李奕基 梁培★

曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶的生物信息學(xué)分析

李奕基1，2梁培1，2★

目的通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶（Smcathepsin L樣蛋白酶）的生物學(xué)特征及其潛在功能和結(jié)構(gòu)，為下一步Smcathepsin L樣蛋白酶參與寄生蟲和宿主相互作用過(guò)程研究提供依據(jù)。方法通過(guò)NCBI的ORF finder工具對(duì)Smcathepsin L樣蛋白酶的開放閱讀框（ORF）進(jìn)行分析，利用ExPASy網(wǎng)站進(jìn)行蛋白的物理化學(xué)參數(shù)、信號(hào)肽、跨膜螺旋和潛在分子生物學(xué)功能的預(yù)測(cè)，通過(guò)NCBI/BLAST對(duì)蛋白保守功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)。從NCBI網(wǎng)站獲取不同物種的cathepsin L樣蛋白酶序列，并利用Vector NTI suit 8.0和TreeView軟件進(jìn)行分析。利用SWISS?MODEL網(wǎng)站和SPDBV 4.10軟件分析Smcathepsin L樣蛋白酶的三維空間結(jié)構(gòu)。結(jié)果Smcathepsin L樣蛋白酶是一個(gè)全長(zhǎng)基因，編碼336個(gè)氨基酸。蛋白由2個(gè)典型的cathepsin L樣蛋白酶結(jié)構(gòu)域組成，序列當(dāng)中有信號(hào)肽，是一個(gè)穩(wěn)定的可溶性蛋白分子。三維空間立體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示Smcathepsin L樣蛋白酶是一個(gè)保守的蛋白。Smcathepsin L樣蛋白酶編碼氨基酸序列與細(xì)粒棘球絳蟲、鏈狀帶絳蟲、多房棘球絳蟲和人的cathepsin L樣蛋白酶基因的同源性分別是50%、50%、49%和46%。分子進(jìn)化分析顯示Smcathepsin L樣蛋白酶與日本血吸蟲、多房棘球絳蟲和鏈狀帶絳蟲親源性更近，而與其他物種，例如原蟲、線蟲和哺乳動(dòng)物親源性較遠(yuǎn)。結(jié)論Smcathepsin L樣蛋白酶可能是一個(gè)潛在的分泌蛋白，該蛋白能在胞外發(fā)揮作用，即在寄生蟲的消化、轉(zhuǎn)移、入侵及宿主?寄生蟲相互作用中起著重要的作用，是一個(gè)具有潛在研究?jī)r(jià)值的多功能分子。

曼氏迭宮絳蟲；cathepsin L樣蛋白酶；生物信息學(xué)分析

作者單位：1.海南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，海南，?？?71199
2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南，?？?71199

[KEY WOEDS]Spirometra mansoni;Cathepsin L?like proteinase;Bioinformatics analysis

曼氏迭宮絳蟲（Spirometra mansoni，Sm），屬于迭宮絳蟲屬，其成蟲和裂頭蚴都能夠寄生于人，引起人獸共患寄生蟲病。曼氏迭宮絳蟲成蟲主要寄生于貓科動(dòng)物的小腸內(nèi)，偶爾寄生于人體。而幼蟲曼氏裂頭蚴（Sparganum mansoni）是主要致病階段，在人體內(nèi)寄生引起裂頭蚴?。⊿parganosis），裂頭蚴能夠寄生在人體的各種組織引起嚴(yán)重的損害，比如引起嚴(yán)重的眼部疾病、組織損傷和腦部功能紊亂。曼氏迭宮絳蟲分布在我國(guó)、日本、韓國(guó)和泰國(guó)等東南亞國(guó)家［1］。在我國(guó)，裂頭蚴病主要分布于27個(gè)省、市、自治區(qū)，感染人數(shù)超過(guò) 1 000 人［1?2］。

