盧維城 石聰聰 蔡 東 鄭 旭 郝 虎 肖 昕

1.海南省人民醫(yī)院新生兒科（海南?？?570311）；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院兒科（廣東廣州 510655）

低堿性磷酸酶血癥一家系臨床與基因分析

盧維城 石聰聰 蔡 東 鄭 旭 郝 虎 肖 昕

1.海南省人民醫(yī)院新生兒科（海南?？?570311）；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院兒科（廣東廣州 510655）

目的探討組織非特異性堿性磷酸酶（TNSALP） 基因檢測(cè)在低堿性磷酸酶血癥（HPP）產(chǎn)前診斷中的作用。方法回顧分析1例新生兒HPP患兒的臨床資料，以及全外顯子組測(cè)序檢測(cè)TNSALP基因結(jié)果；采集家系成員外周血，及患兒母親第2胎孕17周胎兒的羊水細(xì)胞，進(jìn)行候選基因突變的Sanger測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果患兒，男性、6日齡，主要表現(xiàn)為多發(fā)性骨折，肢體縮短彎曲，呼吸困難，生后9天死于呼吸衰竭；血清堿性磷酸酶下降，血鈣輕度下降，血磷正常，血清25羥維生素-D和甲狀旁腺激素均正常；X線顯示全身骨骼嚴(yán)重礦化不良，長(zhǎng)骨干骺端增大呈杯口狀，多發(fā)性骨折；基因測(cè)序結(jié)果顯示患兒TNSALP基因存在一復(fù)合雜合性錯(cuò)義突變，分別為位于第6外顯子內(nèi)的雜合性錯(cuò)義突變c.542C＞T導(dǎo)致第181位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)榱涟彼幔╬.S181L），第10外顯子內(nèi)雜合性錯(cuò)義突變c.1016G＞A導(dǎo)致第339位氨基酸甘氨酸突變?yōu)楣劝彼幔╬.G339E）；患兒父母表型均正常，c.542C＞T突變遺傳自父親，c.1016G＞A突變遺傳自母親。胎兒未檢出這兩種突變。結(jié)論TNSALP基因分析可應(yīng)用于HPP的診斷以及產(chǎn)前診斷。

低堿性磷酸酶血癥； 組織非特異性堿性磷酸酶基因； 突變； 產(chǎn)前診斷

低堿性磷酸酶血癥（hypophosphatasia，HPP）是一種罕見(jiàn)的代謝性骨病，以廣泛骨骼、牙齒礦化障礙及組織非特異性堿性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNSALP)活性低下或消失為特征，該病是由組織非特異性堿性磷酸酶基因突變導(dǎo)致的系統(tǒng)性疾病[1]，重癥病例死亡發(fā)生率高達(dá)50%～100%。本研究擬通過(guò)對(duì)1例新生兒HPP患兒的臨床、生化和基因檢測(cè)結(jié)果的分析，探討HPP診斷以及產(chǎn)前診斷。

1 臨床資料

患兒，男，6日齡，因“生后雙上肢畸形，氣促、發(fā)紺6天”入院?；純篏1P1，孕41周順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3 650 g，羊水、胎盤、臍帶無(wú)異常，Apgar評(píng)分10分；孕期正規(guī)產(chǎn)檢未發(fā)現(xiàn)任何異常。父母均為蒙古族，非近親結(jié)婚，健康狀況良好，否認(rèn)家族遺傳病史。體格檢查：體溫36.5 ℃，呼吸66次/min，脈搏168次/min，收縮壓/舒張壓（SBP/DBP）86/48 mmHg，體質(zhì)量3.69 kg，頭圍36 cm，身長(zhǎng)48 cm，神志清，精神反應(yīng)好，面容無(wú)特殊；顱骨軟化，觸之有乒乓球樣感；四肢短，雙上肢成角畸形，該處皮膚呈環(huán)形深凹切跡，活動(dòng)障礙。胸廓無(wú)明顯畸形，呼吸促，脫氧發(fā)紺明顯，雙肺聞及濕性啰音，心音有力，心臟未聞及雜音。實(shí)驗(yàn)室檢查：血鈣1.85 mmol/L (2.25～2.80 mmo/L)，血磷2.82 mmol/L(0.90～1.34 mmol/L)，血清堿性磷酸酶26.0 U/L，血清甲狀旁腺激素31.80 pg/mL，血清25羥維生素D 20 ng/mL，血串聯(lián)質(zhì)譜和尿氣相色譜-質(zhì)譜分析無(wú)異常。彩色多普勒超聲心動(dòng)圖示房間隔缺損，動(dòng)脈導(dǎo)管未閉。腎臟B超示雙腎未見(jiàn)鈣質(zhì)沉著。X線檢查示廣泛性骨骼骨化不全，干骺端增大呈杯口狀擴(kuò)展，多發(fā)骨質(zhì)缺損，雙側(cè)橈骨、尺骨、肋骨骨折，見(jiàn)圖1。入院初步診斷遺傳代謝性骨病，新生兒肺炎，房間隔缺損，動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，給予鼻塞持續(xù)氣道正壓輔助通氣、抗感染等治療后患兒呼吸困難逐漸加重，氧合惡化，血?dú)馓崾綪CO2進(jìn)行性升高（79.0～118.9 mmHg），家長(zhǎng)放棄治療后當(dāng)日死亡。

