王紅永

摘要：本實(shí)驗(yàn)研究了刺參、鮑魚（在實(shí)驗(yàn)條件下暴露在不同濃度的蒽后，刺參和鮑魚體內(nèi)谷胱甘肽酶活性在不同時(shí)間段的動(dòng)態(tài)變化情況，并分析了刺參、鮑魚體內(nèi)GSH酶活性與蒽濃度之間的劑量、時(shí)間-效應(yīng)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)中海水空白與丙酮對(duì)照組之間沒有顯著差異。在蒽對(duì)刺參的污染實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)隨著污染物濃度的增加GSH酶活性也增加，并且蒽對(duì)GSH酶活性誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng)的時(shí)間是在12h。在凈化實(shí)驗(yàn)中，各污染物濃度組GSH酶活性與對(duì)照組相比差異不太明顯，說明實(shí)驗(yàn)濃度沒有嚴(yán)重的超出刺參自身抗氧化系統(tǒng)的能力，在此濃度范圍內(nèi)被污染的刺身可以通過凈化實(shí)驗(yàn)來恢復(fù)自身的抗氧化功能。

關(guān)鍵詞：蒽（anthracene）；刺參；鮑魚；GSH酶活性

1引言

我國(guó)由于歷史原因?qū)τ袡C(jī)物化學(xué)藥品的重視程度還不夠，故相應(yīng)的研究還比較滯后，相關(guān)的資料比較匱乏。尤其是有關(guān)難降解有機(jī)物的研究更少。由于難降解有機(jī)物在環(huán)境中的停留時(shí)間較長(zhǎng)，尤其是在海洋中的停留時(shí)間，所以未來對(duì)難降解有機(jī)物影響的研究將是重點(diǎn)。因此，研究多環(huán)芳烴——蒽對(duì)海洋生物的致毒效應(yīng)對(duì)于整個(gè)海洋生物資源乃至整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)都具有非常重要的意義。

2實(shí)驗(yàn)材料

2.1實(shí)驗(yàn)生物

刺參、鮑魚（長(zhǎng)約3cm）購自大連海寶生物有限公司，養(yǎng)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中每隔三天更換一次新鮮海水，并且每天分別投喂魚粉和海帶。

2.2實(shí)驗(yàn)藥品

蒽純度大于99%，購自Sigma試劑公司（Sigma—Aldrich，St.Louis，MO）、其它試劑TCA（三氯乙酸）、Tris、DTNB、丙酮、GSH等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.3實(shí)驗(yàn)儀器

燒杯（1000mL）、10mL比色管、2cm石英比色皿、10～50uL、50～100uL、100～1000uL移液槍三支、鑷子、電子稱量平、稱量紙、擦鏡紙、量筒若干、試管架、曝氣頭、721光分光光度器、25攝氏度水浴箱（一個(gè)）、計(jì)時(shí)器、剪刀、離心機(jī)、刻度吸管、試劑瓶、玻璃勻漿管。

2.4海水

取自大連市黑石礁海區(qū)，并經(jīng)砂濾后抽取使用。溫度為14±1℃，pH為7.9-8.1，鹽度為30。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1 GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制25？MGSH儲(chǔ)備液，分別取0、0.6、1.2、1.8、2.4、3mL的GSH儲(chǔ)備液于6支10mL的比色管中，然后分別向比色管中加入3、2.4、1.8、1.2、0.6、0mL的純水，混勻后各加100？LTCA，同時(shí)加入2mLTris緩沖溶液，在25C的恒溫水浴鍋中加熱5分鐘后在分別加入20uLDTNB，混勻顯色25分鐘后，分光光度計(jì)（波長(zhǎng)為415nm）測(cè)吸光值（第一個(gè)管為對(duì)照管），以X軸為GSH的濃度，Y軸為吸光度值（A-A0），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y=21.609x+0.0660。

3.2慢性毒性實(shí)驗(yàn)

1.將刺參和鮑魚清洗干凈，選取18個(gè)1000mL的燒杯中分別加入1000mL海水（每4個(gè)燒杯為一組，刺參設(shè)置兩組平行，鮑魚不設(shè)平行），另外兩個(gè)燒杯分別為空白和丙酮對(duì)照組（對(duì)照組投入海參）。并分別在實(shí)驗(yàn)組中依次投入蒽使溶液，使每個(gè)燒杯中蒽的濃度分別是1、5、10、20 ？g/L，對(duì)照組不加蒽溶液（海水對(duì)照組不加任何污染物、丙酮對(duì)照組加20 ？L的丙酮），并且曝氣。

2.從第一次加入蒽試劑開始每隔三天更換一次新鮮海水，并依次按前面的步驟加入藥品，直至第14d后不再加入蒽試劑。

3.在實(shí)驗(yàn)開始后在2h、6h、12h、24h、48h、4d、7d、21d后分別依次在每個(gè)燒杯中取樣（刺參每個(gè)濃度下取3個(gè)，鮑魚每個(gè)濃度取一只），裝入小塑料袋放在冰箱中進(jìn)行冰凍待測(cè)。在暴露14d后刺參和鮑魚在海水中凈化一個(gè)星期，在第21d再取樣觀察其自身恢復(fù)情況。然后測(cè)定刺參和鮑魚體內(nèi)GSH酶活性，實(shí)驗(yàn)期不投喂。

