鄧云云，王笑月，李才廣，孟宏，董銀卯，李麗*

(1.海南京潤(rùn)珍珠生物技術(shù)股份有限公司，海南 ?？?570100；2.北京工商大學(xué) 理學(xué)院，北京 100048)

珍珠水解液的美白作用機(jī)理研究

鄧云云1，王笑月2，李才廣1，孟宏2，董銀卯2，李麗2*

(1.海南京潤(rùn)珍珠生物技術(shù)股份有限公司，海南 ?？?570100；2.北京工商大學(xué) 理學(xué)院，北京 100048)

目的：通過(guò)人的黑色素細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究珍珠水解液的美白作用機(jī)理。方法：NaOH法測(cè)定黑色素細(xì)胞黑色素含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-PCR)測(cè)定珍珠水解液對(duì)影響黑色素合成的相關(guān)基因酪氨酸酶基因(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP1)及影響黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)。結(jié)果：濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液可以抑制黑色素細(xì)胞的黑色素合成，3種濃度下的珍珠水解液均可抑制相關(guān)基因TRP1 mRNA的表達(dá)，0.25%濃度下可抑制TYR、TRP1及MITF的mRNA的表達(dá)。結(jié)論：珍珠水解液主要通過(guò)抑制黑色素合成過(guò)程中TRP1 mRNA的表達(dá)，從而抑制黑色素合成而發(fā)揮美白功效。

珍珠水解液；酪氨酸酶基因；酪氨酸酶相關(guān)蛋白1；小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子；黑色素含量；美白機(jī)制

珍珠是由珍珠貝科動(dòng)物馬氏珍珠貝Pteriamartensii和蚌科動(dòng)物三角帆蚌Hyriopsiscumingii和褶紋冠蚌Cristariaplicata的外套膜受刺激后的分泌物聚集而成，有安神定驚、明目消翁、解毒生肌的功能，主治驚悸失眠、驚風(fēng)癲痛、目赤翳障、瘡瘍不斂[1-2]。珍珠粉富含人體需要的多種蛋白質(zhì)及角蛋白肽類、多種氨基酸、24種微量元素和鈣等多種有效成分，具有抗疲勞、明顯降低過(guò)氧化酯作用，從而起到養(yǎng)顏?zhàn)o(hù)膚、延緩衰老之功效[3]，因而常被用作高級(jí)補(bǔ)養(yǎng)品和高檔化妝品的原料[4-5]。

研究表明，珍珠可通過(guò)抑制酪氨酸酶而發(fā)揮美白作用[6]，但對(duì)其具體的美白作用機(jī)制尚不明確。目前關(guān)于珍珠對(duì)皮膚美白功效的研究還處于起步階段，本文首次將樣品作用于人黑色素細(xì)胞模型，研究珍珠水解液抑制黑色素合成的作用機(jī)制，為其作為化妝品功效添加劑應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞

1.2 供試品珍珠水解液制備

珍珠水解液工藝：珍珠粉 →乳酸化 →酸解珍珠液 →離心分離 →珍珠蛋白→ 酶解珍珠液。將離心分離時(shí)得到的酸解珍珠液與酶解珍珠液混合即可得到全成分的水解珍珠液。

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基(gibco，批號(hào)：8115216)，胰蛋白酶-EDTA(gibco，批號(hào)：1676922)，雙抗混合液(gibco，批號(hào)：1697547)，PBS緩沖液(HyClone，批號(hào)：NAH1449)，MTT(Sigma)，DMSO(Amresco)，RNA提取試劑盒(Takara)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，熒光染料(Takara)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)：150209)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 儀器耗材

無(wú)菌操作臺(tái)(北京世安科林凈化技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(ThermoScientific)，高速離心機(jī)(Eppendof)，倒置顯微鏡(Olympus)，酶標(biāo)儀(Tecan)，M3讀板儀(Molecular Device)，離心機(jī)(Thermo)，熒光定量PCR儀(BioRad)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用保護(hù)性耕作方式能夠改善土壤環(huán)境條件，提升土壤中的有機(jī)碳和活性有機(jī)碳含量，比傳統(tǒng)耕作方式更有利于植物生長(zhǎng)。通過(guò)本次試驗(yàn)研究，可以更好地認(rèn)識(shí)保護(hù)性耕作措施對(duì)于改善土壤條件和提高有機(jī)碳含量的效果，從而推廣保護(hù)性耕作措施，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平。

