何積明，呂尊富，江九華，李飛飛

（浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江臨安311300）

3種陸地棉下胚軸對草甘膦抗性篩選的鑒定

何積明，呂尊富，江九華，李飛飛

（浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江臨安311300）

為了建立以草甘膦為選擇標記且具有高效篩選效率的棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系，研究選取WC，R15和新陸早45號這3個具有成功再生體系陸地棉的下胚軸為試驗材料，分別以選擇壓2.5，5，10，20，50，100 mg/L的草甘膦質(zhì)量濃度梯度進行草甘膦敏感性試驗。結(jié)果表明，WC，R15和新陸早45號的最適抗草甘膦質(zhì)量濃度分別是5，20，10 mg/L。說明不同陸地棉品種下胚軸具有不同的草甘膦抗性，選擇合適濃度的草甘膦是獲取陽性轉(zhuǎn)化體的關(guān)鍵之一，研究為提高以草甘膦為選擇標記的棉花轉(zhuǎn)基因試驗的篩選效率提供了技術(shù)支持。

陸地棉；下胚軸；草甘膦；抗性篩選

棉花是重要的經(jīng)濟作物和纖維作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)容易因滋生雜草而受到嚴重影響。草甘膦（Glyphosate）作為一種廣普性除草劑，它能夠有效解決雜草給棉花生產(chǎn)造成的干擾，具有低毒、高效、無污染和雜草不易產(chǎn)生抗性等綜合性能[1]，是目前世界上使用范圍最廣的除草劑[2]。研究表明，草甘膦可抑制Epsps蛋白的活性，通過阻斷芳香族氨基酸的生成，進而阻斷一些芳香族化合物的生物合成，蛋白質(zhì)合成受阻，無法進行正常的氮代謝，最終導(dǎo)致植株死亡；但草甘膦在殺死雜草的同時也會將棉花植株殺死。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育具有草甘膦抗性的新棉種成為一種有效手段[3]。草甘膦的抗性基因為Epsps[4]，在一定的草甘膦濃度下，Epsps不被草甘膦抑制而能正常合成芳香族氨基酸及相關(guān)蛋白，從而使植株正常生長，表現(xiàn)出草甘膦的抗性[5]。

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是棉花轉(zhuǎn)基因常用的方法。該方法有2個關(guān)鍵點：一個是成功的再生體系，另一個是合適的選擇壓濃度。研究表明，棉花對草甘膦這種除草劑具有一定的耐受性，不同的棉花品種對草甘膦的抗性不同[6]。章鄭專等[7]研究發(fā)現(xiàn)，YZ-1的胚性愈傷組織對草甘膦有較強的抗性，用10 mg/L的草甘膦進行篩選，轉(zhuǎn)化率可達到62.5%。謝龍旭等[8]以中棉所35的下胚軸為受體，以10.1 mg/L的草甘膦為篩選劑，獲得了65株轉(zhuǎn)化有草甘膦抗性基因的轉(zhuǎn)化體。趙福永等[9]以陸地棉栽培品種石遠321的下胚軸為受體，以13.5 mg/L的草甘膦為篩選濃度，獲得38株轉(zhuǎn)化有aroAM12和Bts1m基因的轉(zhuǎn)化體。由此可見，選擇適合不同棉花品種的草甘膦敏感性試驗濃度，對于成功轉(zhuǎn)化十分關(guān)鍵。

