張秋紅，于姍姍，李磊

(1.濟(jì)南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟(jì)南 250102；2.濟(jì)南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟(jì)南 250102；3.濟(jì)南市第四人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000)

酸棗仁中蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析△

張秋紅1*，于姍姍2，李磊3

(1.濟(jì)南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟(jì)南 250102；2.濟(jì)南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟(jì)南 250102；3.濟(jì)南市第四人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000)

目的：比較不同產(chǎn)地及生炒酸棗仁的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果，分析它們之間的共性和差異。方法：本實驗采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的技術(shù)對40個不同酸棗仁樣品進(jìn)行分析評價。結(jié)果：根據(jù)電泳指紋圖譜整理分析的數(shù)據(jù)得到對酸棗仁的初步聚類分析結(jié)果。結(jié)論：聚丙烯酰胺凝膠電泳可以大致定性區(qū)別不同產(chǎn)地的酸棗仁樣品。

酸棗仁；蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳；聚類分析

2015版《中華人民共和國藥典》收載酸棗仁為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.Spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子。酸棗仁味甘、酸，性平。歸肝、膽、心經(jīng)。用于虛煩不眠，驚悸多夢，體虛多汗，津傷口渴[1]。酸棗仁為養(yǎng)心安神藥，生活中常被用作鎮(zhèn)靜、安眠、益肝類藥品和相關(guān)保健食品的原料之一[2-3]。酸棗仁主產(chǎn)于山東、河北、陜西、遼寧、河南等地，內(nèi)蒙古、甘肅、山西、安徽等地亦產(chǎn)，山東酸棗資源十分豐富，是我國酸棗仁的主要產(chǎn)區(qū)之一，素有“東棗仁”之稱，產(chǎn)量大、質(zhì)量優(yōu)，主要產(chǎn)于蒙陰、平邑、沂水、青州、臨朐、萊蕪、歷城、淄博、牟平等縣(市)[4]。酸棗仁中包含的化學(xué)成分有：脂肪酸、皂苷、黃酮類化合物、生物堿、氨基酸等其他成分[5-7]，《中華人民共和國藥典》將酸棗仁皂苷A和斯皮諾素兩個化學(xué)成分作為指標(biāo)性成分來監(jiān)測酸棗仁質(zhì)量[8]。

酸棗仁營養(yǎng)成分中脂肪占24.10%，蛋白質(zhì)占0.80%，碳水化合物占61.00%，蛋白質(zhì)是酸棗仁的主要成分之一。蛋白質(zhì)作為基因的直接穩(wěn)定產(chǎn)物，能反映生物DNA組成上的差異。種子蛋白是植物體中有高強度基因表達(dá)的一類，且能在種子內(nèi)積累大量而不降解的蛋白質(zhì)，其電泳譜帶具有高度穩(wěn)定性、專一性和疊加性。種子蛋白作為遺傳標(biāo)記常被用于品種鑒定及植物繁育系統(tǒng)的鑒別[9-10]。而聚丙烯酞胺凝膠電泳(PAGE)有機(jī)械性能好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、幾乎無滲電作用、樣品重復(fù)性高、樣品不易擴(kuò)散、用量少、分辨率高、孔徑可調(diào)節(jié)等優(yōu)點，PACE應(yīng)用范圍廣可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等物質(zhì)的分離[11]。本實驗利用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對山東省內(nèi)、省外和一些進(jìn)口的酸棗仁及其偽品的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，以便為酸棗仁的質(zhì)量控制研究提供輔助方法[12-16]。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

FA2004型電子天平；超聲清洗機(jī)(南京先歐儀器制造有限公司)；SK-1型快速混勻旋渦機(jī)(中國深圳國華儀器廠 )；LGR16-W 型高速冷凍離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；BCD-215T BDZ型冰箱(青島海爾)；微量進(jìn)樣器；KE0053471型移液器(10～100 μL)；移液器(100～1000 μL)；普通注射器；DYCZ-24A 型電泳儀槽(北京六一儀器廠)；DYY-8B型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(BioSens SC 805)；酸度計。

