣本。

3.2代謝物衍生化 在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入50 μL甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶；20 g/L)，輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵育20 min；向每個(gè)樣品中迅速加入70 μL BSTFA(含有1% TCMS)，將混合物70 ℃孵育1 h；冷卻至室溫，向混樣的樣本中加入10 μL FAMEs(飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)混合液)混勻，上機(jī)檢測(cè)。

3.3質(zhì)譜檢測(cè) 運(yùn)用配有Agilent DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)的Agilent 7890氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。GC-TOF-MS具體分析條件如下：進(jìn)樣量為1 μL，不分流模式；載氣為氦氣；前進(jìn)樣口吹掃流速：3 mL/min；柱流速 1 mL/min；柱溫 50 ℃保持1 min，以20 ℃/min的速率上升至320 ℃，保持5 min；前進(jìn)樣口溫度為280 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；離子源溫度為220 ℃；電離電壓為-70 eV；掃描方式 85～600 m/z；掃描速率 20 spectra/s；溶劑延遲為4.93 min。摸索樣本GC-TOF-MS檢測(cè)最優(yōu)代謝物萃取及檢測(cè)方法。

3.4系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測(cè) 運(yùn)用GC-TOF-MS 代謝組學(xué)研究，穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)方法才能獲得可靠地實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究由不同樣本取等量混合后得到QC樣本，并多次連續(xù)進(jìn)QC樣本，使儀器達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；其次，所有樣本以內(nèi)標(biāo)(L-2氯苯丙氨酸)的保留時(shí)間(R.T.)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差為0.002521，說(shuō)明系統(tǒng)十分穩(wěn)定，這是質(zhì)量控制之一；還有，通過(guò)飽和脂肪酸甲酯建立方程計(jì)算得到每個(gè)峰的保留時(shí)間指數(shù)，只有跟數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)品的保留時(shí)間指數(shù)相差在5 000以內(nèi)，才能定性有效，以確保數(shù)據(jù)穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

3.5差異代謝物篩選及鑒別 通過(guò)OPLS-DA分析過(guò)濾不相關(guān)的正交信號(hào)，獲得差異性代謝物。本項(xiàng)目采用 OPLS-DA 模型第一主成分的VIP(variable importance in the projection)值(閾值為1)，并結(jié)合t檢驗(yàn)的P值(閾值為0.05)來(lái)尋找差異性表達(dá)代謝物。既以閾值VIP>1和P<0.05作為CMS組和control組代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)，即閾值VIP>1和P<0.05化合物是具有顯著性差異的化合物。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Chroma TOF 4.3X軟件和LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫(kù)被用于原始峰值篩檢、基線數(shù)據(jù)過(guò)濾以及基線校準(zhǔn)、峰對(duì)齊、反卷積分析、峰鑒別、峰面積計(jì)算。 保留時(shí)間指數(shù)(retention index，RI)方法用于峰值鑒別。用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)差異比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1CMS組與control組人口學(xué)特征和血常規(guī)結(jié)果

兩組年齡、身高、體重、收縮壓、舒張壓、血氧飽和度的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白濃度、慢性高原病評(píng)分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見(jiàn)表1。這說(shuō)明本研究所選擇研究對(duì)象符合實(shí)驗(yàn)要求。

表1研究對(duì)象人口學(xué)特征和血常規(guī)檢測(cè)數(shù)據(jù)表

Table 1. Demographic characteristics and blood routine of human subjects (mean±SD.n=10)

IndexCMSControlPvalueAge(year)36.7±16.4338±10.700.8363Height(cm)165.6±7.49159±7.390.0628Weight(kg)69.9±8.1962.5±9.940.0859Systolicpressure(mmHg)124.5±18.03114.6±13.080.1769Diastolicpressure(mmHg)87.3±9.1381.1±9.840.1614RBC(×1012/L)6.97±0.815.06±0.270.0000Hematocrit(%)72.3±6.4249.2±2.400.0000Hemoglobin(g/L)217.3±14.72145.9±9.500.0000Oxygensaturation(%)82.6±6.9986.5±3.200.1261CMSscore7.1±2.191.94±1.340.0000

RBC: red blood cell; CMS score: chronic mountain sickness score.

