張薇薇，劉炳禹，夏亞男，林欣欣，黃陳佩玉，關(guān)麗萍

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

雙重濾光紫外照射增加海蜓體內(nèi)維生素D3的含量

張薇薇，劉炳禹，夏亞男，林欣欣，黃陳佩玉，關(guān)麗萍

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

生物體內(nèi)的7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外照射后會轉(zhuǎn)化為維生素D3。在合成維生素D3的過程中有多種光異構(gòu)化產(chǎn)物，光異構(gòu)產(chǎn)物取決于激發(fā)的紫外波長，本實驗加入兩種濾光液窄化高壓汞燈紫外波長在280～330 nm。利用不同波長與不同強度的紫外光對海蜓進行照射，以促使其體內(nèi)的7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為維生素D3。根據(jù)《中華人民共和國藥典》，采用高效液相色譜法測定提取得到的維生素D3的含量，并進行對比以探究最佳照射條件。實驗結(jié)果表明，海蜓體內(nèi)維生素D3最佳轉(zhuǎn)化率的條件為：照射時長為60 min，照射波長為302 nm。

維生素D3；紫外照射；海蜓；高效液相色譜法

維生素D是一種脂溶性維生素，其不僅可以提高機體對鈣、磷的吸收與利用，也可促進骨骼生長，但人體不能自行合成，需通過日曬或食物攝入獲得。世界范圍內(nèi)維生素D不足和缺乏的發(fā)生較常見，與其相關(guān)的疾病由以往傳統(tǒng)的骨骼畸形、骨質(zhì)疏松等與骨相關(guān)的單一系統(tǒng)疾病延伸至癌癥、自身免疫性疾病、感染性疾病、心血管疾病等多系統(tǒng)疾病[1]。

維生素D3是維生素D中生物代謝率最高的一種活性形式，主要來源于動物體內(nèi)合成，體內(nèi)的7-脫氫膽固醇經(jīng)陽光照射后，會變成維生素D3。維生素D3是調(diào)節(jié)人和動物機體鈣磷代謝的脂溶性維生素，對人體和動物的生長及保持良好的健康狀況具有驚人的重要性，尤其在促進動物生長和高產(chǎn)方面具有重大的經(jīng)濟意義。它是預(yù)防和治療佝僂病的一種藥物，同時也是食品添加劑和飼料添加劑中必不可少的成份。隨著人口的日益老齡化和畜牧業(yè)的發(fā)展,社會對維生素D3的需求將會越來越大[2]。

自然界的維生素D3主要存在于某些動物性食物中。成人的建議每日維生素D攝入量是10～20 μg。然而，一般情況下傳統(tǒng)飲食不足以滿足建議攝入量，單從食物中不易獲得機體所需要的維生素D，雖然一些營養(yǎng)膳食補充劑可以彌補這種不足，但其吸收率往往低于40%，日光照射皮膚是機體合成維生素D的一個重要途徑[3]。機體表皮中的7-脫氫膽同醇經(jīng)紫外線照射可生成前維生素D3，前維生素D3經(jīng)光解作用生成維生素D3，此反應(yīng)不需要酶的參加，亦不伴有蛋白質(zhì)的合成，是一種純光化學(xué)反應(yīng)。在維生素D3的光化學(xué)合成中，紫外光波長對7-脫氫膽固醇的光照產(chǎn)物分布起著決定性的作用，目前工業(yè)上仍采用高壓汞燈生產(chǎn)維生素D3，由于汞燈發(fā)射出紫外及許多可見波段光譜體，光照異構(gòu)產(chǎn)物較多，預(yù)維生素D3產(chǎn)率一般只有51%左右[4]。在實際應(yīng)用上，可以通過添加濾光片或濾光液來窄化高壓汞燈的波長段[5]。常見的濾光材料有濾光片、濾光膜和濾光液等。使用這些濾光材料后，可以過濾掉光源中部分波長的光，得到所需波長范圍的光源，這樣有助于提高大型光電儀器的準(zhǔn)確度和精度[6,7]。濾光液較濾光片以及濾光膜具有低成本、易操作等特點，所以本實驗通過使用帶有雙重濾光液的紫外汞燈，將紫外波長控制在280～330 nm之間，來控制7-脫氫膽固醇的光異構(gòu)反應(yīng)向產(chǎn)生維生素D3的方向進行。