組織蛋白酶（cathepsin）是在動(dòng)物組織細(xì)胞內(nèi)（主要是溶酶體）發(fā)現(xiàn)的一類蛋白酶，包括絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等，其中半胱氨酸蛋白酶類包括組織蛋白酶B、F、H、K、L、O、S、V、W 和 X［3］。20世紀(jì)80年代組織蛋白酶L才被鑒定和測(cè)序，到目前為止從組織蛋白酶A到組織蛋白酶Z均已有報(bào)道［4］。半胱氨酸蛋白酶在寄生生物中起著極為重要的作用，除了基本的蛋白降解代謝功能外還參與寄生蟲免疫逃避，脫包囊/形成包囊脫鞘孵化以及細(xì)胞組織入侵等部分，同時(shí)寄生蟲半胱氨酸蛋白酶具有較好的抗原性，已作為血清診斷疫苗以及藥物研制的靶標(biāo)分子得到應(yīng)用［5］。純化的豬帶絳蟲囊尾蚴的可溶性重組半胱氨酸蛋白酶TsCL?1具有生物活性，其水解活性能被半胱氨酸蛋白酶特異性抑制劑E?64所抑制，同時(shí)TsCL?1重組蛋白有較好的免疫原性和抗原性，這為豬囊尾蚴病的診斷與檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)格低廉的技術(shù)手段［6］。在華支睪吸蟲中，半胱氨酸蛋白酶重組蛋白對(duì)檢測(cè)血清中特異性IgG具有較高敏感性和特異性，是華支睪吸蟲一個(gè)有潛在血清學(xué)診斷價(jià)值的重組蛋白抗原［7］。而對(duì)賈第蟲組織蛋白酶B的研究發(fā)現(xiàn)，其為賈第蟲病毒復(fù)制相關(guān)分子［8］。在旋毛蟲中，組織蛋白酶F具有胚胎致死性，同時(shí)其可作為治療旋毛蟲病的潛在藥物靶標(biāo)［9］。有研究證明天冬氨酸組織蛋白酶D在頂復(fù)門寄生蟲的蛋白運(yùn)輸機(jī)制中具有重要的作用，在瘧原蟲、扁形動(dòng)物、線蟲和蜱蟲中引起血液消化，并是多酶蛋白水解復(fù)合物的組成成分，同時(shí)具有作為抗寄生蟲病的新型有效干預(yù)策略的潛在靶標(biāo)［10］。

在本次研究中，我們對(duì)曼氏迭宮絳蟲的ca?thepsin L樣蛋白酶進(jìn)行了潛在生物化學(xué)特性的生物信息學(xué)分析。為進(jìn)一步探討cathepsin L樣蛋白酶在曼氏迭宮絳蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 Smcathepsin L樣蛋白酶核酸序列分析

從狗腸中分離的成蟲用來(lái)構(gòu)建曼氏迭宮絳蟲的cDNA文庫(kù)，得到的EST標(biāo)簽由上海聯(lián)眾基因科技研究院完成測(cè)序，編碼SmcathepsinL樣蛋白酶的cDNA序列從該文庫(kù)調(diào)取，其開放閱讀框（open reading frame，ORF）是通過(guò)利用Expasy（http：//www.expasy.org/）中的 ORF finder tool進(jìn)行查找。

1.2 Smcathepsin L樣蛋白酶氨基酸序列分析

Smcathepsin L樣蛋白酶蛋白的物理化學(xué)參數(shù)是通過(guò)ExPASy ProtParam獲取，并利用ExPASy網(wǎng)站進(jìn)行該蛋白的信號(hào)肽和跨膜螺旋的預(yù)測(cè)。Smca?thepsin L樣蛋白酶的保守功能域是通過(guò)NCBI/BLAST HOME進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 同源性和分子進(jìn)化樹分析

為了進(jìn)行同源性和分子進(jìn)化樹分析，我們通過(guò)NCBI獲取了不同物種的Smcathepsin L樣蛋白酶序列，利用生物信息學(xué)分析軟件Vector NTI suit 8.0和TreeView進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 Smcathepsin L樣蛋白酶結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建

