鐘 志，郭遠明，劉 琴，石 群

(1.浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316021；3.浙江海洋大學，浙江舟山 316022)

As3+、Cr6+、Ni2+對黑褐新糠蝦毒性效應研究

鐘 志1,2，郭遠明1，劉 琴1，石 群3

(1.浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316021；3.浙江海洋大學，浙江舟山 316022)

選取黑褐新糠蝦為實驗動物，采用半靜態(tài)暴露法開展研究了As3+、Cr6+、Ni2+毒性效應。急性毒性實驗結果表明，As3+、Cr6+、Ni2+對黑褐新糠蝦的 96 h LC50分別為 92.04 μg/L、233.20 μg/L、537.10 μg/L；相關抗氧化酶系統(tǒng)研究結果顯示，SOD和CAT兩種酶對三種重金屬的暴露均呈現(xiàn)先誘導后抑制趨勢。暴露結果顯示，各處理組MDA水平顯著高于對照組。綜合3種重金屬離子對黑褐新糠蝦毒性數(shù)據(jù)，3種重金屬離子毒性依次為As3+＞Cr6+＞Ni2，且氧化壓力損傷被認為是其主要致毒機制之一。

As3+；Cr6+；Ni2+；黑褐新糠蝦；毒性；抗氧化酶系統(tǒng)

近年來，隨著第一產(chǎn)業(yè)、第二產(chǎn)業(yè)發(fā)展以及對于海洋資源的開發(fā)利用，含有重金屬（如As3+、Cr6+、Ni2+）的產(chǎn)品被廣泛地使用，近海漁業(yè)海域中的重金屬污染問題已成為海洋資源與環(huán)境研究中的重要內(nèi)容[1]。重金屬污染具有來源廣、殘毒時間長、難以降解、易富集等特性，被認為是海洋環(huán)境中具有潛在危害的重要污染物[2]。已有研究表明重金屬污染物對生物體產(chǎn)生的危害與氧化應激密切相關，造成機體氧化和抗氧化作用失衡進而導致機體組織器官畸變，產(chǎn)生神經(jīng)、生殖和免疫毒性[3]。因此抗氧化系統(tǒng)中酶成分、活性或含量的改變可有效地反映細胞氧化脅迫程度。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等作為污染物毒性的生物標志物已廣泛應用于重金屬毒理學研究[4,5]。張楠等研究指出，Zn2+能破壞大型溞的氧化應激平衡，導致體內(nèi)活性氧（ROS）及脂質過氧化程度增加、抗氧化酶活性降低[5]。

黑褐新糠蝦Neomysis awatschensis屬節(jié)肢動物門，甲殼綱，軟甲亞綱，糠蝦目，是廣泛分布于我國沿海的一種小型蝦類，多生活于近岸水域，與對蝦親緣關系較近[6]。它能在水底生物和浮游生物之間形成紐帶，是海洋生物鏈中的重要環(huán)節(jié)，具有生活周期短，生長快，易培養(yǎng)，對毒性敏感等特點，已在實驗室內(nèi)多年連續(xù)培養(yǎng)成功，因而被廣泛應用于水生生物毒性實驗中，具有廣泛的技術前景。

本文以黑褐新糠蝦為受試生物，通過劑量、毒性之間的相關性，探討了3種重金屬離子的致毒機理，以期為養(yǎng)殖環(huán)境評價和相關污染事故處理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

考馬斯亮藍蛋白試劑盒、SOD活性測定試劑盒、CAT活性試劑盒和MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；重鉻酸鉀(K2Cr2O7)、硝酸鎳（Ni（NO3）2·6H2O)均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；亞砷酸鈉(NaAsO2)，化學純，購自湖南水口山二廠化學試劑廠。實驗所用儲備液均以雙蒸水配置并于4℃避光保存。