1.2 材料

樣品由濟(jì)南市食品藥品檢驗中心張秋紅老師提供，真品鑒定為酸棗ZiziphusjujubaMill.var.Spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，實驗樣品的產(chǎn)地、處理方法、采收時間等信息見表1。

表1 酸棗仁樣品信息

1.3 試劑

丙烯酰胺(Amresco0341-500G)；雙丙烯酰胺(Amresco 0172)；過硫酸銨；蔗糖(分析純，天津市勵特吉爾環(huán)保技術(shù)研究所，批號：2001.7.10)；Tris(三羥甲基氨基甲烷，分析純，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號：940302)；甘氨酸；瓊脂粉；TEMED(即四甲基乙二胺，上海展云化工有限公司，批號：1204055)；溴酚藍(lán)；冰醋酸；考馬斯亮藍(lán)(R250)；甲醇。分離膠緩沖液(pH 8.9)，分離膠貯存液，0.56%過硫酸銨溶液，濃縮膠緩沖液(pH 6.7)，濃縮膠貯存液，40%蔗糖溶液，電極緩沖液(pH 8.3)，4%瓊脂液，脫色液均需按常規(guī)方法配制。所有試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樣品與試劑的制備

2.1.1 試劑的制備

2.1.1.1 分離膠緩沖液 精密稱取Tris 36.6 g調(diào)節(jié)pH至8.9，定容至100 mL。

2.1.1.2 分離膠貯液 精密稱取丙烯酰胺28 g和雙丙烯酰胺0.74 g，定容至100 mL。

2.1.1.3 0.56%過硫酸銨 精密稱取過硫酸銨0.28 g，定容至50 mL。

2.1.1.4 濃縮膠緩沖液 精密稱取Tris 2.99 g調(diào)節(jié)pH至6.7，定容至50 mL。

2.1.1.5 濃縮膠貯液 精密稱取丙烯酰胺5 g和雙丙烯酰胺1.25 g，定容至50 mL。

2.1.1.6 40%蔗糖溶液 精密稱取蔗糖40 g，定容至100 mL。

2.1.1.7 電極緩沖液(pH 8.3) 精密稱取Tris 0.6 g、甘氨酸2.88 g，加純凈水1000 mL備用。

2.1.1.8 考馬斯亮藍(lán)(R250)染色液 精密稱取考馬斯亮藍(lán)(R250)1 g，加少量甲醇溶解，用含20%甲醇和7%醋酸的水溶液稀釋至1000 mL。

2.1.1.9 脫色液 甲醇100 mL、冰醋酸35 mL，加純凈水至500 mL。

2.1.2 樣品的制備 精密稱定酸棗仁細(xì)粉各0.500 0 g，分別加入1 mL提取液(稀釋至5倍的濃縮膠緩沖液pH 8.9)，研磨成勻漿狀，冰浴超聲提取15 min，冷凍離心，取清液，與等體積40%蔗糖溶液混合，作為供試品溶液，置冰箱內(nèi)冷藏。

2.2 電泳槽安裝與凝膠制備

將安裝好的兩塊電泳槽下方，注入瓊脂封底。按比例配置分離膠液80 mL，超聲脫氣10 min后加入TEMED 150 μL，混勻，立即緩緩注入已安裝好的兩塊凝膠模中，用膠頭滴管均勻地滴數(shù)滴純凈水于膠液上表面。待分離膠凝固，形成膠與水層之間的清晰的界面，用濾紙吸凈多余水分。取按比例配置濃縮膠膠液20 mL，超聲脫氣混勻10 min后加入TEMED 50 μL，注入兩塊凝膠模子中。分別插上樣品槽模板，待濃縮膠變?yōu)槿榘咨?，垂直取出樣品槽模板。凝膠的配制參見表2。