舟山漁場位于西太平洋沿岸的長江口南部，是東海漁場的重要組成部分，這里水質(zhì)肥沃、餌料生物豐富、水文環(huán)境適宜，是各種水生生物繁殖、索餌、生長的良好區(qū)域，歷史上曾經(jīng)是我國漁業(yè)資源最豐富、生產(chǎn)力水平最高的漁場之一[8]。海蜓（幼鳀加工的咸干品）盛產(chǎn)于浙江寧波、舟山等地區(qū)。海蜒價廉易得，營養(yǎng)豐富，含脂量高達(dá)26%～30%，為一般魚類的近10倍。舟山地區(qū)居民飲食以魚類為主，但據(jù)調(diào)查顯示舟山地區(qū)1～5歲兒童維生素D缺乏的情況仍然較為突出[9]，市場上大部分魚肝油產(chǎn)品都有較高含量的維生素D，但其吸收率較低。雖然像海蜓這類多脂肪魚類、魚肝油是獲得維生素D3比較好的食物來源，分析其情況可能是由于海蜓主要分布于深海區(qū)域，受到光照較少，其體內(nèi)的7-脫氫膽固醇無法發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為維生素D3。本實驗旨在通過控制不同波長紫外光照射使海蜓體內(nèi)的7-脫氫膽同醇轉(zhuǎn)化為維生素D3，以期延伸到增加各種魚類食品、保健食品及其他魚類制品中維生素D3的含量。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

海蜓（購于舟山市場，自然風(fēng)干）；乙酸乙酯、抗壞血酸、無水乙醇、氫氧化鉀、無水乙醚、鎢酸鈉、硫酸鈷、濃硫酸等均為國藥（滬試）分析純試劑；甲醇、正己烷、乙腈、異丙醇等均為TEDIA色譜純試劑；維生素D標(biāo)準(zhǔn)對照品（購自sigma產(chǎn)品）；濾光液α為Na2WO4溶液，濾光液β為CoSO4-5%H2SO4溶液。實驗用水均為去離子水（液相色譜用水過0.22 μm微孔濾膜）。

安捷倫1200系列高效液相色譜儀（HPLC，美國安捷倫科技公司）；高純氮氣（舟山市億洋氣體有限公司）；YF-103中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）；紫外線高壓汞燈；HC-1016高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；BSA323S-電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HHS-電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；磨口玻璃儀器及其他玻璃儀器（上海申玻儀器公司）。

1.2 色譜條件

反相色譜：色譜柱：Dikma C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（50:50:2）；流速：1.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：500 μL；紫外-可見光檢測器，檢測波長 λ=254 nm。

正相色譜：色譜柱：依利特 Hypersil SiO2柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：正己烷-正戊醇（997:3）；流速：1.5 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：100 L；紫外-可見光檢測器，檢測波長 λ=254 nm。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

如圖1所示，7-脫氫膽固醇在光照條件下脫氫生成前維生素D3，前維生素D3在一定條件下（如加熱）異構(gòu)轉(zhuǎn)化為維生素D3[10]。

1.3.2 處理與提取

實驗裝置示意圖見圖2，將帶有濾光液的汞燈部分置于暗箱頂端，將待照射海蜓置于暗箱底端，調(diào)整汞燈與樣品之間的距離使得照射距離為5 cm，以維持一定的紫外光照強度。

取海蜓放入帶有濾光液紫外汞燈的暗箱內(nèi)進行紫外照射，分別設(shè)置不同照射時長與波長，每10 min將樣品翻面一次，確保照射均勻。照射后取一定量的樣品置于粉碎機中粉碎，加入乙酸乙酯（料液比1:5）提取24 h。

