孫莉 楊琳艷 葉倩平 楊旭 楊學(xué)習(xí)

基于三引物熒光PCR?毛細(xì)管電泳法的FMR1基因突變檢測(cè)技術(shù)建立及其在自閉癥輔助診斷中的應(yīng)用

孫莉1楊琳艷2葉倩平2楊旭3楊學(xué)習(xí)4★

目的對(duì)自閉癥患者FMR1基因5′非編碼區(qū)CGG重復(fù)序列及重復(fù)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，探索檢測(cè)脆性X綜合征的新方法。方法應(yīng)用三引物熒光PCR?毛細(xì)管電泳法（Qseq100TM全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)檢測(cè)）對(duì)111例自閉癥患者進(jìn)行篩查，檢測(cè)其FMR1基因5′非編碼區(qū)CGG序列，計(jì)算CGG重復(fù)數(shù)，并與ABI 3500Dx基因分析儀毛細(xì)管電泳測(cè)序法進(jìn)行結(jié)果比較驗(yàn)證。結(jié)果111例臨床檢測(cè)為自閉癥的樣本中，有2例為FMR1前突變攜帶者，一例為中間型。與3500Dx毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果一致。結(jié)論三引物熒光PCR?毛細(xì)管電泳法能夠用來檢測(cè)FMR1基因5′非編碼區(qū)CGG重復(fù)序列，在脆性X綜合征發(fā)病機(jī)制及大規(guī)模攜帶者篩查方面都具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

自閉癥；FMR1基因；脆性X綜合征；三引物熒光PCR?毛細(xì)管電泳

作者單位：1.華北石油管理局總醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北，任丘062552
2.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665
3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東，深圳518110
4.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515

脆性X綜合征是X連鎖不完全顯性遺傳?。??2］，是最常見的遺傳性智力障礙類型之一。其致病基因?yàn)镕MR1（fragile X mental retardation 1），位于X染色體上的Xq27.3［3］，該病主要是由于FMR1基因5′非編碼區(qū)的CGG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變導(dǎo)致。根據(jù)CGG重復(fù)數(shù)不同可以分為4種類型：全突變（＞200個(gè) CGG重復(fù)），前突變（55～200個(gè)CGG重復(fù)），中間型突變（45～54個(gè)CGG重復(fù)）和正常型（＜45個(gè)CGG重復(fù)）［4］。CGG重復(fù)數(shù)在親代向子代傳遞時(shí)可發(fā)生動(dòng)態(tài)突變，由前突變擴(kuò)展為全突變，導(dǎo)致相應(yīng)基因組區(qū)域高甲基化而阻止mRNA合成，其產(chǎn)物智力低下蛋白合成被阻斷，該蛋白對(duì)胎兒神經(jīng)發(fā)育和結(jié)締組織形成非常重要，缺乏該蛋白的全突變患者會(huì)發(fā)病。約有20%的前突變型脆性X綜合征女性攜帶者晚期易發(fā)生“脆性X原發(fā)性卵巢功能不全”，而部分前突變型脆性X綜合征男性攜帶者在其老年時(shí)期易發(fā)生“脆性X相關(guān)震顫?共濟(jì)失調(diào)綜合征，前突變攜帶者的另一個(gè)亞表型是自閉癥譜系疾病?學(xué)習(xí)困難［5］。女性前突變攜帶者中約15%～30%是自閉癥患者，而男性自閉癥患者中僅約6%患有脆性X綜合征［6］。有上述3個(gè)亞表型之一者即可作為FMR1基因前突變攜帶者的候選篩查人群。脆性X綜合征發(fā)病率為女性 1/2 500，男性 1/1 250［7］。在我國(guó)智力低下患者中發(fā)病率約 6.3%［8］。

脆性X綜合征臨床表現(xiàn)程度各異、復(fù)雜多樣。其主要特征為中度至重度智力低下，且隨著年齡增加病情有加重的趨勢(shì)。其他臨床表現(xiàn)為特殊面容，如長(zhǎng)臉，招風(fēng)耳，青春期以后出現(xiàn)大睪丸，許多患者還表現(xiàn)為沖動(dòng)、多動(dòng)、焦慮、恐懼社交、語言呆板等孤獨(dú)癥行為［9］。目前，大部分脆性X綜合征患者尚未得到診斷。脆性X綜合征嚴(yán)重危害兒童生長(zhǎng)發(fā)育，早發(fā)現(xiàn)、早治療、早干預(yù)能顯著改善患兒預(yù)后，且可通過提供產(chǎn)前遺傳咨詢，避免家族中再次出現(xiàn)同樣的患者。如何建立一個(gè)快速、經(jīng)濟(jì)、有效的方法進(jìn)行前突變和全突變篩查，產(chǎn)前診斷是預(yù)防、輔助診斷和遺傳阻斷的基礎(chǔ)。

