王語欣 楊冬琴 周靜東 林江 姚東明 楊靜 錢震 楊磊 錢軍★

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)急性髓系白血病miR?125b的表達(dá)及臨床應(yīng)用

王語欣1楊冬琴1周靜東1林江2姚東明2楊靜1錢震1楊磊1錢軍1★

目的采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real?time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）法檢測(cè)急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中微小 RNA?125b（microRNA?125b，miR?125b）轉(zhuǎn)錄本含量，初步評(píng)價(jià)其在AML臨床診斷中的意義。方法建立擴(kuò)增miR?125b轉(zhuǎn)錄本的SYBR Green I染料法qPCR，對(duì)miR?125b轉(zhuǎn)錄本克隆質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)其在AML診斷中的特異性、重復(fù)性和靈敏性。并對(duì)69例AML患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行初步檢測(cè)并評(píng)價(jià)其臨床相關(guān)性。結(jié)果該方法能定量檢測(cè)骨髓標(biāo)本中miR?125b的表達(dá)水平，熔解曲線呈單峰，在108～103copies/μL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（R2=0.999）并且檢測(cè)重復(fù)性良好。結(jié)果顯示69例AML患者中miR?125b表達(dá)水平明顯高于25例對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。在初發(fā)AML的不同亞型中，M3型的miR?125b表達(dá)水平高于其他亞型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR?125b表達(dá)水平與非M3型AML患者的年齡、性別、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、FAB分型、核型分組之間均無相關(guān)性（P＞0.05）。4例初診AML患者在獲得完全緩解后miR?125b表達(dá)水平均較治療前有所降低。結(jié)論所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法能敏感、特異地檢測(cè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本中miR?125b的表達(dá)水平，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。miR?125b異常高表達(dá)是AML中的一個(gè)常見分子事件，檢測(cè)其表達(dá)可能有助于AML患者的輔助診斷和疾病狀態(tài)監(jiān)測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR；miR?125b；急性髓系白血病

急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）是起源于髓系祖細(xì)胞的一類造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病。其表現(xiàn)為白細(xì)胞在骨髓等造血組織中大量增殖，使正常造血功能混亂，導(dǎo)致兇險(xiǎn)的感染、出血、器官浸潤(rùn)等，嚴(yán)重危害人類生命健康。微小RNA（microRNA，miRNA）廣泛存在于從線蟲到人類的多種真核生物中，近年來因發(fā)現(xiàn)其參與多種重要生物學(xué)過程如調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞代謝、增殖、分化和凋亡等而備受關(guān)注［1?2］。miR?125b 是miR?125家族成員之一，大量研究表明miR?125b功能多樣，在實(shí)體腫瘤中既可起抑癌基因的作用，也可以起促癌基因的作用［3?5］，miR?125b 在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表達(dá)異常，在白血病的發(fā)生和發(fā)展中起到十分重要的作用。比如miR?125b在伴有染色體異常的骨髓異常增生綜合癥、AML和急性淋巴細(xì)胞性白血病中異常高表達(dá)［6?8］；miR?125b可通過抑制多種靶基因加速誘導(dǎo)AML發(fā)生、發(fā)展等［9］。因此，研究結(jié)果提示miR?125b與白血病發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切，具有非常重要的臨床意義和應(yīng)用前景。而尋找一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便且成本低廉的檢測(cè)方法是目前miR?125b應(yīng)用于臨床研究亟需解決的問題。本研究采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real?time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技術(shù)檢測(cè) miR?125b在 AML患者骨髓標(biāo)本中的表達(dá)水平，初步探討miR?125b在AML臨床診斷和預(yù)后判斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

69例AML患者均來自江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院接受住院治療的初診病例，所有患者診斷分型按照法、美、英分型系統(tǒng)（French?American?British classification systems，F(xiàn)AB）和 WHO 2008版標(biāo)準(zhǔn)［10?11］；其中 AML 正常核型 24 例、AML 伴t（8；21）6例、AML伴t（15；17）14例、AML伴+8染色體異常3例、AML伴?5/5q?染色體異常1例、AML伴復(fù)雜核型9例、其他核型類型9例、無資料3例。FAB分型中M1型5例、M2型27例、M3型14例、M4型15例、M5型8例。對(duì)照組25例為非惡性血液病患者（缺鐵性貧血及免疫性血小板減少性紫癜）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononucle?ar cells，BMMNCs）的分離、RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