2模式識(shí)別判別分析

主成分分析法(principal component analysis，PCA)模式識(shí)別方法對(duì)世居藏族CMS組和同海拔世居藏族control組的血清代謝組進(jìn)行模式判別分析，結(jié)果顯示CMS組與control組主成分積分值基本集中分布于橢圓形散點(diǎn)置信區(qū)內(nèi)的區(qū)域，表明CMS患者與control組之間存在血清主成分代謝物的差異。兩組偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)顯示呈聚類型分布于橢圓形散點(diǎn)置信區(qū)內(nèi)的2個(gè)區(qū)域，表明CMS患者與control組之間存在代謝物的顯著差異，結(jié)果顯示PLS-DA和OPLS-DA模式識(shí)別效果優(yōu)于PCA，見(jiàn)圖1。

3差異代謝物結(jié)果

CMS組延胡索酸、肌苷、植烷酸、2,2-二甲基丁二酸、β-酮己二酸、1-磷酸葡萄糖、核糖、異亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、L-半胱氨酸、瓜氨酸和三甲基賴氨酸表達(dá)水平明顯高于control組，而硫酸、草酸、谷氨酰胺和來(lái)蘇糖表達(dá)水平明顯低于control組(VIP>1，P<0.05)，見(jiàn)表2。

4ROC曲線分析結(jié)果

異亮氨酸、延胡索酸、1-磷酸葡萄糖、瓜氨酸、肌苷和甘氨酸的ROC曲線下面積(area under roc curve，AUC)值分別為0.8958、0.89、0.84、0.8、0.7125和0.7042，見(jiàn)圖2。AUC值在0.9和0.7之間，代表這一生物標(biāo)志物有比較高的診斷準(zhǔn)確性。異亮氨酸、延胡索酸、1-磷酸葡萄糖和瓜氨酸可能是慢性高原病血清生物標(biāo)志物。

討 論

我國(guó)有大量人口生活在高海拔缺氧地區(qū)，長(zhǎng)期缺氧對(duì)機(jī)體產(chǎn)生非常不利的影響，CMS是嚴(yán)重影響高原居民和移居人群健康的疾病。2004年在中國(guó)青海西寧舉行的國(guó)際高原醫(yī)學(xué)第六屆世界大會(huì)定義CMS發(fā)生于海拔超過(guò)2 500 m土著人群或居民，其特點(diǎn)是紅細(xì)胞增多和高血紅蛋白濃度(男性Hb≥210 g/L，女性Hb≥190 g/L)，嚴(yán)重的低氧血癥(低SaO2)，嚴(yán)重的肺動(dòng)脈高壓,其可能發(fā)展為肺心病，導(dǎo)致充血性心力衰竭[4]。居住在秘魯?shù)牡V業(yè)城市塞羅迪帕斯科鎮(zhèn)，海拔4 300 m的CMS的發(fā)病率估計(jì)為15.6%[6]。在青海高原CMS患病率隨海拔升高而增高，海拔 2 267 m～2 980 m 為1.05%，3 128 m～3 968 m 為 3.75%，4 006 m～5 226 m 為 5.83%。CMS患病率漢族男性為7.77%，女性為 1.76%[7]; 藏族男性為 1.78%，女性為0.56%，男性患病率約為女性的 4 倍[7]；這些報(bào)道說(shuō)明種族、性別不同在遺傳、代謝等方面對(duì)高原低氧、高寒、強(qiáng)紫外線環(huán)境適應(yīng)可能存在差異。

Figure 1. PCA, PLS-DA and OPLS-DA analysis of GC-TOF-MS metabolite profiles. A: the PCA score plot showed that the CMS samples and control subjects were scattered into 2 different regions. The X-axis, t[1], and Y-axis, t[2], indicating the first and second principal components, respectively; B: the PLS-DA score plot showed that the CMS samples and control subjects were scattered into 2 different regions. The X-axis, t[1], and Y-axis, t[2], indicating the first and second principal components, respectively (R2Y=0.954 ,Q2=0.46); C: the OPLS-DA score plot showed that the CMS samples and control subjects were scattered into 2 different regions. The X-axis, t[1], and Y-axis, t[2], indicating the first and second principal components, respectively (R2Y=0.954,Q2=0.357); D: the OPLS-DA loading plot was constructed to display the relationship between the X-variables and the Y-variables for the first predictive component and the first Y-orthogonal component. The horizontal axis represented the X-loadings p and the Y-loadings q of the predictive component. The vertical axis represented the X-loadings p(o) and the Y-loadings s(o) for the Y-orthogonal component. X-variables situated in the vicinity of the dummy Y-variables had the highest discriminatory power between the classes.