脆性X綜合征得以確診需要從基因水平進(jìn)行檢測(cè)，目前關(guān)于脆性X綜合征的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括基因組DNA特異性酶切、熒光探針法、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation depen?dent probe amplification，MLPA）、Southern blot法等，這些技術(shù)存在操作難度高、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)或成本高等不足。本研究擬采用三引物熒光PCR?毛細(xì)管電泳法進(jìn)行FMR1基因CGG重復(fù)的檢測(cè)，探索適合于檢測(cè)脆性X綜合征的快捷有效的方法。

1 材料和方法

1.1 對(duì)象

實(shí)驗(yàn)所用的全血樣本共111例，是由南方醫(yī)院于2016年9月份在廣州地區(qū)收集的自閉癥患者樣本。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取

采用核酸提取或純化試劑（廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司）提取樣本基因組DNA，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，提取完成后，用熒光定量法（Qubit?3.0熒光定量?jī)x，Life Technologies，美國(guó)）進(jìn)行定量，以檢測(cè)DNA濃度，提取的DNA于-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

該方法選取人基因組中編碼脆性X綜合征FMR1基因的5′端非翻譯區(qū)（CGG）n重復(fù)序列為擴(kuò)增靶區(qū)域，針對(duì)（CGG）n重復(fù)序列區(qū)段設(shè)計(jì)3條特異性引物。CGG重復(fù)序列的兩端設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增目標(biāo)片段（含CGG重復(fù)區(qū)）的引物F、R，正向引物F序列為：5′?GCTCAGCTCCGTTTCG?GTTTCACTTCCGGT?3′，5′端帶FAM熒光；反向引物R序列為：5′?AGCCCCGCACTTCCACCAC?CAGCTCCTCCA?3′；在CGG重復(fù)區(qū)域設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增CGG重復(fù)序列的引物M。M的序列為：5′?AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCCGCCGCC?GCCG?3′。

1.2.3 熒光PCR?毛細(xì)管電泳及3500Dx毛細(xì)管電泳測(cè)序

熒光PCR反應(yīng)體系①：對(duì)照樣本和受檢樣本的PCR反應(yīng)體系的體積均為20μL，其中含有80 ng的模板 DNA，10μL 的 2×GC BufferⅠ（TaKa?Ra，日本），0.4μL 的 dNTPs（10 mmol/L）（TaKaRa，日本），5.2μL的PCR增強(qiáng)劑，0.3μL的上游引物F（10 μmol/L），0.3μL 的下游引物 R（10 μmol/L），0.3μL的DNA聚合酶（5 U/μL），無核酸酶水補(bǔ)足至20μL。熒光PCR反應(yīng)體系②：對(duì)照樣本和受檢樣本的PCR反應(yīng)體系的體積均為20μL，其中含有 80 ng的模板 DNA，10μL 的 2×GC BufferⅠ（TaKaRa，日本），0.4μL 的 dNTPs（10 mmol/L）（TaKaRa，日本），5.2μL的PCR增強(qiáng)劑，0.3μL的上游引物 F（10 μmol/L），0.3μL 的下游引物 M（10 μmol/L），0.3μL 的DNA聚合酶（5 U/μL），無核酸酶水補(bǔ)足至20μL。震蕩混勻，瞬時(shí)離心后轉(zhuǎn)入PCR擴(kuò)增儀中，PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性10min后，進(jìn)行30個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)：97℃ 35 s，62℃35 s，68℃ 4min；最后68℃ 終延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取1μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加無核酸酶水稀釋10倍后，采用Qseq100TM全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)；同時(shí)取1μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，加 8.5μL Hi?Di? Formamide和 0.5μL GeneScan 600 LIZ?size standard，混勻后 98℃變性5min，立即放冰上2min，上ABI 3500Dx儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序檢測(cè)。通過3500Dx毛細(xì)管電泳測(cè)序法，觀察結(jié)果圖中連續(xù)峰中間的小凹陷還能發(fā)現(xiàn)AGG插入數(shù)。

1.2.4 樣本CGG重復(fù)數(shù)的計(jì)算

根據(jù)正常男性對(duì)照樣本的CGG重復(fù)數(shù)，采用數(shù)學(xué)模型獲得受檢者CGG重復(fù)數(shù)及AGG插入信息。

2 結(jié)果

對(duì)111例樣本和一例正常男性對(duì)照樣本采用Qseq100TM全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，分析其檢測(cè)結(jié)果（圖1），所有樣本CGG重復(fù)數(shù)范圍為21～62。絕大部分樣本屬于正常型（＜45個(gè)CGG 重復(fù)），其中D1609187、D1609192、D1609168共3例樣本的CGG重復(fù)數(shù)大于45。