1.2 儀器

臺式離心機（UNIVERSAL-320R，Hettich）、紫外分光光度計（SP-752，上海光譜儀器有限公司）、1 cm標準石英比色皿、KQ3200型超聲波清洗器（150W，昆山公司）、電子天平（MettleR-Toledo，Switzerland）、結晶皿（高硼硅玻璃，80 mm）、光照培養(yǎng)箱（PGX-450B，寧波海曙有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性實驗

急性試驗方法按照《近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測（GB 17378.7-2007海洋監(jiān)測規(guī)范第7部分）》進行[7]，將200只篩選后的黑褐新糠蝦分別暴露于添加As3+（50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/L）、Cr6+（100.0、200.0、300.0、400.0、500.0 μg/L）和Ni2+（200、400.0、600.0、800.0、1 000.0 μg/L）的100 mL人工海水（鹽度為30±2）。同時設置空白對照組，每組設置3個平行。每天更換實驗溶液一次，采用半靜態(tài)暴露方式。光周期為14 h:10 h（光照：黑暗），溫度為25±1℃，試驗周期為96 h。實驗期間，于12 h內(nèi)連續(xù)觀察，并記錄每組死亡數(shù)量，之后分別于24 h、48 h、72 h、96 h觀察記錄死亡情況。實驗中，用玻璃棒觸碰糠蝦個體無任何反應表示已完全死亡，及時撈出死亡個體，防止死亡的黑褐新糠蝦污染水質。

1.3.2 抗氧化酶活性及MDA水平測定

將 200 只篩選后的黑褐新糠蝦分別暴露于添加（25.0、50.0、75.0、100.0、125 μg/L）As3+、Cr6+和 Ni2+的100 mL人工海水（鹽度為30±2）。同時設置空白對照組，每組設置3個平行。分別于暴露第3 d、6 d隨機挑取10只黑褐新糠蝦，按1 g:10 mL的比例用PBS緩沖液制成質量分數(shù)10%的組織勻漿（pH=7.5），勻漿中SOD、CAT活力，分別用SOD、CAT試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)3種重金屬離子對黑褐新糠蝦的急性毒性實驗結果，本實驗采用概率單位—質量濃度直線回歸法，計算96 h LC50。安全濃度（Sc）采用下列公式計算[8]：

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行處理，并進行單因素方差分析（ANOVA），P≤0.05表示顯著性差異。

2 結果

2.1 As3+、Cr6+、Ni2+對黑褐新糠蝦的急性毒性

3種重金屬對黑褐新糠蝦的急性毒性試驗結果見表1。根據(jù)實驗結果計算，As3+對黑褐新糠蝦的96 h LC50為 92.04 μg/L，安全濃度為0.92 mg/L；Cr6+對黑褐新糠蝦的 96 h LC50為 233.20 μg/L，安全濃度為 2.33 μg/L；Ni2+對黑褐新糠蝦的 96 h LC50為 537.10 μg/L，安全濃度為 5.37 μg/L。

表1 As3+、Cr6+、Ni2+對黑褐新糠蝦的急性毒性試驗結果Tab.1 Acute toxicity of Cr6+,Ni2+and As3+to N.awatschensis

圖1 Cr6+、Ni2+和As3+單獨暴露對黑褐新糠蝦SOD活性的影響Fig.1 Effect of Cr6+,Ni2+and As3+to the SOD activity in N.awatschensis

2.2 As3+、Cr6+、Ni2+對黑褐新糠蝦 SOD 酶活性的影響

As3+、Cr6+、Ni6+誘導黑褐新糠蝦體內(nèi)SOD活性變化如圖1所示。各處理組隨濃度的升高，SOD活性均呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢。3 d時，當Ni2+暴露濃度為50.0 μg/L時，SOD酶活性達到最高值，為對照組的139.2%。當Ni2+濃度為125.0 μg/L時，SOD酶活性達到最低值，為對照組的62.7%，同時Cr6+、As3+低濃度處理組較Ni2+對應濃度SOD水平低，高濃度處理組較Ni2+對應濃度SOD水平高；6 d時，各處理組SOD活性均高于3 d時對應濃度的SOD活性，Ni2+濃度組中僅最高濃度組SOD活性低于對照組，呈現(xiàn)顯著的抑制作用，而其它濃度組均顯著高于對照組，且Cr6+、As3+低濃度處理組中SOD水平較Ni2+高。整體上看來，SOD活性呈現(xiàn)低濃度刺激、高濃度抑制效應。