全部患者均于初診時(shí)抽取骨髓10 mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度離心法分離BMMNCs，應(yīng)用mirVana miRNA試劑盒提取總RNA（Ambion，美國(guó)），經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｄ孓D(zhuǎn)錄總體系共20μL，含蒸餾水 14μL、緩沖液 4μL、RNA 1μL、逆轉(zhuǎn)錄酶 1μL（MiScript Reverse Transcription Kit，Qiagen公司，catalog no.218061）。反應(yīng)條件為：① 37℃1 h，②95℃5min，隨后4℃保持。

1.2.2 qPCR

引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5.0軟件，miR?125b 引物序列上游為 5′?CCCTGAGACCCTA?ACTTGTG?3′，下游引物為miRNA通用下游引物。U6作為內(nèi)參管家基因，其上游引物為5′?GT?GCTCCCTGCTTCGGCAGCACATATAC?3′，下游引物為 5′?AAAAATATGGAACGCTTCACGAAT TTG?3′，引物由上海華大基因科技有限公司合成。反應(yīng)在ABI 7500擴(kuò)增儀（ABI，美國(guó)）上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性15min，94℃變性15 s、55℃退火30 s、70℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，熔解曲線程序?yàn)?95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s、60℃ 15 s。選取miR?125b與U6表達(dá)ΔCT值最小的1例對(duì)照標(biāo)本作為對(duì)照。miR?125b表達(dá)采用如下公式：NmiR ?125b=（EmiR ?125b）△ CTmiR ?125b（control?sample）÷（EU6）△CTU6（control?sample），PCR 擴(kuò)增效率 E=10（?1/slope）；ΔCT指對(duì)照與標(biāo)本之間miR?125b和U6循環(huán)閾值（CT）值的差異。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

重組miR?125b質(zhì)粒作為陽性模板：用凝膠回收試劑盒（Axygen，美國(guó)）將擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收，miR?125b全序列與pMD?19?T克隆載體（Takara，日本）連接過夜重組載體，隨后重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，通過質(zhì)粒DNA小量試劑盒（Axygen，美國(guó)）提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定（上海華大基因科技有限公司）；從108copies/μL開始進(jìn)行10倍稀釋，建立陽性模板梯度，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增檢測(cè)。擴(kuò)增后根據(jù)擴(kuò)增曲線設(shè)定統(tǒng)一閾值，然后根據(jù)其濃度及各濃度對(duì)應(yīng)的Ct平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分類變量之間的差異統(tǒng)計(jì)采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；連續(xù)性變量之間的差異統(tǒng)計(jì)使用Kruskal?Wallis（多組間比較）或Mann?WhitneyU檢驗(yàn)（兩組間比較）。miR?125b表達(dá)在AML中的診斷價(jià)值采用接收者操作特征曲線（receiver operating charac?teristic，ROC）及曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）進(jìn)行評(píng)價(jià)；所有分析均設(shè)定P值為雙側(cè)分布，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qPCR法的靈敏度、重復(fù)性、特異性和擴(kuò)增效率

檢測(cè)miR?125b陽性模板的擴(kuò)增曲線S型（圖1）。解離曲線分析顯示擴(kuò)增產(chǎn)物為單一熔解峰。在 108～103copies/μL 的范圍內(nèi) Ct值和不同濃度miR?125b質(zhì)粒呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)度（R2）為 0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（slope）為-3.422。制作成標(biāo)準(zhǔn)曲，重復(fù)性良好（圖1）。同樣，U6質(zhì)粒陽性模板標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)性良好，R2=0.998，slope=-3.298。對(duì)不同濃度miR?125b質(zhì)粒和U6質(zhì)粒分別擴(kuò)增6次，在108～103copies/μL的范圍內(nèi)重復(fù)性良好（表1）。

圖1 不同濃度miR?125b重組質(zhì)粒qPCR熒光擴(kuò)增結(jié)果及其標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Fluorescence amplification and standard curve of recombinant miR?125b plasmid in different concentrations

表1 不同濃度miR?125b和U6基因擴(kuò)增6次的變異系數(shù)Table l Coefficient of variation of amplification of 6 times on different concentrations of miR?125b andU6genes