圖1 111例樣本檢測(cè)結(jié)果圖Figure1 Test result of 111 samples

臨床檢測(cè)正常男性樣本，Qseq100毛細(xì)管電泳檢測(cè)其擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為420 bp（圖2），計(jì)算得出其CGG重復(fù)數(shù)為30，并且和Qseq100毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果一致的是：3500Dx毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果顯示（圖3A）在420 bp處有檢測(cè)峰，并且觀察該樣本的X染色體上連續(xù)峰中間有2處小凹陷（圖3B），說明CGG重復(fù)序列中插入了2個(gè)AGG。111例自閉癥患者中樣本D1609187，Qseq100毛細(xì)管電泳檢測(cè)其2條X染色體上擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度分別為430 bp和516 bp（圖2B），計(jì)算其CGG重復(fù)數(shù)分別為33和62，判斷為雜合型前突變攜帶者，3500Dx毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果顯示（圖3C）在430 bp和516 bp處有檢測(cè)峰，這和Qseq100毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果一致，并且觀察該樣本中一條X染色體上連續(xù)峰中間有2處小凹陷（圖3D），說明該染色體CGG重復(fù)序列中插入了2個(gè)AGG，而另一條X染色體上連續(xù)峰中間并沒有凹陷，說明該X染色體CGG重復(fù)序列中沒有AGG插入；Qseq100毛細(xì)管電泳檢測(cè)樣本D1609192 2條X染色體擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度分別為434 bp和508 bp（圖2C），計(jì)算其CGG重復(fù)數(shù)分別為34和59，判斷為雜合型前突變攜帶者，3500Dx毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果顯示（圖3E）在434 bp和508 bp處有檢測(cè)峰，這和Qseq100毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果一致，并且觀察該樣本中一條X染色體上連續(xù)峰中間有2處小凹陷（圖3F），說明該染色體CGG重復(fù)序列中插入了2個(gè)AGG，而另一條X染色體上連續(xù)峰中間并沒有凹陷，說明該X染色體CGG重復(fù)序列中沒有AGG插入；Qseq100毛細(xì)管電泳檢測(cè)樣本D1609168的X染色體擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為486 bp（圖2D，計(jì)算其CGG重復(fù)數(shù)為52，判斷為中間型，3500Dx毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果顯示（圖3G）在486 bp有檢測(cè)峰，這和Qseq100毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果一致，并且觀察該樣本的X染色體上連續(xù)峰中間有一處小凹陷（圖3H），說明CGG重復(fù)序列中插入了一個(gè)AGG。

圖2 Qseq100毛細(xì)管電泳結(jié)果圖Figure 2 The results of Qseq100 capillary electrophoresis

圖3 3500Dx毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果圖Figure 3 3500Dx capillary electrophoresis sequencing results

3 討論

脆性X綜合征常表現(xiàn)出自閉癥樣癥狀，如社交恐懼、語言呆板甚至言語交流障礙。而且脆性X綜合征是自閉癥譜系障礙最常見的共患病［10］。因此進(jìn)行FMR1基因前突變攜帶者篩查，具有自閉癥類似表型或者自閉癥患者是不可忽視的候選人群。CGG（動(dòng)態(tài)突變的最小重復(fù)數(shù)為59）由親代向子代傳遞的過程中會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)突變，有報(bào)道稱親代向子代傳遞CGG時(shí)的動(dòng)態(tài)突變除了和CGG重復(fù)片段長(zhǎng)度有關(guān)外，還與母親的年齡以及CGG重復(fù)序列中AGG的插入數(shù)密切相關(guān)［11］。正常的FMR1基因（CGG）n結(jié)構(gòu)中每隔9～11個(gè)CGG就會(huì)有一個(gè)AGG插入，通過穩(wěn)定性原理，AGG的插入能夠增加CGG的穩(wěn)定性，限制其擴(kuò)展［12］。缺少AGG插入時(shí)，CGG重復(fù)數(shù)容易擴(kuò)展，形成前突變。本研究采用三引物熒光PCR?毛細(xì)管電泳法對(duì)收集的111例自閉癥樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用2種檢測(cè)系統(tǒng)即Qseq100TM全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)和ABI 3500Dx儀進(jìn)行結(jié)果比較驗(yàn)證，Qseq100毛細(xì)管電泳法可直接分析擴(kuò)展的目的片段長(zhǎng)度，進(jìn)而計(jì)算CGG重復(fù)數(shù)的范圍，3500Dx毛細(xì)管電泳測(cè)序法同樣可以根據(jù)測(cè)出的目的片段長(zhǎng)度計(jì)算CGG重復(fù)數(shù)，同時(shí)還可以分析AGG的插入個(gè)數(shù)從而快速診斷樣品特征。該方法首先選取一例臨床上已知FMR1基因CGG重復(fù)數(shù)為30的男性樣本作為檢測(cè)對(duì)照，毛細(xì)管電泳結(jié)果顯示其PCR擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為420 bp，在此基礎(chǔ)上計(jì)算受檢樣本的CGG重復(fù)數(shù)，并且利用3500Dx毛細(xì)管電泳測(cè)序法對(duì)上述方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)測(cè)序得到的目的片段長(zhǎng)度以及計(jì)算得出的CGG重復(fù)數(shù)均和Qseq100毛細(xì)管電泳的結(jié)果一致。說明我們針對(duì)脆性X綜合征FMR1基因前突變攜帶的三引物熒光PCR?毛細(xì)管電泳法是可行的，能夠準(zhǔn)確快速地檢測(cè)出樣本的FMR1基因CGG重復(fù)數(shù)及AGG插入情況。我們對(duì)111例自閉癥樣本進(jìn)行篩查，分析所有樣本的CGG重復(fù)數(shù)，其中有2例是前突變攜帶者，1例是中間型。這些結(jié)果表明有脆性X綜合征患者確實(shí)會(huì)表現(xiàn)出自閉癥樣癥狀，對(duì)自閉癥患者進(jìn)行脆性X綜合征篩查具有一定的實(shí)際意義。因而本方法可用于脆性X綜合征和自閉癥的輔助診斷。