將上述提取液濃縮得到供試品。參照《中國藥典（二部）》（2015年版）[11]，取2 g供試品于皂化瓶，加入0.2 g抗壞血酸，30 mL無水乙醇，50%4 mL的氫氧化鉀溶液，80℃水浴回流40 min，冷卻后用水沖洗冷凝管內(nèi)壁，并將皂化液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙醚萃取3次，合并醚層并小心地用水洗至中性，加入少量濾紙條除去乙醚提取液中的水分，并用低溫水浴和氮氣流吹除乙醚，之后迅速精密加入3 mL甲醇，超聲助溶后轉(zhuǎn)入離心管，離心，取上清液作為供試品溶液A。

1.3.3 制備與檢測

參照《中國藥典》（2015年版）配制維生素D標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，按照上述反相色譜條件進樣，記錄色譜圖。取供試品溶液A進樣，準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，用氮氣流吹干，精密加入3 mL正己烷，超聲助溶，離心，取上清液得供試品溶液B。

取維生素D標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液按照上述正相色譜條件進樣，記錄色譜圖。取供試品溶液B進樣，記錄色譜圖。根據(jù)峰面積積分比較維生素D的含量。

圖1 維生素D3的光轉(zhuǎn)化原理Fig.1 The light conversion principle of vitamin D3

圖2 實驗裝置示意圖Fig.2 The schematic diagram of experimental device

2 結(jié)果與討論

2.1 濾光液對紫外波長的影響

濾光液具有特征吸收光譜、化學(xué)組成對光不敏感等特點，光源的輻射經(jīng)過濾光液吸收后，得到特定波長的窄譜帶光。常用的濾光液有PbSO4溶液、Na2WO4溶液、CoSO4-H2SO4溶液、NiSO4溶液等。

上述實驗裝置的帶有濾光液的汞燈模塊示意圖見圖3，汞燈外夾石英層分別裝有兩種濾光液，濾光液α為Na2WO4溶液，濾光液β為CoSO4-5%H2SO4溶液，上端為濾光液冷凝裝置。通過調(diào)整濾光液α和濾光液β的濃度，就可以控制波長范圍。紫外汞燈發(fā)射的廣譜光源經(jīng)過兩層濾光液的過濾，得到實驗所需要的窄譜光源。當(dāng)濾光液α為0.8M的Na2WO4溶液，濾光液β為1.0M的CoSO4-5%H2SO4溶液時，波長范圍窄化至280 nm～330 nm。

2.2 紫外光照時長對維生素D3轉(zhuǎn)化的影響

設(shè)置全波長（280 nm～330 nm）條件進行紫外照射，將海蜓分為5組，每組的照射時長分別設(shè)置為10、30、60、90 min，空白組不進行紫外照射。

圖3 汞燈模塊示意圖Fig.3 The schematic diagram of mercury lamp module

如圖4所示，隨著照射時間的延長，維生素D3的轉(zhuǎn)化率呈遞增趨勢，但當(dāng)照射時長超過60 min時，維生素D3的轉(zhuǎn)化率的增長不明顯，并且紫外照射時間過長會對紫外設(shè)備要求較高，難以實現(xiàn)。

2.3 紫外照射增加維生素D3含量HPLC

圖5是未經(jīng)過紫外照射和經(jīng)過60 min紫外照射海蜓HLPC色譜圖，A圖中未經(jīng)過紫外照射，沒有維生素D3含量峰，B圖是經(jīng)過60 min紫外照射后在17.712 min顯示維生素D3含量峰，C圖是標(biāo)準(zhǔn)品VD3經(jīng)過60 min紫外照射后在17.692 min顯示維生素D3含量峰。從HPLC中可以看出紫外照射海蜓與標(biāo)準(zhǔn)品維生素D3經(jīng)過紫外照射后出峰時間很相似，說明經(jīng)過紫外照射確實能增加海蜓D3含量。