圖1氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用PCA、PLS-DA和OPLS-DA的代謝物判別分析圖

由于靈敏度、分辨率、峰值和重現(xiàn)性等方面的優(yōu)越性，GC-TOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于代謝物鑒定和量化。本研究模型解釋率及預(yù)測(cè)率都比較高， PLS-DA得分圖R2Y=0.954 ,Q2=0.46，提示該模型穩(wěn)定可靠。PLS-DA和OPLS-DA得分圖可以看出，兩組樣本之間無(wú)交叉重疊，說(shuō)明兩組血清樣本之間存在比較明顯的差異。

在高原低氧環(huán)境中，人體的正常代謝將可能做一些調(diào)整以適應(yīng)環(huán)境變化和保持相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，這對(duì)人體抵抗外界高原環(huán)境變化具有重要意義。本研究表明, CMS組與對(duì)照組比較，乳酸水平?jīng)]有顯著性差異，可能是CMS的發(fā)病機(jī)制與乳酸代謝沒(méi)有明顯相關(guān)性。相反，1-磷酸葡萄糖和延胡索酸在CMS組中含量顯著增加，表明CMS患者機(jī)體的能量代謝，在低壓低氧環(huán)境條件下并不是如有文獻(xiàn)報(bào)道的從有氧氧化轉(zhuǎn)化為了無(wú)氧酵解。然而世居高原健康藏族居民，盡管血乳酸水平升高，無(wú)氧酵解增強(qiáng)，但其血紅蛋白濃度正常，沒(méi)有出現(xiàn)慢性高原病，其機(jī)制還有待闡明。一般而言,當(dāng)機(jī)體能量需求不能滿足時(shí)，通過(guò)有氧氧化減弱而無(wú)氧酵解增強(qiáng)，從而導(dǎo)致乳酸水平升高[9]。無(wú)氧酵解可以大大提高三磷酸腺苷的產(chǎn)生速度,以確保機(jī)體低氧環(huán)境中的能量需求供應(yīng)[10]。

在這項(xiàng)研究中，多種氨基酸的水平在CMS組顯著增加，包括異亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、瓜氨酸、L-半胱氨酸和三甲基賴氨酸。此外，谷氨酰胺與control組相比顯著減少。CMS組的瓜氨酸水平比control組高，表明CMS患者的氮代謝可能增強(qiáng)。尿素循環(huán)中氨和二氧化碳轉(zhuǎn)化為尿素并生成一個(gè)分子延胡索酸，這與延胡索酸含量升高的表現(xiàn)是一致的。瓜氨酸的代謝通路中, 一氧化氮合酶催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸和一氧化氮(一種內(nèi)源性血管舒張因子,可改善血液流變性和保持微循環(huán)的暢通)，有文獻(xiàn)報(bào)道，腦缺血后給與NO合成底物 L-精氨酸后，血清 NO濃度升高，可減輕腦缺血并保護(hù)海馬神經(jīng)元[11]，以此推測(cè)在慢性高原病患者NO濃度可能也是升高的。異亮氨酸作為一種重要必需氨基酸，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種代謝和功能，異亮氨酸可提高雌鼠血清抗氧化能力[12]，說(shuō)明CMS患者為適應(yīng)高原低氧環(huán)境機(jī)體可能存在抗氧化能力增強(qiáng)的狀態(tài)。甘氨酸是是機(jī)體內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione,GSH)的組成氨基酸，大量文獻(xiàn)報(bào)道，在某些病理情況下，甘氨酸具有抗炎、抗損傷、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞保護(hù)等促進(jìn)機(jī)體防御作用[13]。絲氨酸不但參與蛋白質(zhì)的合成，而且是合成磷脂酰絲氨酸、鞘脂、核苷酸及甘氨酸的前體，絲氨酸可通過(guò)激活甘氨酸受體減少腦梗死體積，減輕腦水腫[14]。異亮氨酸、延胡索酸、1-磷酸葡萄糖、瓜氨酸、肌苷和甘氨酸的AUC值分別為0.895 8、0.89、0.84、0.8、0.712 5和0.704 2。因此，CMS組上述氨基酸具有較高代謝水平可能表明機(jī)體在氨基酸層面存在積極代償反應(yīng)。谷氨酰胺參與人體多種代謝，當(dāng)機(jī)體酸性物質(zhì)過(guò)多時(shí)，其經(jīng)腎小管上皮細(xì)胞谷氨酰胺酶水解生成谷氨酸和氨，氨結(jié)合H+來(lái)促進(jìn)H+從尿中排出，從而降低H+濃度，谷氨酰胺血清代謝水平下降，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；再者，谷氨酸可在谷氨酸脫氫酶的作用下分解為α-酮戊二酸，可能參與合成谷胱甘肽，緩解CMS的氧化應(yīng)激損傷[15]。

表2 CMS組與control組比較差異表達(dá)的代謝物

RT: retention time; VIP: variable importance for the projection.