表2 蛋白質(zhì)電泳凝膠的配制

2.3 上樣與電泳

用微量進(jìn)樣器吸取樣品提取液10 μL，緩緩注入濃縮膠樣品槽內(nèi)，其中0～20號樣品為第一組，21～40號樣品為第二組，采用平行條件點于兩塊凝膠電泳板。在負(fù)極槽電極緩沖液以溴酚藍(lán)指示劑示蹤，電泳開始時穩(wěn)流40 mA，待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)兩膠交界處時即樣品進(jìn)入分離膠后，穩(wěn)流50 mA。待指示劑行至分離膠與濃縮膠界線以下9 cm時，關(guān)閉電源，停止電泳。電泳過程為防止溫度過高，整個過程應(yīng)在冰箱內(nèi)低溫下進(jìn)行。

2.4 染色與脫色

打開電泳槽，取出凝膠板后，切去瓊脂與濃縮膠，保留分離膠，并標(biāo)記前沿。隨即將凝膠浸于考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫下染色1 h，取出，傾去染色液，用蒸餾水洗去凝膠表面附著的染料，脫色液漂洗數(shù)次，直至譜帶背景清晰。將凝膠板保存于7%醋酸溶液中。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)果

將脫去底色的電泳凝膠照相得到酸棗仁的蛋白質(zhì)電泳圖譜，結(jié)果見圖1；經(jīng)BioSens軟件分析，蛋白質(zhì)條帶在各凝膠指紋圖譜中的分布結(jié)果見圖2。

圖1 酸棗仁樣品蛋白質(zhì)電泳圖譜

3.2 分析

根據(jù)電泳結(jié)果計算出每個品種各譜帶的Rf值，用0、1表示電泳譜帶的有無，在相同值位置上有蛋白質(zhì)譜帶的記為1，無帶記為0，結(jié)果見表3。采用NTSYSpc 2.10e統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行聚類分析，獲得聚類分析圖，見圖3[17-19]。

圖2 酸棗仁蛋白質(zhì)電泳(Pro-PAGE)指紋圖譜

表3 酸棗仁樣品蛋白條帶的Rf值

圖3 酸棗仁蛋白質(zhì)電泳圖譜聚類圖

4 討論與結(jié)論

酸棗仁的蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜出現(xiàn)較為明顯的峰帶15種，各個樣品共有峰說明酸棗仁種內(nèi)蛋白質(zhì)種類的一致性，其他峰的有無和峰形明顯不同，則體現(xiàn)了酸棗仁樣品之間的差異性。

由酸棗仁聚類分析圖可以看出，所有樣品的相似性系數(shù)為0.53，真品酸棗仁與偽品兵豆(豆科兵豆屬)染色之后外形相似，兩者均是離瓣花亞綱植物種子，容易混淆，部分不法藥商在酸棗仁中混入偽品兵豆以假亂真，不僅影響酸棗仁藥效，還擾亂了藥材市場秩序。聚類分析得出酸棗仁與兵豆的差異系數(shù)是0.47，所以蛋白質(zhì)電泳可以初步鑒定酸棗仁真?zhèn)?；中國產(chǎn)地的酸棗仁樣品相似性系數(shù)是0.578；山東除了7個地區(qū)酸棗仁外，剩余大部分地區(qū)(77%)酸棗仁之間的相似性系數(shù)為0.64；山東泰安、萊蕪的酸棗仁與河北、山西、河南等部分省外酸棗仁共性較大，相似性系數(shù)達(dá)到0.665，可能與品種引進(jìn)種植或者土壤性質(zhì)有關(guān)系；山東酸棗仁與中國其他地區(qū)產(chǎn)的酸棗仁差異程度為0.422；進(jìn)口酸棗仁間的相似程度較高，達(dá)到0.76，且其蛋白譜帶顏色最淺，指紋圖譜峰形最少，明顯區(qū)別于國產(chǎn)酸棗仁，也說明進(jìn)口酸棗仁蛋白種類及含量均低于國產(chǎn)酸棗仁。一些同產(chǎn)地酸棗仁炒制之后與原有生品出現(xiàn)差異，一些蛋白質(zhì)峰帶消失，說明酸棗仁炒制處理可能會破壞部分蛋白質(zhì)，若想盡可能保護(hù)利用酸棗仁蛋白質(zhì)，則不宜作炒制處理，盡量使用生品。酸棗仁染色之后與原生品產(chǎn)生差異，所以染色也可能會影響酸棗仁蛋白質(zhì)的穩(wěn)定保存。17號是從市場購入，產(chǎn)地未知，根據(jù)以上酸棗仁聚類分析圖結(jié)果，可以推斷其可能是山東產(chǎn)地的酸棗仁[20-21]。

