浦香東，王麗芝

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193)

·基礎(chǔ)研究·

丹參酮合成相關(guān)的候選基因CYP76AK5克隆及生物信息學(xué)分析△

浦香東，王麗芝1*

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津300193)

目的：基于丹參基因組和轉(zhuǎn)錄組篩選、克隆及分析丹參酮合成途徑候選的CYP450編碼基因。方法：設(shè)計引物克隆SmCYP76AK5編碼基因，通過MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并結(jié)合實時定量PCR分析其在根不同組織(周皮、韌皮部、木質(zhì)部)、根、莖、葉、花中的差異表達(dá)；最后利用在線生物信息學(xué)工具分析其理化性質(zhì)，預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域等。結(jié)果：系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明SmCYP76AK5屬于CYP71clan；基因差異表達(dá)顯示SmCYP76AK5在根周皮中表達(dá)最高，與丹參酮的合成和積累相一致。結(jié)論：預(yù)測丹參SmCYP76AK5參與丹參酮的生物合成。

丹參；丹參酮；生物合成；SmCYP76AK5；差異表達(dá)

藥用植物次生代謝產(chǎn)物是天然藥物的主要來源，萜類化合物在植物天然產(chǎn)物中種類最多，如能夠有效治療癌癥的紫杉醇和治療瘧疾的青蒿素等。丹參為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物丹參SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根和根莖，在心腦血管疾病診療中效果顯著，丹參酮類化合物是其重要的活性成分之一[1-5]。以丹參酮為主要成分的復(fù)方丹參滴丸于2016年3月16日順利提前完成美國食品和藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)三期臨床試驗，屆時將成為首例獲得美國FDA認(rèn)證的復(fù)方中藥。由于其重要的藥理價值及資源需求，丹參酮生源途徑的解析得到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。丹參作為藥用模式植物，對其丹參酮生物合成途徑分子機(jī)制的解析具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值[6]。

丹參酮上游生物合成途徑與其他植物萜類合成途徑較一致，具有共同的萜類合成前體，異戊烯基焦磷酸(Isopentenyldiphosphate，IPP)，由甲羥戊酸(MVA)和甲基赤蘚醇4-磷酸(MEP)途徑合成而來[7-8]。MVA途徑由6個關(guān)鍵酶(AACT、HMGS、HMGR、MK、PMK、MDC)依次催化乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)合成IPP；MEP途徑由7個關(guān)鍵酶(DXS、DXR、MCT、CMK、MDS、HDS、HDR)逐步催化3-磷酸甘油醛(Glyceraldehyde-3-phosphate，G3P)和丙酮酸(Pyruvate)合成IPP；萜類前體IPP在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(Isopentenyldiphosphateisomerase，IDI)的作用下可逆催化二甲基丙烯基焦磷酸(Dimethylallyldiphosphate，DMAPP)的合成；然后在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyldiphosphatesynthase，GGPPS)的催化作用下聚合IPP和DMAPP 形成二萜前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyldiphosphate，GGPP)；最后在關(guān)鍵酶SmCPS和SmKSL的作用下催化GGPP合成次丹參酮二烯(Miltiradiene)，其作為丹參酮合成的前體物質(zhì)，在一系列CYP450s的催化作用下生成丹參酮類化合物[9-12]。

細(xì)胞色素P450(CYP450)是一類含亞鐵血紅素的酶，在植物中CYP超家族基因占蛋白質(zhì)編碼基因的1%，具有廣泛的底物選擇性，目前植物中已知的底物有數(shù)百種，其催化活性多而復(fù)雜，如烴基的氧化和過氧化作用[13-15]。丹參酮前體次丹參酮二烯在丹參中通過一系列反應(yīng)由烯烴前體形成，在不同的CYP450s作用下生成多樣的丹參酮類化合物，已知的有：SmCYP76AH1催化次丹參酮二烯合成鐵銹醇(Ferruginol)；SmCYP76AH3催化鐵銹醇合成羥基化鐵銹醇(11-hydroxy ferruginol)、柳杉酚(Sugiol)、羥基化柳杉酚(11-hydroxy ferruginol)；SmCYP76AK1催化二羥基鐵銹醇(11，20-dihydroxy ferruginol)和二羥基柳杉酚(11，20-dihydroxy sugiol)的合成[16-19]。丹參酮的生物合成需要CYP450s參與，本研究基于Xu等篩選的33個丹參根周皮顯著高表達(dá)的CYP450[12]，進(jìn)一步結(jié)合已發(fā)表的丹參全基因組及轉(zhuǎn)錄組信息，篩選并克隆到可能參與丹參酮合成的SmCYP76AK5，系統(tǒng)分析其進(jìn)化關(guān)系及差異表達(dá)，并完成其理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，為下一步研究其功能，實現(xiàn)丹參酮類化合物的體外生產(chǎn)或探索其體內(nèi)代謝途徑奠定基礎(chǔ)[20-25]。