圖4 紫外光照時長對維生素D3轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 The effect of UV irradiation time on Vitamin D3conversion

圖5 紫外光照增加維生素D3的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC of UV irradiation time on Vitamin D3conversion

2.4 紫外光照波長對維生素D3轉(zhuǎn)化的影響

設(shè)置紫外照射時長為60 min，將海蜓分為3組，通過調(diào)整兩種濾光液的濃度比例，將照射波長固定為280 nm、302 nm和330 nm。

如圖6所示，紫外照射波長為302 nm時，維生素D3的轉(zhuǎn)化率顯著高于其他波長條件下維生素D3的轉(zhuǎn)化率，且在提取與皂化過程中，波長280 nm與330 nm照射提取出的油狀物量少于波長302 nm照射的提取物，可能是7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為了其他光異構(gòu)產(chǎn)物。

3 結(jié)論

雙重濾光液的使用，可以將廣譜的光源窄化為所需波長范圍的光源，此方法改善了維生素D3光化學(xué)合成過程中，光異構(gòu)體復(fù)雜繁多的情況，提高了維生素D3的轉(zhuǎn)化率。

隨著照射時間的延長，維生素D3的轉(zhuǎn)化率呈遞增趨勢，但當(dāng)照射時長為90 min時，維生素D3的轉(zhuǎn)化率的增長不明顯，紫外照射時間過長對紫外設(shè)備要求較高，工業(yè)上難以操作，成本也較高，故照射時長60 min為最佳照射時長。紫外照射波長為302 nm時，維生素D3的轉(zhuǎn)化率顯著高于其他波長條件下維生素D3的轉(zhuǎn)化率，且在提取與皂化過程中，波長280 nm與330 nm照射提取出的油狀物量少于波長302 nm照射的提取物，可能是7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為了其他光異構(gòu)產(chǎn)物。綜上所述，紫外照射海蜓魚體內(nèi)維生素D3最佳轉(zhuǎn)化率的條件為：照射時長為60 min，照射波長為302 nm，照射距離為5 cm。

此外，本研究通過控制不同波長紫外光照射使海蜓體內(nèi)的7-脫氫膽同醇轉(zhuǎn)化為維生素D3，以延伸到增加各種魚類食品、保健食品及其他魚類制品中增加維生素D3的含量提供實驗理論依據(jù)。

圖6 紫外光照波長對維生素D3轉(zhuǎn)化的影響Fig.6 The effect of UV irradiation wavelength on Vitamin D3conversion

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Dual Filter UV Irradiation Increases the Content of Vitamin D3in Engraulis japonicus

ZHANG Wei-wei,LIU Bing-yu,XIA Ya-nan,et al
(Food and Medicine School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

Vitamin D3is obtained from organisms of 7-dehydrocholesterol by UV-LED exposure irradiation.While it has many light photoisomers during the synthesis of vitamin D3,and the light photoisomers lie on UV-LED wavelength.In this research,we add two kinds of light filter solution to narrow the UV wavelength to 280-330 nm.Engraulis japonicus are irradiated with different UV-LED exposure conditions to promote the transformation of 7-dehydrocholesterol into vitamin D3.According to the"Pharmacopoeia of the People's Republic of China",use HPLC method to determinate the content of obtained vitamin D3and compare to explore the best irradiation conditions.The results show that the optimum conversion conditions of vitamin D3in Engraulis japonicus are as follows:The irradiation time is 60 min while the irradiation wavelength is 302 nm.

Vitamin D3；Ultra violet light；Engraulis japonicus；HPLC

TS254.9

A

1008－830X(2017)03－0235－05

2017-03-13

舟山市科技計劃項目（2015C41015）；浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃（2017C33131）

張薇薇（1996-），女，江西上饒人，研究方向：水產(chǎn)品加工.E-mail:1151845400@qq.com

關(guān)麗萍.E-mail:glp730@163.com