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑色素細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基傳代，置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 人源黑色素細(xì)胞細(xì)胞活率的測(cè)定

采用MTT法測(cè)定黑色素細(xì)胞活率。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期黑色素細(xì)胞，以9000 個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過(guò)夜。分別加入終濃度為0.1% mg·mL-1的熊果苷，終濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液，以未處理組作為細(xì)胞對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，加入MTT，繼續(xù)孵育4 h后棄掉孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度(A)值。

細(xì)胞活率=(測(cè)定孔A值-空白對(duì)照A值)/(細(xì)胞對(duì)照組A值-空白對(duì)照A值)×100%

2.3 黑色素測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期黑色素細(xì)胞，以1×105個(gè)·mL-1的密度接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶5 mL，培養(yǎng)過(guò)夜。分別加入終濃度為0.1% mg·mL-1的熊果苷，終濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液，以未處理組作為細(xì)胞對(duì)照組。培養(yǎng)48 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加入1M NaOH(10%DMSO)，刮取收集細(xì)胞，放入80oC水浴30 min，取上清液加入96孔板，M3讀板儀于475 nm讀取吸光度值。

黑色素含量變化=(測(cè)定孔A值-空白對(duì)照A值)/(細(xì)胞對(duì)照組A值-空白對(duì)照A值)

2.4 基因TYR和TRP1及MITF的熒光定量PCR檢測(cè)

首先以2×105孔的接種密度，接種細(xì)胞至6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜；待6 孔板中細(xì)胞鋪板率達(dá)到50%左右時(shí)，進(jìn)行給藥。實(shí)驗(yàn)設(shè)立給藥組與對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液，對(duì)照組加入培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱分別孵育培養(yǎng)48 h。孵育培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入1 mL Trizol，吹打裂解細(xì)胞后，收樣。提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。

本研究中使用的引物的序列如下表所示：

表1 熒光定量PCR的引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 供試品對(duì)人源黑色素細(xì)胞細(xì)胞活率及黑色素含量的影響

珍珠水解液在0.25%、0.5%、0.75%作用下，對(duì)黑色素細(xì)胞活率無(wú)明顯影響，可使黑色素細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)黑色素含量有所降低，如表2。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示，珍珠水解液在0.25%、0.5%、0.75%作用下，對(duì)人源黑色素細(xì)胞無(wú)毒作用；與對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和樣品組均可使黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素含量有所降低，且陽(yáng)性對(duì)照組和0.75%濃度的珍珠水解液的效果差異具有非常顯著性意義(P<0.01)。

3.2 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)步驟開(kāi)展檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示，48 h后，與對(duì)照組相比，體積分?jǐn)?shù)為0.25%的珍珠水解液對(duì)人源黑色素細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP1和MITF mRNA的表達(dá)均有非常顯著性的抑制作用(P<0.01)；體積分?jǐn)?shù)為0.5%、0.75%的珍珠水解液對(duì)人源黑色素細(xì)胞內(nèi)TYR和MITF mRNA的表達(dá)無(wú)明顯的影響，但卻抑制了TRP1 mRNA的表達(dá)，且差異具有非常顯著性意義(P<0.01)。

表2 珍珠水解液對(duì)于人源黑色素細(xì)胞細(xì)胞活率及黑色素含量的影響

注：與對(duì)照組相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

表3 珍珠水解液對(duì)人源黑色素細(xì)胞中TYR、TRP1和MITF mRNA表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

