徐梅珍，畢云慧，王文艷，劉 旋，閆怡新，王德富

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

重樓組織培養(yǎng)和快繁體系的建立

徐梅珍，畢云慧，王文艷，劉 旋，閆怡新，王德富

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

通過對重樓的不同外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，篩選出最佳外植體、外植體壯苗和生根的最佳培養(yǎng)基配方，以期建立重樓的組織培養(yǎng)快繁體系。結(jié)果表明，進(jìn)行重樓組織快繁的最佳外植體是幼苗；最佳壯苗和生根培養(yǎng)基為MS＋1.25 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L NAA＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖。通過該研究可達(dá)到重樓組織的快速繁殖，緩解重樓中藥材市場緊缺的問題。

重樓；組織培養(yǎng)；快繁

重樓（Rhizoma paridis）是名貴中藥材之一，為百合科植物華重樓（七葉一枝花，Paris polyphylla Smith var.chinensis（Franch.）Hara）和滇重樓（P. polyphylla Smith var.yunnanensis（Franch.）Hand-Mazz）的干燥根莖[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，重樓具有抗腫瘤[4]、止血[5]、止咳平喘、抗菌[5]、抗病毒[5]、避孕[6]、消炎[7]、鎮(zhèn)痛等作用，常用于毒蛇咬傷、乳腺炎、肝癌、胃癌和白血病等病的治療，是云南白藥、宮血寧、熱毒清等[8-9]重要中成藥的主要成分，用途極為廣泛。目前，重樓以野生資源為主，資源有限，而且野生重樓生長周期長（從發(fā)芽到藥用一般需要5 a以上），繁殖速度較慢，再加上人們掠奪式的采挖，致使種苗資源嚴(yán)重匱乏，導(dǎo)致市場供需嚴(yán)重失調(diào)，直接影響到以重樓為主要原料的中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10-11]。

李強(qiáng)等[12]的研究結(jié)果表明，重樓屬3種植物的花粉活力呈現(xiàn)出先上升后下降，再小幅上升，然后下降至零的變化規(guī)律，這為其有性繁殖積累了資料，但是操作起來難度較大。羅明華[13]用完整或帶頂芽的根莖繁殖重樓幼苗，成活率高且生長快，表明帶頂端分生組織的根莖是重樓無性繁殖很好的外植體材料。但至今對重樓的組織培養(yǎng)方面尚未取得令人滿意的結(jié)果。

本試驗(yàn)以華重樓為材料，通過對重樓不同器官進(jìn)行無性繁殖研究，篩選出最佳外植體和最佳的壯苗和生根培養(yǎng)基配方，以期建立重樓的組織培養(yǎng)快繁體系，加快重樓種苗的繁育速度，為人工栽培重樓提供優(yōu)良種苗，解決重樓供不應(yīng)求的難題。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年5月在山西省呂梁市龐泉溝采集生長旺盛、無病蟲害的重樓根莖和葉，用自來水沖洗干凈備用；幼苗由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)條件 以MS培養(yǎng)基＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖為基本培養(yǎng)基，通過改變不同激素的種類和濃度形成不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，光照時(shí)間為12 h，光照強(qiáng)度為2 500 lx，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃。

1.2.2 外植體的消毒 將采集的試驗(yàn)材料先用自來水和肥皂水清洗，最后用蒸餾水洗3次，接著在無菌操作工作臺(tái)內(nèi)用70%酒精消毒20 s，再用無菌蒸餾水清洗3次，然后用NaClO（20%）＋吐溫（＜0.1%）滅菌10 min，最后用無菌蒸餾水清洗至少5次，以備接種。

1.2.3 幼苗的獲取 針對重樓種子發(fā)芽率低的情況，通過看護(hù)培養(yǎng)的方法獲得幼苗。具體方法：將一張1 cm左右的無菌濾紙放到一塊1 cm大的三七愈傷組織上，再把消過毒的重樓種子放在濾紙上，待發(fā)芽后再生長一段時(shí)間，將生長旺盛的幼苗轉(zhuǎn)移到壯苗及生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2.4 最佳外植體篩選 分別以重樓的葉片、根莖[14-15]和幼苗為外植體，MS培養(yǎng)基＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖為基本培養(yǎng)基，加入1.5 mg/L 6-BA，再加入質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，1.5 mg/L的NAA。將葉片切成1 cm左右的正方形，根莖切成0.5 cm左右的小段，幼苗稍做處理后，分別接入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每種外植體于不同培養(yǎng)基中分別接種10瓶，每瓶3個(gè)葉片或根莖或幼苗，培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察并記錄生長情況。

1.2.5 壯苗及生根培養(yǎng)基的篩選 以MS培養(yǎng)基＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖為基本培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA。其中，6-BA設(shè)置1.0，1.25，1.5 mg/L等3個(gè)濃度，NAA設(shè)置0.10，0.25，0.40 mg/L等3個(gè)濃度。選擇長勢較好的幼苗進(jìn)行壯苗及生根，每個(gè)濃度做10瓶，每瓶插1～2株。接種后置于光照培養(yǎng)室中，觀察并記錄生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選最佳外植體

重樓的不同外植體在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察不同質(zhì)量濃度激素下不同外植體的生長情況。由表1可知，重樓組織培養(yǎng)快繁最佳外植體是幼苗，6-BA和NAA的質(zhì)量濃度比例對幼苗的生長狀況影響較大，當(dāng)6-BA和NAA的比值相對較大時(shí)，幼苗生長速度較快，生長狀態(tài)較好。幼苗的生長情況如圖1-a所示。