本試驗選取3種具有成功再生體系的陸地棉WC，R15和新陸早45號為材料，設(shè)計6個草甘膦濃度梯度，對其下胚軸進行抗性篩選的鑒定，找到用草甘膦作為選擇標記的臨界濃度，以提高草甘膦為選擇標記的棉花遺傳轉(zhuǎn)化效率。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以陸地棉（WC，R15和新陸早45號）種子無菌苗的下胚軸為材料。所用培養(yǎng)基為無菌苗培養(yǎng)基（1/2 MS）和草甘膦抗性篩選的培養(yǎng)基（MS＋0.1 mg/L 2，4-D＋0.1 mg/L KT＋0.75 g/L氯化鎂＋30 g/L葡萄糖＋2.0 g/L菲特膠＋草甘膦（質(zhì)量濃度分別為2.5，5，10，20，50，100 mg/L）。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的培養(yǎng) 取WC，R15和新陸早45號種子各30粒，分別放入培養(yǎng)瓶中。然后倒入75%的乙醇消毒30 s，棄去乙醇；倒入30%的雙氧水，并置于100 r/min的搖床上消毒3 h；超凈臺上用加頭孢的無菌水清洗種子3次，無菌水浸泡過夜。待種子露白，在無菌條件下，剝?nèi)シN子種皮，接種于1/2 MS培養(yǎng)基上，置于25～27℃條件下培養(yǎng)5～7 d[10-11]。

1.2.2 3種下胚軸的草甘膦敏感性試驗 將下胚軸切成5～7 mm的胚軸段，分別接種到含有不同質(zhì)量濃度（2.5，5，10，20，50，100 mg/L）的草甘膦愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個濃度接種3瓶，每瓶接種5段，3次重復(fù)，置于25℃的組培室內(nèi)培養(yǎng)，20 d左右統(tǒng)計下胚軸的膨大數(shù)和出愈數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0軟件進行方差分析，并采用鄧肯氏（Duncan）新復(fù)極差測驗法，對3個品種陸地棉下胚軸在不同草甘膦濃度下的膨大率和出愈率進行差異性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 WC下胚軸對草甘膦的抗性篩選鑒定

從表1、圖1可以看出，當草甘膦的質(zhì)量濃度為2.5 mg/L時，大部分的胚軸段有明顯的膨大并且長出愈傷組織，且膨大率和出愈率分別為80%和38.89%，表明選擇效力很低；當草甘膦的質(zhì)量濃度在10 mg/L及以上時，胚軸段不膨大并且無愈傷組織出現(xiàn)，表明選擇壓太大；而當草甘膦的質(zhì)量濃度為5 mg/L時，下胚軸有膨大，膨大率約為36.67%，幾乎沒有愈傷組織長出，起到了一定的篩選效果。因此，選取5 mg/L草甘膦作為以WC的下胚軸為受體的篩選濃度。

表1 WC下胚軸在不同質(zhì)量濃度草甘膦培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后的膨大率和出愈率

2.2 R15下胚軸對草甘膦的抗性篩選鑒定

由表2、圖2可知，草甘膦質(zhì)量濃度為2.5 mg/L時，膨大率與出愈率與對照間無顯著差異，基本沒起到選擇效果；當草甘膦濃度分別為5，10 mg/L時，膨大率和出愈率均顯著下降，但最低仍分別達到65.56%和22.22%，選擇效果不顯著；當草甘膦質(zhì)量濃度大于50 mg/L時，均不再出現(xiàn)膨大和愈傷組織，表明選擇壓過大；當草甘膦質(zhì)量濃度在20 mg/L時，下胚軸少部分出現(xiàn)膨大和愈傷組織，膨大率和出愈率分別約為26.67%和11.11%，可以達到較好的選擇效果。因此，選取20 mg/L草甘膦作為以R15的下胚軸為受體的篩選濃度。

表2 R15下胚軸在不同濃度草甘膦培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后的膨大率和出愈率

2.3 新陸早45號下胚軸對草甘膦的抗性篩選鑒定

新陸早45號對草甘膦的敏感性結(jié)果如表3和圖3所示。從表3、圖3可以看出，草甘膦質(zhì)量濃度為2.5 mg/L時，出愈率顯著下降達到36.67%，而膨大率下降不明顯，為90.00%；當草甘膦質(zhì)量濃度為5 mg/L時，膨大率顯著下降，但依舊較高，為50%，而此時出愈率為23.33%，所以這2個質(zhì)量濃度的草甘膦選擇壓偏低，無法很好地將轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體加以區(qū)分；當草甘膦濃度達到20 mg/L以上時，不再出現(xiàn)膨大和愈傷，選擇壓偏高；當草甘膦質(zhì)量濃度為10 mg/L時，下胚軸有一部分膨大和少量愈傷組織，膨大率和愈傷率分別約為40%和11.11%，可以達到較好的選擇效果。因此，選取10 mg/L草甘膦作為以新陸早45號的下胚軸為受體的篩選濃度。