圖2 Cr6+、Ni2+和As3+單獨暴露對黑褐新糠蝦CAT活性的影響Fig.2 Effect of Cr6+,Ni2+and As3+to the CAT activity in N.awatschensis

圖3 Ni2+、Cr6+和As3+單獨暴露對黑褐新糠蝦MDA含量的影響Fig.3 Effect of Ni2+,Cr6+and As3+to the level of MDA in N.awatschensis

2.3 As3+、Cr6+、Ni2+對黑褐新糠蝦 CAT 酶活性的影響

Ni2+、Cr6+和As3+誘導黑褐新糠蝦體內(nèi)CAT活性變化如圖2所示。在處理3 d的情況下，Ni2+暴露組CAT活性亦存在低濃度刺激，高濃度抑制現(xiàn)象。而除最高濃度組外，其余處理組與對照組CAT活性差異不顯著，最高濃度組酶活性與對照組相比呈現(xiàn)顯著抑制作用，但Cr6+、As3+在暴露濃度范圍內(nèi)CAT活性總體呈現(xiàn)增加趨勢，隨著時間的延長，CAT活性呈現(xiàn)上升趨勢。6 d時，三種重金屬對黑褐新糠蝦CAT活性均存在低濃度刺激，高濃度抑制現(xiàn)象，50.0、75.0、100.0 μg/LNi2+處理組呈顯著誘導作用，Cr6+和 As3+75.0、100.0 μg/L處理組均呈現(xiàn)顯著誘導作用。

2.4 As3+、Cr6+、Ni2+對黑褐新糠蝦 MDA 水平的影響

Ni2+、Cr6+和As3+對黑褐新糠蝦MDA含量影響見圖3，3 d時各處理組MDA水平均顯著高于對照組。當Cr6+和As3+暴露濃度為125.0 μg/L時，MDA水平達到最高值，分別為對應濃度Ni2+處理組129.8%、144.4%，而當Cr6+和As3+暴露濃度為75.0 μg/L時，MDA誘導水平較對應濃度Ni2+處理組最高，分別為135.5%、153.9%；6 d時，除As3+最高濃度全部死亡外，Cr6+和As3+各濃度處理組MDA水平均顯著高于對應濃度Ni2+處理組，Cr6+暴露濃度為125.0 μg/L時，MDA水平達到最高值，分別為對應濃度Ni2+處理組115.5%，而當Cr6+和As3+暴露濃度為25.0 μg/L時，MDA誘導水平較對應濃度Ni2+處理組最高，分別為119.1%、128.7%，整體上看來，MDA含量隨濃度、暴露時間升高而升高。

3 討論與結論

根據(jù)國家環(huán)保局相關文件規(guī)定，96 hLC50＞10 000 mg/L、1 000～10 000 mg/L、100～1 000 mg/L、1～100 mg/L、＜1.0 mg/L分別為微毒、低毒、中毒、高毒、劇毒污染物[9]。按照這一等級的劃分，本實驗中Cr6+、Ni2+、As3+對黑褐新糠蝦的 96 h LC50分別為 233.20 μg/L、537.10 μg/L、92.04 μg/L，Cr6+、Ni2+、As3+對黑褐新糠蝦的毒性均為劇毒。3種重金屬離子對黑褐新糠蝦的毒性依次為As3+＞Cr6+＞Ni2+。根據(jù)急性毒性試驗結果來看，Cr6+、Ni2+、As3+對大黃魚幼魚均具有急性毒性。