Smcathepsin L樣蛋白酶三維空間結(jié)構(gòu)是利用編碼蛋白氨基酸通過(guò)SWISS?MODEL進(jìn)行預(yù)測(cè)和SPDBV 4.10進(jìn)行結(jié)果分析。在RAMPAGE服務(wù)器使用拉氏構(gòu)象圖（Ramachandran plot）（http：//mordred.bioc.cam.ac.uk/～rapper/rampage.php）檢 驗(yàn)最優(yōu)預(yù)測(cè)模型。

2 結(jié)果

2.1 核酸序列分析

ORF finder結(jié)果顯示Smcathepsin L樣蛋白酶核酸序列是全長(zhǎng)序列，由1 011個(gè)堿基對(duì)組成，見圖1。

圖1 曼氏迭宮絳蟲cathepsinL樣蛋白酶的開放閱讀框Figure 1 The open reading frame ofSmcathepsin L?like proteinase

2.2 編碼氨基酸的特征

Smcathepsin L樣蛋白酶蛋白由336個(gè)氨基酸組成，如圖2所示。氨基酸組成部分主要為Gly、Leu、Val、Ala和 Ser，分別占 9.5%、7.7%、7.7%、7.1%和7.1%。預(yù)測(cè)該蛋白的理論分子量是38.0 kDa，理論pI值是8.28。該蛋白在哺乳動(dòng)物中的半衰期是30 h，在酵母和大腸埃希桿菌中體內(nèi)表達(dá)的半衰期分別大于20 h和10 h。該蛋白是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白，其不穩(wěn)定系數(shù)是32.06。預(yù)測(cè)的C值、S值和Y值都高于0.5，這提示了該蛋白有信號(hào)肽，如圖3A所示?？缒ぢ菪治鼋Y(jié)果顯示了該蛋白不是一個(gè)跨膜蛋白，可能是一個(gè)可溶性的蛋白分子，如圖3B所示。

圖2 曼氏迭宮絳蟲cathepsinL樣蛋白酶的氨基酸組成Figure 2 Amino acid composition ofSmcathepsin L?like proteinase

圖3 曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶的功能區(qū)域分析Figure 3 Analysis ofSmcathepsin L?like proteinase functional domain

2.3 同源性和進(jìn)化樹分析

通過(guò)Smcathepsin L樣蛋白酶的多序列比對(duì)，結(jié)果如圖4顯示，Smcathepsin L樣蛋白酶編碼氨基酸序列與細(xì)粒棘球絳蟲、鏈狀帶絳蟲和多房棘球絳蟲的cathepsin L樣蛋白酶基因的同源性分別是50%、50%、49%。該蛋白是含有Inhibitor_I129和Peptidase_C1 2個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中Peptidase_C1結(jié)構(gòu)域含有4個(gè)活性位點(diǎn)（圖4紅色方框）和5個(gè)S2亞單位（圖4黑色方框）。不同物種間4個(gè)活性位點(diǎn)氨基酸高度保守，而5個(gè)S2亞單位氨基酸變異較大。

Smcathepsin L樣蛋白酶的分子進(jìn)化樹結(jié)果顯示Smcathepsin L樣蛋白酶與日本血吸蟲、多房棘球絳蟲和鏈狀帶絳蟲親源性更近，而與其他例如原蟲、線蟲和哺乳動(dòng)物親源性較遠(yuǎn)，見圖5。

圖4 曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶與其他物種cathepsin L樣蛋白酶的序列比對(duì)Figure 4 Alignment ofSmcathepsin L?like proteinase amino acid sequence with cathepsin L?like proteinase from other species

2.4 Smcathepsin L樣蛋白酶結(jié)構(gòu)模型

Smcathepsin L樣蛋白酶的保守功能區(qū)有2個(gè)：Inhibitor_I129結(jié)構(gòu)域和Peptidase_C1結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域的組成分別是32（aa）?91（aa）、121（aa）?335（aa），其中，2個(gè)結(jié)構(gòu)域分別由紅色和綠色下劃線顯示出來(lái)，見圖4。通過(guò)SWISS?MODEL對(duì)Smcathep?sin L樣蛋白酶的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，如圖6B所示。根據(jù)Ramachandran plots分析結(jié)果表明這個(gè)結(jié)構(gòu)模型是最優(yōu)化的（最合理區(qū)以及允許殘基數(shù)占比分別為85.5%和11.2%，在允許區(qū)內(nèi)總計(jì)占96.7%）。