表3 新陸早45號下胚軸在不同質(zhì)量濃度草甘膦培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后的膨大率和出愈率

3 結(jié)論

本試驗設(shè)置了6個草甘膦的濃度梯度（2.5，5，10，20，50，100 mg/L）對3個品種的下胚軸分別進行抗性篩選鑒定，結(jié)果表明，WC，R15和新陸早45號的下胚軸對草甘膦的最適篩選質(zhì)量濃度分別為5，20，10 mg/L。不同基因型棉花的下胚軸對草甘膦具有不同的抗性或耐受性，選擇適合的篩選濃度是棉花轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵點之一。

4 討論

棉花再生體系的建立依賴于其基因型，國外成功轉(zhuǎn)化的棉花品種主要是柯字棉系列，國內(nèi)成功轉(zhuǎn)化的棉花品種主要是冀字棉系列、中棉所系列及華中農(nóng)業(yè)大學篩選出的高頻體細胞胚胎發(fā)生品種“豫早1號”[12-13]。所以，本試驗所選的3種陸地棉，都已成功構(gòu)建了高效的再生體系，也是棉花轉(zhuǎn)基因中的常用材料。

本試驗結(jié)果顯示，WC，R15和新陸早45號的下胚軸對草甘膦的敏感性質(zhì)量濃度分為5，20，10 mg/L，由此可見，不同棉花品種對草甘膦的耐受性不同，因而，在進行以農(nóng)桿菌介導(dǎo)為途徑的遺傳轉(zhuǎn)化之前必須對草甘膦的使用濃度進行探討。另外，棉花的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化是一個比較復(fù)雜和耗時的過程[14-16]。除感染和共培養(yǎng)外，其余環(huán)節(jié)都要通過草甘膦的篩選才可能獲得高比率的轉(zhuǎn)化植株，因而，在多個階段進行草甘膦篩選，以淘汰那些未轉(zhuǎn)化成功的個體十分必要。本試驗通過研究WC，R15和新陸早45號3種陸地棉下胚軸對草甘膦的敏感性，初步確定了用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化的下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)和生長過程中草甘膦的適宜篩選濃度，為進一步棉花轉(zhuǎn)基因試驗奠定了基礎(chǔ)。

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Identification of Glyphosate Resistance Screening in Three Upland Cotton Hypocotyls

HE Jiming，LüZunfu，JIANGJiuhua，LIFeifei

（College ofAgriculture and Food Science，Zhejiang Agriculture and Forestry University，Lin'an 311300，China）

For developing a transgenic cotton transformation system,in which glyphosate was used as a selective agent in high screening efficiency,the research adopted hypocotylfrom three varieties of WC,R15 and Xinluzao 45 ofupland cotton as experimental materials,and designed glyphosate solutions of six concentrations of 2.5,5,10,20,50,100 mg/L to carry out glyphosate susceptibility tests.The results showed thatoptimum concentrations ofglyphosate ofWC,R15 and Xinluzao 45 resistwere 5,20,10 mg/L,respectively. The research explained that hypocotyl of different upland cottons had differrent resistance to glyphosate.Selecting the appropriate concentration ofglyphosate was one ofthe keys to obtain the positive transformation.So,the research provides a technicalbasic for cotton genetic transformation,aim atimproving the screening efficiency oftransgenic cotton with glyphosate as the selective marker.

upland cotton;hypocotyl;glyphosate;resistance screening

S562

：A

：1002-2481（2017）09-1408-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.04

2017-05-27

國家自然科學基金青年基金項目（31401461）；2016年浙江農(nóng)林大學校級教改項目（KG16001）；2016年浙江農(nóng)林大學學生科研訓(xùn)練項目（113-2013200012）

何積明（1996-），男，浙江溫州人，在讀本科，研究方向：植物基因工程。李飛飛為通信作者。