1 材料

丹參植物材料(99-3)來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。丹參根、莖、葉、花、根周皮、根韌皮部、根木質(zhì)部均取自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所實驗田。用于構(gòu)建CYP450系統(tǒng)進(jìn)化樹的擬南芥(Arabidopsisthaliana)CYP450氨基酸序列來自于CYP450數(shù)據(jù)庫(http：//drnelson.uthsc.edu/Arablinks.html)。

2 方法

2.1丹參酮合成候選CYP450基因的篩選及克隆

基于丹參基因組注釋信息，篩選出基因組上注釋到的CYP450，統(tǒng)計其在周皮、韌皮部和木質(zhì)部中的差異表達(dá)結(jié)果，以log2 ratio≥1(絕對值)、FPKM>10為標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選候選的CYP450。分別取丹參根的3個組織(周皮、韌皮部和木質(zhì)部)以及丹參不同器官(根、莖、葉、花)為材料，采用QIAGEN RNeasy Plus Mini Kit(Cat.74134)試劑盒提取丹參根總RNA，PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Cat.6210A)試劑盒合成一鏈cDNA。不同組織的RNA樣品混合作為模板用Takara Ex Taq DNA 聚合酶對候選CYP450基因進(jìn)行克隆，引物(5′F-CGCATGCAAGTTTACATTCTTCTC/3′RTTAAAGCTTGATAGGAATAGCCC)；反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃充分延伸10 min，10 ℃保溫，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收后連接PMD-18T載體測序。

2.2候選SmCYP450基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將下載的擬南芥CYP450s、已驗證功能的丹參SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1、與本研究篩選的CYP450的氨基酸序列進(jìn)行比對，采用MEGA6 軟件構(gòu)建NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap 選擇重復(fù)1000次[26]。

2.3候選CYP450基因在丹參不同組織器官的表達(dá)分析

采用Primer Premier 6 軟件進(jìn)行qPCR引物設(shè)計原則如下：PCR 擴(kuò)增子區(qū)域在100～180 bp；Tm 值在60 ℃左右；GC含量在45%～55%。將擴(kuò)增子區(qū)的序列BLAST 比對到基因組序列，選擇特異性高的區(qū)段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。2%瓊脂糖凝膠檢測PCR 擴(kuò)增子大小、引物特異性以及引物二聚體。qPCR引物序列如下(5′F-GCTTGCTCTCCACCAACTC，3′R-GGCTTCTCCGACGTTCATG)。實時定量PCR采用ABI 7500 real-time PCR檢測系統(tǒng)，參照Takara公司的SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)qPCR試劑(Cat.RR820A)使用說明，選擇丹參看家基因SmActin作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系：7.5 μL SYBR Premix Ex Taq II(2×)、1.2 μL Primers (F/R) (10 μmol·L-1)、0.3 μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×)、2 μL DNA samples、4 μL RNase-free ddH2O，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；40 循環(huán)：變性95 ℃ 5 s，退火和延伸60 ℃ 34 s；溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s；每組反應(yīng)設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達(dá)；采用IBM SPSS 20軟件的一步法ANOVA 分析多樣品間的差異性，P<0.05、P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Pearson’s correction test檢測基因共表達(dá)。