目前已有多種篩查及診斷脆性X綜合征的方法，但每種方法各有其局限性。如細(xì)胞遺傳學(xué)分析雖可以直接觀察染色體脆性位點(diǎn)的病變，但檢出率較低［13］；DNA連鎖分析較細(xì)胞遺傳學(xué)分析增加了可信度，但該技術(shù)需要有先證者，致使檢測(cè)受到一定程度的限制；經(jīng)典的檢測(cè)方法Southern blot法雖然準(zhǔn)確性很高，也有其明顯的缺點(diǎn)，該方法對(duì)基因組DNA質(zhì)量和數(shù)量的要求較高，需用同位素來標(biāo)記，具有一定的危害性，并且操作繁雜，另外費(fèi)用昂貴，耗時(shí)長(zhǎng)。最重要的是Southern印跡并不能準(zhǔn)確地區(qū)分前突變和正常序列［14］，也無法準(zhǔn)確地計(jì)算出受檢樣本的CGG重復(fù)數(shù)。為此本研究對(duì)常規(guī)PCR法進(jìn)行改良，通過采用耐高溫酶及堿基替代法、添加PCR增效劑、提高退火溫度和改善擴(kuò)增條件等多個(gè)參數(shù)優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)對(duì)FMR1基因中CG含量較高的重復(fù)序列進(jìn)行擴(kuò)增。本方法具有操作簡(jiǎn)單、方便，耗時(shí)短，且通過Qsep100毛細(xì)管電泳法可以準(zhǔn)確地計(jì)算CGG重復(fù)數(shù)的優(yōu)點(diǎn)。這種快捷、經(jīng)濟(jì)、有效的脆性X綜合征的檢測(cè)方法的建立，對(duì)前突變攜帶者的群體篩查、高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的產(chǎn)前診斷以及脆性X綜合征和自閉癥的輔助診斷具有較大實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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Development ofFMR1gene mutation detection based on tri?primer fluorescence PCR?capillary electrophoresis and its application in auxiliary diagnosis of autism

SUN Li1,YANG Linyan2,YE Qianping2,YANG Xu3,YANG Xuexi4★
(1.Laboratory of North China Petroleum Administration Bureau General Hospital,Renqiu,Hebei,China,062552;2.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd,Guangzhou,Guangdong,China,510665;3.School of Basic Medicine,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515;4.School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

ObjectiveTo detect the repetition of CGG repeats and repeat numbers of 5′non?coding regions ofFMR1gene in autistic patients,and to explore a new method for detecting fragile X syndrome.MethodA total of 111 autistic patients were screened by tri?primer fluorescence PCR and capillary electrophoresis(Qseq100TMautomatic nucleic acid analysis system).TheFMR1gene 5′non?coding region CGG sequence was detected and the CGG repeats were calculated.The results were verified by ABI 3500Dx capillary electrophoresis sequencing.ResultsAmong the 111 cases of autistic samples,2 cases wereFMR1pre?mutation carriers and 1 case was intermediate.This result is consistent with the results of 3500Dx capillary electrophoresis sequencing.ConclusionTri?primer fluorescence PCR?capillary electrophoresis can be used to detect the CGG repeats of 5′non ?coding regions ofFMR1gene.It is of great value to study on the pathogenesis and crowd screening of fragile X syndrome.

Autism;FMR1gene;Fragile X syndrome;Tri-primer fluorescence PCR-capillary electrophoresis

廣東省科技計(jì)劃（2015A030401040）

★通訊作者：楊學(xué)習(xí)，E?mail：yxxzb@sohu.com