正常情況下，機體的抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡中，但在重金屬離子刺激下，會造成機體的氧化應激反應[10,11]。一定劑量的重金屬能使生物體體內(nèi)ROS增加，ROS具有高度的活性和氧化能力，能夠通過氧化作用攻擊生命大分子，這些物質若不能被及時清除，就會造成機體在分子細胞及組織器官水平的損傷[12,13]。SOD和CAT是機體的主要抗氧化酶，能夠清除體內(nèi)多余的ROS，維持機體氧化平衡[14]。機體SOD、CAT活力的高低間接反映了機體清除自由基的能力，MDA含量變化可反映機體內(nèi)脂質過氧化的程度，間接反映出細胞損傷的程度[15,16]。在3 d時，25.0 μg/L Ni2+暴露組SOD活性顯著高于對照組SOD活性，而Cr6+和As3+分別于50.0 μg/L和75.0 μg/L暴露濃度下SOD活性顯著高于對照組。該現(xiàn)象表明，Ni2+、Cr6+及As3+誘導胚胎體內(nèi)SOD活性與暴露劑量有關。SOD活性增加，可及時清理由污染物毒性造成的氧化損傷，保護機體正常運行。Ni2+暴露組SOD活性在最低濃度時，即產(chǎn)生較高的SOD活性，而Cr6+和As3+在較高濃度才出現(xiàn)該現(xiàn)象，這是由于黑褐新糠蝦SOD活性變化對三種重金屬表現(xiàn)不同的敏感性，這可能是由于Cr6+、Ni2+和As3+化學性質及結構的不同因而導致黑褐新糠蝦對其生物響應的差異。6 d暴露結果顯示SOD、CAT活性升高，MDA含量也增加，表明重金屬對黑褐新糠蝦的毒性與抗氧化酶活性變化及MDA含量變化之間存在較為密切的聯(lián)系。暴露結果顯示，同濃度暴露MDA誘導水平As3+>Cr6+>Ni2+，這是由于三種重金屬對黑褐新糠蝦抗氧化酶系統(tǒng)損傷程度不同，導致機體氧化損傷及脂質過氧化產(chǎn)物增加，從而造成機體細胞不同的毒性效應。

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Study on Toxicity of As3+,Cr6+,Ni2+to Neomysis awatschensis

ZHONG Zhi1,2,GUO Yuan-ming1,LIU Qin1,et al
（1.Marine and Fishery Research Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021;2.Key Laboratory of Sustainable Utilization of Technology Research for FisheryResourceofZhejiangProvince,Zhoushan316021;3.ZhejiangOceanUniversity,Zhoushan316022,China）

In this study,Neomysis awatschensis was selected as the experimental animal,and the toxicity experiments of As3+,Cr6+and Ni2+were carried out in the semi-static system.The results showed that 96 h LC50values of As3+,Cr6+and Ni2+towards Neomysis awatschensis in the sea water were 233.20 μg/L,537.10 μg/L and 92.04 μg/L,respectively.The activity of SOD and CAT showed that the tendency of first inducing and then inhibiting when exposed to As3+,Cr6+and Ni2+.And the level of MDA in every treatment group was significantly higher than that of control group.By synthesising the data of acute toxicity and antioxidant enzyme systems,the toxicity of As3+,Cr6+and Ni2+was arranged in a descend order as the following:As3+＞Cr6+＞Ni2+,and the oxidative stress could be considered as one of the main reason for the toxicity.

As3+;Cr6+;Ni2+;Neomysis awatschensis;toxicity;antioxidant enzyme systems

X503.2

A

1008－830X(2017)03－0212－05

2017-03-12

浙江省科技計劃項目（2015C32001）

鐘志（1979-），男，江西萍鄉(xiāng)人，高級工程師，研究方向：海洋環(huán)境監(jiān)測與評估.E-mail:zhongzhizz@sina.com