2.4候選CYP450基因結(jié)構(gòu)分析

基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測采用ExPASy Proteomics Server 提供的在線工具Protparam(http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html)；Predictprotein在線預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)(https：//www.predictprotein.org)；PFAM預(yù)測CYP450保守結(jié)構(gòu)域(http：//pfam.xfam.org/search/batch)。

3 結(jié)果

3.1丹參酮合成候選SmCYP76AK5編碼基因的篩選及克隆

丹參基因組共注釋到457個CYP450s，根周皮RNA-seq分析顯示21% (96/457)的CYP450s 表達(dá)水平FPKM > 10[12]，本研究篩選出1個與丹參SmCPS1、SmKSL1和SmCYP76AH1共表達(dá)(周皮>韌皮部>木質(zhì)部；log2 ratio≥1；FPKM>10)的CYP450，篩選出的CYP450命名為SmCYP76AK5。比對丹參基因組發(fā)現(xiàn)SmCYP76AK5定位在Scaffold12483，基因長度為1503 bp，編碼500個氨基酸，由兩個外顯子組成。根據(jù)基因組注釋結(jié)果設(shè)計SmCYP76AK5全長序列的引物進(jìn)行體外克隆，測序結(jié)果顯示獲得長度為1503 bp的編碼基因，與基因組注釋完全一致，基因序列上傳美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)，GenBank登錄號KY807047。

3.2候選SmCYP76AK5的系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究下載來自擬南芥的9個clan的273條CYP450序列，分別為CYP71 clan、CYP72 clan、CYP97 clan、CYP86 clan、CYP85 clan、CYP74 clan、CYP51 clan、CYP711 clan、CYP710 clan，從中篩選出75條擬南芥的CYP450序列與丹參中已被研究的SmCYP76AK1、SmCYP76AH1、SmCYP76AH3以及丹參篩選到的SmCYP76AK5氨基酸序列進(jìn)行比對后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示SmCYP76AK5與SmCYP76AK1、SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、AtCYP76C1、AtCYP76G1聚為一大枝，屬于CYP71clan，與SmCYP76AK1聚在同一小枝屬于CYP76AK亞家族，如圖1所示。同源性比對分析顯示SmCYP76AK5與SmCYP76AK1、SmCYP76AH1、SmCYP76AH3的氨基酸序列同源性分別為69%、48%、48%。

圖1 SmCYP76AK5與丹參CYP450s、擬南芥CYP450s的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系圖

3.3SmCYP76AK5基因的差異表達(dá)研究

本研究對篩選的SmCYP76AK5在丹參根的3個組織(周皮、韌皮部和木質(zhì)部)以及丹參不同器官(根、莖、葉、花)中的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，表達(dá)量由高到低依次為根周皮、根韌皮部、根、根木質(zhì)部、莖、葉、花。根周皮的表達(dá)量(FPKM)是韌皮部的6.5倍。在葉和花器官中沒有檢測到SmCYP76AK5的表達(dá)，但在根部其表達(dá)量明顯升高，這與丹參以根或根莖入藥相符，見圖2A。

根據(jù)克隆結(jié)果設(shè)計qPCR引物，提取丹參根的3個組織(周皮、韌皮部和木質(zhì)部)以及丹參不同器官(根、莖、葉、花)的RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，利用設(shè)計的qPCR引物進(jìn)行qPCR分析，其結(jié)果顯示SmCYP76AK5的表達(dá)量由高到低依次為周皮、韌皮部、根、木質(zhì)部、葉、莖、花，與丹參轉(zhuǎn)錄組表達(dá)趨勢基本一致，并且與SmCPS1、SmKSL1呈共表達(dá)，見圖2B。

注：A.SmCYP76AK5在不同組織器官的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異(FPKM)；B.SmCYP76AK5在不同組織器官的qPCR表達(dá)分析； **P<0.01。圖2 SmCYP76AK5基因在不同組織器官的表達(dá)模式