2.2 qPCR法檢測(cè)AML患者中miR?125b的表達(dá)情況

25例對(duì)照組和69例AML患者標(biāo)本均可見擴(kuò)增曲線，但表達(dá)程度不同（圖2）。25例對(duì)照的NmiR?125b為0.03%～100%（中位0.68%），AML患者標(biāo)本的 NmiR?125b為 0.03%～6983.49%（中位 5.12%）。與對(duì)照組相比，AML患者miR?125b表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上調(diào)（P=0.001）。進(jìn)一步分析miR?125b在FAB分型中不同亞型的表達(dá)水平差異，發(fā)現(xiàn)miR?125b在各個(gè)亞型中的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，而其中miR?125b在M3型中表達(dá)水平最高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖2 部分AML患者及對(duì)照組骨髓標(biāo)本中miR?125b熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Figure 2 PCR amplification curve of miR?125b in part of bone marrow of AML patients and controls

2.3 miR?125b表達(dá)的鑒別診斷意義

應(yīng)用ROC曲線評(píng)估m(xù)iR?125b可否作為AML患者輔助診斷的一個(gè)潛在標(biāo)記。結(jié)果顯示miR?125b表達(dá)水平可作為鑒別對(duì)照組與研究組的參考標(biāo)志（AUC=0.723，95%置信區(qū)間為0.619～0.827，P=0.001）。在 miR?125b 表達(dá)水平為 4.7%時(shí)，診斷AML的敏感性和特異性分別為53%和92%（圖4）。

圖4 miR?125b表達(dá)水平輔助診斷AML的ROC曲線Figure 4 ROC curve analysis through using miR?125b for discriminating AML patients

2.4 miR?125b的表達(dá)與臨床參數(shù)相關(guān)性

本研究以ROC曲線cut?off值為界將總體AML患者分為miR?125b低表達(dá)組與高表達(dá)組。miR?125b高表達(dá)組與低表達(dá)組的性別、年齡、血小板計(jì)數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而miR?125b高表達(dá)組的患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白量與原始細(xì)胞計(jì)數(shù)低于miR?125b低表達(dá)組（P＜0.05）。miR?125b高、低表達(dá)組間的FAB分型、不同核型以及染色體危險(xiǎn)程度分型比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，在M1?M5不同亞型中，M3亞型中miR?125b高表達(dá)的頻率顯著高于其他亞型分組［93%（13/14）與44%（24/55），P＜0.001］。在非M3型AML患者中，結(jié)果顯示miR?125b基因的表達(dá)水平與年齡、性別、血紅蛋白量、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、染色體分組等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 總AML患者與非M3AML患者中miR?125b表達(dá)水平與臨床資料分析Table 2 Comparison of clinical characteristics of miR?125b expression between whole AML and non?M3 patients

2.5 miR?125b表達(dá)在AML隨訪中的意義

對(duì)miR?125b表達(dá)水平較高的4例初診AML患者的骨髓標(biāo)本進(jìn)行治療前后的檢測(cè)，結(jié)果顯示，患者病情獲得完全緩解后的miR?125b表達(dá)水平較治療前均明顯下降（圖5）。

圖5 4例AML患者治療前后miR?125b表達(dá)的變化Figure 5 The levels of miR?125b expression of 4 patients in the AML patients before and after complete remission

3 討論

miRNAs轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)功能影響著機(jī)體各種重要的生理和病理活動(dòng)過程，其表達(dá)變化通常與各種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究報(bào)道m(xù)iR?125b參與白血病的發(fā)生發(fā)展，在伴有染色體異常和基因突變的AML中表達(dá)增高且其表達(dá)水平與疾病狀態(tài)有關(guān)［12?13］。這些重要研究提示miR?125b可能有助于今后AML的診斷與病情監(jiān)測(cè)。