圖5 曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶的分子進(jìn)化樹Figure 5 Molecular evolution tree of theSmcathepsin L?like proteinase

圖6 曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶典型的2個(gè)序列分析Figure 6 Analysis of 2 classic sequences ofSmcathepsin L?like proteinase

3 討論

組織蛋白酶分布廣泛，從低等到高等的各種類群生物體中均有被發(fā)現(xiàn)，在生物界已發(fā)現(xiàn)20余種［11］。組織蛋白酶L是絳蟲的一類重要的半胱氨酸蛋白酶，其參與絳蟲生命周期的多種活動(dòng)，在寄生生物中起著極為重要的作用［12?14］。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶是第一次被鑒別和進(jìn)行生物信息學(xué)分析。并對(duì)曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶的結(jié)構(gòu)和潛在的功能特征進(jìn)行了描述。在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們從曼氏迭宮絳蟲成蟲的cDNA文庫(kù)中分離得到其cathepsin L樣蛋白酶的全長(zhǎng)序列（圖1），該序列由336個(gè)氨基酸組成。曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶的理論分子量是38 kDa，含有信號(hào)肽，但它不是一個(gè)跨膜蛋白，提示其可能是一個(gè)潛在的分泌蛋白［15］。Smcathepsin L樣蛋白酶的保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)表明其屬于C1A肽酶家族，該家族在溶酶體蛋白的降解中起到作用［16］。另外，進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶與日本血吸蟲、多房棘球絳蟲和鏈狀帶絳蟲親源性較近，這可能是由于它們都屬于蠕蟲，說(shuō)明此蛋白在生物學(xué)和生物化學(xué)方面具有一定的相似作用。在日本血吸蟲成蟲消化道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了組織蛋白酶B和L，水解來(lái)源于宿主的紅細(xì)胞以滿足寄生蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和生存需要［17?18］。因此，曼氏迭宮絳蟲 cathepsin L 樣蛋白酶通過(guò)分泌到細(xì)胞外來(lái)為寄生蟲營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)方面發(fā)揮作用。

本研究表明不同物種間4個(gè)活性位點(diǎn)氨基酸高度保守，半胱氨酸和組氨酸是肽酶C1家族的催化殘基，形成催化二聚體。其他2個(gè)殘基在催化作用中起著重要的作用，其中谷氨酰胺在催化半胱氨酸之前，被認(rèn)為是有助于氧離子洞的形成，而天冬酰胺殘基識(shí)別催化性組氨酸的咪唑環(huán)［19?20］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)5個(gè)S2亞單位氨基酸變異較大。木瓜蛋白酶的特異性主要決定于位于該疏水區(qū)的疏水氨基酸或芳香族氨基酸殘基，那么曼氏迭宮絳蟲ca?thepsin L樣蛋白酶具有其特異性。比如肝片吸蟲的cathepsin L樣蛋白酶在S2亞單位偏好脯氨酸并且能夠水解膠原蛋白［21］。結(jié)構(gòu)域Inhibitor_I129作為前肽，作為單一結(jié)構(gòu)域蛋白或蛋白質(zhì)內(nèi)部單一或多重結(jié)構(gòu)域的肽蛋白酶抑制劑。在很多情況下，他們是合成大的前體蛋白的一部分，作為前多肽原或者作為N端結(jié)構(gòu)域與未激活的肽酶或酶原有關(guān)。這個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠阻止酶作用底物接近活性位點(diǎn)，其通過(guò)與另一個(gè)肽酶的相互作用或通過(guò)自動(dòng)催化切割激活酶原而去除N端抑制劑結(jié)構(gòu)域［22?23］。S2亞單位是木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶主要的底物特異性亞單位，該單位可容納底物P2側(cè)鏈的大體積疏水性或芳香殘基。組織蛋白酶B除外，由于在口袋的底部存在一個(gè)谷氨酸，其在此亞位點(diǎn)容易接受精氨酸［24?25］。目前，偽異盤并殖吸蟲（Pseudo Paragonimus）的電腦模擬三維結(jié)構(gòu)和肝片吸蟲的組織蛋白酶原L1的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)有報(bào)道［26?27］。蛋白質(zhì)特定的功能都是由其特定的構(gòu)象所決定的，為此進(jìn)一步的研究曼氏迭宮絳蟲cathepsin L樣蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)顯得尤為重要。