肌苷是腺苷酸分解產(chǎn)物，其與炎癥、缺氧和組織損傷有關(guān)[16]。肌苷升高可能與適應(yīng)低氧環(huán)境有關(guān),還可能有助于調(diào)節(jié)CMS的炎癥過(guò)程。在缺氧條件下肌苷可滲透進(jìn)入細(xì)胞增強(qiáng)酶的活性，尤其是輔酶和丙酮酸氧化酶，從而促進(jìn)細(xì)胞代謝。CMS組血清肌苷水平增高表明肌苷可能參與藏族慢性高原病患者機(jī)體抗缺氧損傷反應(yīng)。核糖在CMS組顯著高于對(duì)照組，在高原缺氧的疾病狀態(tài)下，ATP 的分解速度大于合成速度，絕大部分ATP 的降解產(chǎn)物 IMP 可通過(guò)補(bǔ)救途徑重新合成 ATP， 小部分IMP 會(huì)進(jìn)一步降解，以嘌呤形式流失， 進(jìn)而導(dǎo)致核苷酸不斷減少，細(xì)胞可再通過(guò)補(bǔ)救合成途徑彌補(bǔ)流失的ATP，其中核糖含量是限制其恢復(fù)速度的重要因素。核糖作為人體重要的能量代謝物質(zhì)具有很好的改善心臟缺血[17]、 提升心臟功能[18]、增強(qiáng)肌體能量代謝、 緩解肌肉酸痛等功能，具有有效的抗氧化作用[19]。上述核糖的功用可能說(shuō)明，CMS患者核糖升高的可能機(jī)制是機(jī)體為適應(yīng)低氧而作出的代償適應(yīng)性反應(yīng)。至于其他有差異代謝物如磷酸甲酯、2 2-二甲基丁二酸、來(lái)蘇糖、β-酮己二酸和植烷酸在 CMS組顯著升高的機(jī)制還不明確。然而，它們都有比較高的VIP值和顯著性，進(jìn)一步的研究可能需要關(guān)注這些代謝物的功能，以排除假陽(yáng)性的可能。

Figure 2. ROC graphs of metabolites with the highest AUC values.

圖2具有較高AUC值代謝物ROC曲線圖

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Preliminary study of patients with chronic mountain sickness by GC-TOF-MS based serum metabolomics analysis

CAO Xue-feng, BAI Zhen-zhong, MA Lan, MA Shang, GE Ri-li

(Research Center for High Altitude Medical Sciences, Qinghai University Medical College, Xining 810001, China. E-mail:geriligao@hotmail.com)

AIM: To evaluate specific metabolomics profiles in the serum of patients with chronic mountain sickness (CMS) and to explore the potential metabolic biomarkers in the native Tibetans living on the Qinghai-Tibet Pla-teau.METHODS: A gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF-MS) approach as a metabolomics technique was used to evaluate metabolic differences. The native Tibetan CMS patients (n=10) and healthy Tibetan controls (n=10) were enrolled from YuShu in Qinghai province in this study. The serum samples were collected and analyzed by GC-TOF-MS coupled with a series of multivariate statistical analyses such as principal component analysis (PCA), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA).RESULTS: The intergroup differences between CMS patients and control subjects have been observed. A list of differential metabolites and several top altered metabolic pathways have been identified. The levels of fumaric acid, an intermediate in the tricarboxylic acid (TCA) cycle, and inosine were highly upregulated in the CMS patients, suggesting a greater effort to hypoxic adaptation in high elevation area. Other differential metabolites, such as methyl phosphate, 2-ketoadipate, lyxose and phytanic acid were also identified. Importantly, the differential metabolites possessed higher area under the ROC curve (AUC) values, indicating an excellent clinical ability for the prediction of CMS. Increased levels of amino acids (isoleucine, glycine, serine, L-cysteine, citrulline and trimethyllysine) were detected in CMS group, yet significantly decreased levels of sulfuric acid, oxamic acid, lyxose and glutamine were also detected in CMS group than those in control group. At the same time, the levels of ribose and glucose-1-phosphate were markedly elevated in CMS group (P<0.05).CONCLUSION: The metabolic activities are significantly altered in the serum of CMS patients. High altitude hypoxia may act on the disturbed glucose metabolism and amino acid metabolism in part of the Tibetan triggered by CMS.

Chronic mountain sickness; Gas chromatography time-of-flight mass spectrometry; Metabolomics

1000- 4718(2017)09- 1676- 07

2016- 12- 01 [

] 2017- 04- 13

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(No. 2012CB518200)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31571231)；青海-猶他聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(No. 2014-ZJ-Y39)；青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中青年科研基金資助項(xiàng)目(No. 2015-KY-2)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.023

△通訊作者 Tel: 0971-6108393; E-mail: geriligao@hotmail.com