要將miRNAs作為疾病診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，需要建立標(biāo)準(zhǔn)而規(guī)范的提取方法和檢測(cè)方法。隨著miRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性被逐漸重視，miRNAs的檢測(cè)技術(shù)也取得了快速發(fā)展，主要包括有傳統(tǒng)的表達(dá)文庫克隆、Northern blot和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription PCR，RT?PCR），還包括基因芯片技術(shù)、高通量測(cè)序等新型技術(shù)。其中RT?PCR以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速便捷、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是目前定量檢測(cè)miRNAs的金標(biāo)準(zhǔn)［14?15］。本研究運(yùn)用 SYBR Green I染料標(biāo)記技術(shù)建立的一種qPCR方法對(duì)骨髓標(biāo)本中miR?125b進(jìn)行定量檢測(cè)。該方法無需設(shè)計(jì)探針，引物設(shè)計(jì)相對(duì)容易，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，適用于推廣應(yīng)用［16］。本研究結(jié)果表明SYBR Green I qPCR檢測(cè)miR?125b方法具有良好的特異性、重復(fù)性和靈敏性。本文采用相對(duì)定量法，可用于檢測(cè)骨髓標(biāo)本中miR?125b的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)分析顯示，69例AML患者中miR?125b表達(dá)水平高于對(duì)照組（P=0.001）。同時(shí)在AML不同亞型中miR?125b表達(dá)水平存在差異，其中M3型miR?125b表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他亞型，提示miR?125b異常高表達(dá)與急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）密切相關(guān)。這與 Zhang［17?18］、Li等［19］的研究結(jié)果一致。有報(bào)道稱，miR?125b可以干擾人類CD34+細(xì)胞分化，抑制白血病細(xì)胞NB4和HL60向末端（粒系和單核系）分化，揭示了miR?125b在APL抑制分化功能［6］。在非M3型AML患者中，miR?125b高低表達(dá)組與AML亞型、血液學(xué)參數(shù)和完全緩解率均無相關(guān)性（P＞0.05）。ROC曲線分析表明miR?125b表達(dá)對(duì)于AML具有中等診斷價(jià)值。

同時(shí)，我們對(duì)4例AML患者進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)緩解后miR?125b表達(dá)水平較治療前明顯下降，提示miR?125b表達(dá)可能作為一個(gè)分子標(biāo)志用于疾病狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。但同時(shí)本研究病例數(shù)較少，ROC曲線分析顯示敏感性和特異性不高，因此用miR?125b診斷、鑒別診斷及評(píng)價(jià)疾病的預(yù)后仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究建立的SYBR Green I qPCR檢測(cè)miR?125b是一種簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確、快速的高通量定量檢測(cè)方法，易于臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用，有助于大樣本的臨床研究。miR?125b異常高表達(dá)是AML中的一個(gè)常見分子事件，檢測(cè)其表達(dá)可能有助于AML患者的輔助診斷和疾病狀態(tài)監(jiān)測(cè)。

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Detection and clinical application of miR?125b in acute myeloid leukemia by real?time fluorescence quantitative PCR

WANG Yuxin1，YANG Dongqin1，ZHOU Jingdong1，LIN Jiang2，YAO Dongming2，YANG Jing1，QIAN Zhen1，YANG Lei1，QIAN Jun1★
（1.Department of Hematology，Affiliated People's Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu，China，212002；2.Laboratory Center，Affiliated People's Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu，China，212002）

ObjectiveTo evaluate the method of real?time quantitative polymerase chain reaction(qPCR)for detecting miR?125b transcript in patients with acute myeloid leukemia(AML)and further investigate the characteristics and clinical implication of miR?125b in AML.MethodsThe reaction system and reaction condition of qPCR with SYBR Green I was established to detect the expression of miR?125b to evaluate its specificity,repeatability and sensitivity in AML diagnosis.Afterwards,the samples of bone marrow mononuclear cells from 69 AML patients were evaluated.ResultsThe method can detect the expressionlevel of miR?125b in AML patients.The melting curve showed a single peak,the PCR products was specific,a good linear relationship in the range of 108copies/μL to 103copies/μL(R2=0.999),and the detection was repeatable.The expression level of miR?125b in 69 AML patients was significantly higher than those in 25 controls(P=0.001).In different subtypes of AML,the expression level of miR?125b in M3 was higher than that in other subtypes,and the difference was statistically significant(P＜0.05).There was no correlation between the expression ofmiR?125b and the age,gender,peripheralblood leucocytecounts,plateletcount,hemoglobincontent,FAB classifications and karyotypes(P＞0.05)in non?M3 AML patients.The levels of miR?125b expression of 4 patients in the observation group decreased after complete remission.ConclusionsThe SYBR Green I qPCR for miR?125b was a sensitive,reliable quantitative assay,and it can be used in the diagnosis of AML and the disease therapy evaluation.The increased?expression of miR?125b may be a common molecular event in AML,and detecting its expression level could be used for auxiliary diagnosis and monitoring disease.

Real?time quantitative PCR;miR?125b;Acute myeloid leukemia

作者單位：1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇，鎮(zhèn)江212002
2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇，鎮(zhèn)江212002

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（81270630）；江蘇省六大人才峰會(huì)項(xiàng)目（2015?WSN?115）；鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（SH2015058）；江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展基金會(huì)項(xiàng)目(JLY20140018)

★通訊作者：錢軍，E?mail：qianjun0007@hotmail.com