cathepsin多序列比對(duì)結(jié)果顯示cathepsin L樣蛋白酶的編碼氨基酸序列與人cathepsin L樣蛋白酶序列相似性僅有46%，同源性相對(duì)較低，因此，Smcathepsin L樣蛋白酶有望成為控制人類裂頭蚴病的有價(jià)值的疫苗靶點(diǎn)。此外，還有研究表明［28］寄生蟲的重組cathepsin L樣蛋白酶具有較好的免疫原性和抗原性，那么對(duì)曼氏迭宮絳蟲Smcathep?sin L樣蛋白酶免疫原性和抗原性仍需進(jìn)一步的研究，以確定其在寄生蟲和宿主間的相互作用，以進(jìn)一步開展免疫診斷和為治療研究奠定基礎(chǔ)。綜上所述，Smcathepsin L樣蛋白酶將是一個(gè)具有潛在研究?jī)r(jià)值的多功能分子。

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Sequence bioinformatics analysis of cathepsin L?like proteinase fromSpirometra mansoni

LI Yiji1，2，LIANG Pei1，2★
（1.Department of Pathogen Biology，Hainan Medical College，Haikou，Hainan，China，571199；2.Key Laboratory of Translational Medicine for Tropical Diseases， Ministry of Education，Hainan Medical University，Hainan，Haikou，China，571199）

ObjectiveTo provide information and pave the way for further research on cathepsin L ?like proteinase ofSpirometra mansoni(Smcathepsin L?like proteinase)which may participate in the interaction between parasite and host.MethodsThe open reading frame ofSmcathepsin L?like proteinase was identified with open reading frame(ORF)finder tool in NCBI website.ExPASy website was used topredict the physical and chemical parameters of protein,signal peptide,transmembrane helices and potential molecular and biological functions.The conserved domains of the protein were detected by NCBI/BLAST home.In order to analyze the homology and phylogenetic tree,sequences of cathepsin L?like proteinase from various species were obtained from NCBI website,and the results were analyzed by Vector NTI suil 8.0 and TreeView software.The three?dimensional structure ofSmcathepsin L?like proteinase was predicted by SWISS?MODEL and analyzed by SPDBV 4.10.ResultsSmcathepsin L?like proteinase is full?length gene and encoded 336 amino acid residues.The protein is composed of 2 classic conserved domains with signal peptide and a stably soluble molecule.It has a conservative cathepsin L?like proteinase in three?dimensional structure.Smcathepsin L?like proteinase is homologous to cathepsin L?like proteinase fromEchinococcusgranulosus,Taeniasolium,Echinococcus multilocularisandHomo sapienswith 50%,50%,49%and 46%identities,respectively.Smcathepsin L?like proteinase clustered with the L?like proteinase from theSchistosoma japonicum,Echinococcus multilocularis,and Taeniasolium,but not with other species like protozoon,trematode and mammal animals.ConclusionsSmcathepsin L?like proteinase is a potential secreted protein,and play a role in extracellular environment,such as digestion,metastasis,invasion and parasite?host interaction.Therefore,Smcathepsin L?like proteinase could be a potential important target.

國(guó)家自然科學(xué)基金課題（No.81560332，No.81660345）；海南省自然科學(xué)基金課題（No.814298）；海南醫(yī)學(xué)院2016年引進(jìn)人才科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)（No.2016011）；海南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（HYCX2016029）

★通訊作者：梁培，E?mail：liangpeilp2012@163.com