4 討論

珍珠，含有多種活性成分，自古就是美容養(yǎng)顏之佳品[5]。但目前關(guān)于珍珠美白的作用機(jī)理尚未有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了人的黑色素細(xì)胞模型，通過(guò)對(duì)黑色素合成相關(guān)基因的檢測(cè)，闡述珍珠水解液的美白作用機(jī)理。結(jié)果顯示，測(cè)試濃度下珍珠水解液具有較高的安全性，能夠在保持細(xì)胞生長(zhǎng)的前提下抑制黑色素的生長(zhǎng)；同時(shí)，在0.25%、0.5%、0.75%測(cè)試濃度下，珍珠水解液對(duì)黑色素合成關(guān)鍵酶TRP1的基因表達(dá)均具有顯著抑制作用，在0.25%測(cè)試濃度下，珍珠水解液對(duì)TYR、TRP1、MITF的基因表達(dá)均具有顯著的抑制作用。

酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP1)和轉(zhuǎn)錄因子(MITF)均為參與黑色素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶。TYR是黑色素合成的關(guān)鍵酶，該酶催化黑色素合成早期限速反應(yīng)[7]。首先通過(guò)羥基化作用將酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟停缓蠖喟陀直辉撁秆趸癁槎喟王?，最后在半胱氨酸的參與下，多巴醌被化學(xué)修飾為3-半光酰多巴和5-半光酰多巴，正是這兩種物質(zhì)氧化并聚合成褐黑色素。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，半胱氨酸逐步被消耗，多巴醌在酪氨酸酶的作用下形成多巴色素，接著多巴色素失去羧基并通過(guò)一系列的氧化和聚合反應(yīng)形成另一種暗褐色的色素二羥吲哚(DHI)。與此同時(shí)，由于多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT)的存在使得部分多巴色素的羥基通過(guò)一系列的氧化與聚合反應(yīng)形成第三種黑色素形式——二羥吲哚羧酸(DHICA)，這種黑色素顏色較淺，呈棕褐色。至此，黑色素合成完全結(jié)束。TRP1是第一個(gè)克隆成功的色素基因，是黑色素細(xì)胞中含量最為豐富的糖蛋白，定位于黑色素小體膜，在黑色素合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，TRP1的突變影響鼠棕黑色素的表達(dá)，這一過(guò)程是通過(guò)影響多巴氧化酶和/或DHICA氧化酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的[9]。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)作為黑色素細(xì)胞最重要的轉(zhuǎn)錄因子，在皮膚黑色素生成過(guò)程中，MITF作為分子開(kāi)關(guān)，可調(diào)控TRPs家族的表達(dá)，參與黑色素的生成[10]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，珍珠水解液可通過(guò)抑制黑色素合成中的關(guān)鍵酶尤其是TRP1的基因表達(dá)而發(fā)揮美白作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為珍珠水解液作為美白的化妝品功效添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

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Skin-whiteningMechanismofMargaritaLiquid

DENG Yunyun1，WANGXiaoyue2，LICaiguang1，MENGhong2，DONGyinmao2，LIli2*

(1.HainanJingrunBiotechnologyCo.Ltd.，Haikou570100，China；2.BeijingTechnologyandBusinessUniversity，Beijing100048，China)

Objective：To study skin-whitening mechanism of Margarita liquid by in vitro melanoma cells tests.Methods：The skin-whitening activities were evaluated by measuring human melanocytes melanin synthesis inhibition activity，and Real-time PCR(RT-PCR)method was further used to evaluate the expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF)，tyrosinase-related protein 1 (TRP1) and Tyrosinase(TYR)mRNA.Results：0.25%，0.5% and 0.75% concentration of Margarita liquid could significantly decreased human melanocytes melanin synthesis，all the three concentrations of Margarita liquid could decrease the expression of TRP1 mRNA，and 0.25% concentration of Margarita liquid could decrease the expression of TYR、TRP1 and MITF mRNA.Conclusion：Margarita liquid was detected to have skin-whitening activity through in vitro Human melanoma cells tests，it could be used as a skin-whitening cosmetic additive.

Margarita liquid；TYR；TRP1；MITF；melanin content；whitening mechanism

] 李麗，副教授，研究方向：化妝品植物功效原料與配方技術(shù)；Tel：(010)68987110，E-mail：lili2212@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.017

2016-09-30)

*[