3.4SmCYP76AK5基因的結(jié)構(gòu)特征

SmCYP76AK5基因編碼500個氨基酸，利用ExPASy Proteomics Server的在線軟件Protparam對SmCYP76AK5氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，推測該蛋白的分子式為C2536H4006N700O705S26，分子量是56.4 kD，等電點PI 8.48，帶正電殘基(Arg+Lys)為57，負(fù)電殘基(Asp+Glu)為53，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為49.80，脂肪系數(shù)為93.04，親水性系數(shù)為-0.151。二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果表明SmCYP76AK5蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占50.00%，β-折疊占8.80%，無規(guī)卷曲占41.2%。PFAM預(yù)測SmCYP76AK5的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該基因編碼的蛋白在32-491位點具有CYP450保守結(jié)構(gòu)域(PF00067.20)。

4 討論

丹參酮作為二萜類化合物，其骨架次丹參酮二烯和鐵銹醇的合成已被解析[9]，然而到丹參酮的最終合成仍需一系列酶的氧化作用，如氧化酶、脫氫酶等。本研究通過對于丹參基因組以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的分析，驗證Xu等對丹參酮合成相關(guān)CYP450的鑒定結(jié)果，進(jìn)一步篩選并克隆丹參酮生物合成下游途徑的候選基因，為丹參酮生源途徑的解析提供參考。

CYP450在修飾萜類骨架產(chǎn)生多種多樣萜類化合物中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些含血紅素的酶通常將氧原子插入C-H鍵中，使之成為能夠被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的羥基。Boutanaev等報道在真核植物中，參與萜類化合物多樣性的CYP450家族成員多屬于CYP71 clan[27]。在丹參中，已鑒定SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1催化次丹參酮二烯合成鐵銹醇、羥基化鐵銹醇、柳杉酚、羥基化柳杉酚等丹參酮中間產(chǎn)物[16-17]，均歸類于CYP71 clan的CYP76亞家族。本研究首次克隆丹參SmCYP76AK5編碼基因，與擬南芥CYP450的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示其同屬于CYP71 clan的CYP76亞家族。

Xu等證實丹參根周皮是丹參酮合成和積累的主要部位，丹參酮生物合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)在根及根周皮中顯著高表達(dá)[12]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組和qPCR揭示SmCYP76AK5編碼基因與丹參酮合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)模式相一致，與丹參酮在丹參不同組織器官中的含量呈正相關(guān)?；诖耍狙芯刻岢鯯mCYP76AK5催化丹參酮合成的學(xué)術(shù)假設(shè)。

SmCYP76AK5的功能機(jī)理仍需要進(jìn)一步通過體外酶促反應(yīng)和體內(nèi)RNAi或過表達(dá)研究來證實，本研究為丹參酮合成途徑修飾酶編碼基因的篩選提供參考，為丹參酮生物合成途徑的解析奠定基礎(chǔ)。

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CloningandBioinformaticAnalysisofCYP76AK5RelatedtoTanshinoneBiosynthesisinSalviamiltiorrhiza

PU Xiangdong1，WANG Lizhi1*

(School of Chinese Meteria Medica，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China)

Objective：The candidate CYP450 gene related to tanshinone biosynthesis was selected and cloned based on genome-wide strategy inSalviamiltiorrhiza.Methods：The specific primers were designed to clone theSmCYP76AK5 gene.The phylogenetic tree was constructed by MEGA software.The different expression ofSmCYP76AK5 in periderm，phloem，xylem，root，stem，leaf and flower was detected by real-time quantitative PCR.The physical and chemical properties，secondary structure，conserved domain were analyzed by a series of bioinformatic tools.Results：The phylogenetic analysis showed that SmCYP76AK5 belongs to CYP71clan.The expression ofSmCYP76AK5 was the highest in periderm，in accordance with the synthesis and accumulation of tanshinone.Conclusion：SmCYP76AK5 was predicted to be involved in tanshinone production inS.miltiorrhiza.

Salviamiltiorrhiza；tanshinone；biosynthesis；SmCYP76AK5；different expression

國家自然科學(xué)基金項目(81603221)；天津市自然科學(xué)基金項目(16JCQNJC09700)；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計劃項目(20120202/20140209)；天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201610063003)

] 王麗芝，講師，研究方向：藥用植物分子生物學(xué)；Email：Lzhwang_2009@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.011

2017-03-28)

*[