根據(jù)蛋白質(zhì)電泳圖譜中譜帶顏色的深淺可以粗略判斷酸棗仁中蛋白質(zhì)含量多少，酸棗仁炒制或者染色處理之后，它們的蛋白圖譜顏色與原來相比變淺，可見其蛋白含量減少了；從產(chǎn)地看，進(jìn)口酸棗仁電泳圖譜顏色明顯比國產(chǎn)酸棗仁的淺，說明國產(chǎn)酸棗仁質(zhì)量一般優(yōu)于進(jìn)口酸棗仁。

蛋白質(zhì)是植物基因表達(dá)的產(chǎn)物，不同的品種具有不同的蛋白質(zhì)譜帶模式，用Pro-PAGE電泳指紋圖譜可以有效地鑒別植物的品種。種子蛋白穩(wěn)定且具有豐富的遺傳多樣性，可為許多中藥材品種的分析提供輔助依據(jù)。

本實驗藥材提取方法簡單，使用凝膠板較小的DYCZ-24D型電泳槽得到的蛋白質(zhì)譜帶不清晰，換用凝膠板較大DYCZ-24A型電泳槽之后蛋白質(zhì)譜帶分離較好。另外酸棗仁是種子類藥材，含有很多的油脂成分會干擾種子蛋白質(zhì)的提取，對蛋白電泳實驗產(chǎn)生不利影響。已有文獻(xiàn)對瓜蔞種子蛋白6種提取方法作出比較：蛋白質(zhì)提取液提取法、TCA-丙酮法提取蛋白含量較高，但雜質(zhì)多，電泳譜帶嚴(yán)重展寬而且明顯拖尾；Tris-丙酮法提取的蛋白質(zhì)種類缺失嚴(yán)重；直接提取法提取蛋白含量少，但雜質(zhì)少，電泳譜帶清晰，離心2次譜帶更加清晰；所以水溶液直接提取法最適合用于聚丙烯酰胺凝膠電泳，而蛋白質(zhì)提取液提取法提出蛋白質(zhì)含量最高[22]，故本實驗采用最簡單的水溶液直接提取法。實驗結(jié)果表明本實驗方法可定性分析酸棗仁蛋白質(zhì)、粗略判斷蛋白質(zhì)含量以區(qū)別不同產(chǎn)地酸棗仁，但其準(zhǔn)確度不高，有待找出更為準(zhǔn)確的實驗方法。

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AnalysisofProteininSemenZiziphiSpinosaebyPolyacryamideGelElectophoresis

ZHANG Qiuhong1，YUShanshan2*，LILei3

(1.JinanCenterforFoodandDrugControl，Jinan250102，China；2.JinanCenterforFoodandDrugControl，Jinan250102，China3.TheFourthPeople′sHospitalofJinanCity，Jinan250000，China)

Objective：To compare the protein of different kinds of Semen Ziziphi Spinosae by PAGE，and analyze their common ground and differentiation.Methods：Polyacryamide gel eletrophoresis was employed to analyze and evaluate 40 specimens of Semen Ziziphi Spinosae.Results：The elementary hierarchical cluster analysis results were obtained on the basis of pro-PAGE.Conclusion：Pro-PAGE can be used to rough qualitative distinguishing of Semen Ziziphi Spinosae specimens from different habitats.

Semen Ziziphi Spinosae；Pro-PAGE；hierarchical cluster analysis

山東省中醫(yī)藥管理局山東省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究項目(2011-241)

] 張秋紅 碩士，副主任中藥師，研究方向：中藥質(zhì)量控制與資源研究；E-mail：Zhangqh9886@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.013

2017-01-13)

*[