表1 不同培養(yǎng)基對不同外植體芽苗的誘導(dǎo)效果

2.2 重樓生根及壯苗培養(yǎng)基的篩選

表2 不同培養(yǎng)基對重樓生根及壯苗的誘導(dǎo)結(jié)果

由表2可知，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.25 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.25 mg/L時(shí)，這個(gè)激素配比對生根及壯苗影響較大，效果最明顯，平均株高達(dá)4.3 cm。由此可以得出，促進(jìn)重樓生根及壯苗的最佳培養(yǎng)基為MS＋1.25 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L NAA＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖。生根情況如圖1-b所示，壯苗情況如圖1-c所示。

3 討論與結(jié)論

本研究為解決重樓中藥材市場緊缺的問題，選用植物離體快速繁殖的方法，能在短時(shí)間內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株，不受季節(jié)和氣候的影響，周年繁殖，生長速度快，效率高，其培養(yǎng)條件可控制性強(qiáng)，管理方便，利于自動(dòng)化控制，并且占用空間小，操作簡單、方便[16-18]。

重樓的種類多，但是主要為野生資源，近年生活環(huán)境的破壞和過度采挖，導(dǎo)致重樓原材料稀缺。將重樓種子運(yùn)用看護(hù)培養(yǎng)的方法得到幼苗。選用看護(hù)培養(yǎng)，簡單易行，能明顯打破種子的休眠期，促進(jìn)種子發(fā)芽，縮短重樓種子萌發(fā)的時(shí)間，為試驗(yàn)提供幼苗材料，克服試驗(yàn)材料短缺的不足。

通過上述試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，重樓的根莖和葉片生長緩慢，并且沒有明顯生根和發(fā)芽的變化，而重樓的幼苗生長迅速，是組織快繁的最佳原材料，且得到最佳的壯苗及生根培養(yǎng)基是MS＋1.25 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L NAA＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖。幼苗在該培養(yǎng)基上植株生長旺盛，滿足大量快繁的要求，可為重樓的人工栽培提供優(yōu)質(zhì)的種苗。

［1］李恒.重樓屬植物[M].北京：科學(xué)出版社，1998．

［2］中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1982．

［3］國家藥典委員會(huì).中國藥典一部 [M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：243.

［4］ CHEUNG J Y，ONG R C，SUENY K，etal.Polyphyllin D is a potent apoptosis inducer in drug-resistant HepG2 cells[J].Cancer Letters，2005（2）：203-211．

［5］王強(qiáng)，徐國鈞，程永寶.中藥七葉一枝花類的抑菌和止血作用的研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，20（4）：251.

［6］WANG G X，HAN J，ZHAO L W，et al.Anthelmintic activity of steroidal saponins from Paris polyphylla [J].Phytomedicine，2010，17（14）：1102-1105.

［7］歐陽錄明，黃曉敏，吳興無，等.中草藥體外抗白色念珠菌的試驗(yàn)研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2000，7（3）：26-27.

［8］谷海燕.藥用植物華重樓的資源現(xiàn)狀及其繁育研究進(jìn)展 [J].四川林業(yè)科技，2014，35（4）：56-59.

［9］張金渝，王元忠，趙艷麗，等.藥用植物重樓的紫外吸收光譜分析與鑒別[J].光譜學(xué)與光譜分析，2012，32（8）：2176-2180.

［10］金梅.藥用植物重樓快速繁殖技術(shù)研究前景 [J].保山師專學(xué)報(bào)，2005，24（2）：16-18.

［11］歐立軍.重樓屬藥用植物研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（20）：9471-9474.

［12］李強(qiáng)，丁春邦，胡小林，等.重樓屬3種植物花粉活力及柱頭可授性研究[J].中國中藥雜志，2007，32（10）：969-970.

［13］羅明華.峨眉山的重樓屬種類分布及一些種年生長特性[J].中藥材，2004，27（7）：478.

［14］陳翠，楊麗云，呂麗芬，等.云南重樓根狀莖切段苗繁育技術(shù)研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，20（4）：706-710.

［15］侯玉平，胡曉立，沙莎，等.重樓的繁殖技術(shù)研究進(jìn)展[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，26（6A）：60-62．

［16］楊麗云.云南重樓的組織培養(yǎng)與植株再生 [J].植物生理學(xué)通訊，2008，44（5）：947-948.

［17］王躍華.華重樓愈傷組織培養(yǎng)及薯蕷皂苷含量測定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（8）：1936-1940.

［18］李群，葛方蘭，王麗，等.重樓屬植物初代培養(yǎng)過程中無菌培養(yǎng)物的建立[J].四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（6）：624-626.

Establishment of Tissue Culture and Rapid Propagation System of Rhizoma paridis

XUMeizhen，BIYunhui，WANGWenyan，LIUXuan，YANYixin，WANGDefu
（College ofLife Science，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu 030801，China）

Through the Rhizoma paridis the tissue culture of different explant,the paper chose the best explant,the seeding and rootthe bestculture medium formulh,to establish oftissue culture and rapid propagation system of Rhizoma paridis.The results showed thatthe optimalexplantwas seeding,the bestseedling and rooting medium was MS+1.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+0.8%ager+ 3%sugar.Through these studies to Rhizoma paridis building tissue rapid propagation,the shortage ofChinese herbalmedicine marketof Rhizoma paridis problems was relieved.

Rhizoma paridis;tissue culture;rapid propagation

R282.71

：A

：1002-2481（2017）09-1412-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.05

2017-05-03

山西省普通高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（2015084）

徐梅珍（1994-），女，山西垣曲人，在讀本科，研究方向：中藥資源與開發(fā)。王德富為通信作者。