3.3組織勻漿的制備

將經(jīng)藥物脅迫后的刺參、鮑魚先進(jìn)行解凍，然后用剪刀剪碎，并用分析天平稱取組織塊0.2～1.0g左右，并加入其質(zhì)量9倍的冷生理鹽水，在玻璃勻漿管中充分研磨20次左右（6～8分鐘），然后把制備好的組織勻漿用普通離心機(jī)4000轉(zhuǎn)/分，離心l5 min，然后取上清液進(jìn)行GSH酶活性的測(cè)定。

3.4酶活性測(cè)定

準(zhǔn)備18支用純水清洗干凈的10mL比色管，每組4支（海參設(shè)置兩組平行，鮑魚不設(shè)平行組），另兩只為照組。分別加入100uL已經(jīng)離心好的濃度為1？g/L、5？g/L、10？g/L、20？g/L勻漿上清液，對(duì)照組加對(duì)應(yīng)的對(duì)照組上清液，然后加入2mLTris緩沖溶液，100？LTCA搖勻后在25℃的恒溫水浴鍋中加熱5分鐘后加入100？L2.5mMDTNB混勻顯色25分鐘后，在415nm處測(cè)定其吸光度。

3.5酶活性計(jì)算公式

GSH含量=21.609*（A-A0）+0.066

4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Excel、Sigmaplot12.5制作圖表，用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。顯著性差異檢驗(yàn)采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey檢驗(yàn)法，相關(guān)性分析采用皮爾遜（Pearson）方法，P<0.05 時(shí)被認(rèn)為差異顯著，P<0.01 時(shí)被認(rèn)為差異極顯著。

5實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

5.1 蒽對(duì)刺參體內(nèi)GSH酶活性的影響

在一定濃度蒽的脅迫作用下，GSH酶活性含量是個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程 ，蒽濃度和時(shí)間是影響GSH酶活性的重要因素。

在劑量一效應(yīng)關(guān)系面，刺參體內(nèi)GSH酶活性的含量隨著蒽濃度的增加而上升，但只有在2h和24h時(shí)有較為顯著的線性關(guān)系。高濃度時(shí)蒽對(duì)GSH酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)高于低濃度時(shí)的誘導(dǎo)效應(yīng)。但是在有蒽脅迫的情況下，除了12h以外在其他時(shí)候GSH的含量均沒有對(duì)照組高。在14d時(shí)解除暴露后再凈化一個(gè)星期后GSH酶活性含量又達(dá)到了最高值。

5.2蒽對(duì)鮑魚體內(nèi)GSH酶活性的影響

GSH酶活性含量是個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，蒽濃度和時(shí)間是影響GSH酶活性的重要因素。

在時(shí)間一效應(yīng)關(guān)系方面，海參體內(nèi)GSH酶活性在4d內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)了先升后降再升的趨勢(shì)，并且在蒽濃度為20？g/L時(shí)這種趨勢(shì)最為明顯，而且呈現(xiàn)出很明顯的“鐘”型變化趨勢(shì)，并且在12h值達(dá)到峰值，這說明表明鮑魚體內(nèi)GSH酶活性可在較短的時(shí)間內(nèi)被誘導(dǎo)，而且是在蒽濃度為20？g/L誘導(dǎo)效果最為顯著，且誘導(dǎo)效應(yīng)在初期高于后期。但低濃度組（1、5？g/L）在不同時(shí)刻之間的變化不太明顯。

6結(jié)論

6.1蒽對(duì)刺參體內(nèi)GSH酶活性的影響

在蒽對(duì)刺參體內(nèi)GSH酶活性的影響研究中我們發(fā)現(xiàn)，在12h時(shí)蒽對(duì)刺參體內(nèi)GSH酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng)。而且隨著污染物蒽濃度的增加GSH酶活性也增強(qiáng)，在21d時(shí)GSH含量恢復(fù)到了對(duì)照組的值，這說明凈化實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚴勾虆Ⅲw內(nèi)GSH酶活性恢復(fù)到正常水平，這與穆景利，王新紅[10]等人關(guān)于苯并（a）芘影響黑鯛肝臟EROD活性變化的動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果正好相同；另一方面也說明，暴露實(shí)驗(yàn)沒有嚴(yán)重的超出刺參自身的抗氧化系統(tǒng)能力。

6.2蒽對(duì)鮑魚體內(nèi)GSH酶活性的影響

在蒽對(duì)鮑魚體內(nèi)GSH酶活性影響的研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨著污染物蒽濃度的遞增GSH酶活性依次升高，但在第4d時(shí)GSH酶活性已經(jīng)不隨污染物濃度的變化而變化了，這說明此時(shí)污染物濃度已經(jīng)不是影響GSH酶活性的關(guān)鍵因素了。此外我們還發(fā)現(xiàn)在污染物蒽濃度為20ug/L時(shí)，GSH酶活性出現(xiàn)了先升后降的趨勢(shì)，并且在12h時(shí)GSH酶活性達(dá)到了最大值，這說明GSH酶活性可以很好地指示有機(jī)污染物對(duì)海參的生物響應(yīng)，而且污染物蒽的響應(yīng)濃度為20g/L。endprint