圖 1 患兒影像學(xué)改變

為進(jìn)一步明確診斷，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患兒家長(zhǎng)知情同意，采集患兒及家系成員外周血2 mL（EDTA抗凝血），對(duì)患兒行全外顯子組測(cè)序，結(jié)合Sanger 測(cè)序驗(yàn)證。使用BloodGen Midi Kit (CWBIO，China) 提取患兒全基因組DNA后對(duì)患兒DNA樣本進(jìn)行外顯子測(cè)序分析，參考文獻(xiàn)與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)信息，將與全部已知單基因遺傳病相關(guān)基因（共3 409種）的基因組外顯子區(qū)域定制羅氏NimbleGen捕獲探針進(jìn)行目標(biāo)基因全外顯子捕獲、建庫(kù)。采用Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)對(duì)全基因組編碼區(qū)外顯子進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)量為9 313 Mb，目標(biāo)區(qū)域覆蓋度99.83%，原始數(shù)據(jù)由Flexbar 軟件進(jìn)行初步分析。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)Burrows-Wheeler Aligner與NCBI RefSeq進(jìn)行匹配比對(duì)，通過(guò)DYDF's Analysis Pipline參照hg19人類基因組參考序列進(jìn)行行注釋；通過(guò)Provean軟件以及SIFT軟件進(jìn)行突變預(yù)測(cè)注釋。通過(guò)質(zhì)量控制、頻率及變異類別的篩選以及與疾病的相關(guān)關(guān)系，篩選出可能致病突變。根據(jù)候選致病基因所驗(yàn)證位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI 3730XL測(cè)序儀測(cè)序，基因序列分析采用DNASTAR軟件進(jìn)行序列分析和比對(duì)。經(jīng)全外顯子組檢測(cè)和Sanger驗(yàn)證顯示，患兒TNSALP基因存在一復(fù)合雜合突變，包括c.542C＞T和c.1016G＞A。c.542C＞T錯(cuò)義突變位于第6外顯子內(nèi)，即編碼區(qū)第542位堿基由C突變?yōu)門，導(dǎo)致其編碼的氨基酸序列第181位由絲氨酸突變?yōu)榱涟彼幔╬.S181L），該突變遺傳自其父親（圖2A）。c.1016G＞A錯(cuò)義突變位于第10外顯子內(nèi)，即編碼區(qū)第1016堿基由G突變?yōu)锳，導(dǎo)致其339位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)楣劝彼幔╬.G339E），該突變遺傳自其母親（圖2B）?；純焊改副硇途?。在患兒母親再次妊娠第17周時(shí)，抽取羊水并提取胎兒DNA針對(duì)已知的突變位點(diǎn)采用Sanger法進(jìn)行檢測(cè)，未檢出這兩種突變，胎兒四維彩色超聲亦未發(fā)現(xiàn)骨骼異常。

表1 TNSALP基因分析引物序列及擴(kuò)增條件

2 討論

HPP（OMIM 241510，241500，146300）是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性或隱性遺傳病，其典型癥狀為骨骼和牙齒礦化不全以及血清堿性磷酸酶活性降低，臨床表現(xiàn)輕重不一，重癥低磷酸脂酶血癥多發(fā)生于新生兒或嬰兒，發(fā)病率約為1/100 000，通常為常染色體隱性遺傳；輕癥HPP則更為常見(jiàn)，多見(jiàn)于兒童或成年人，在歐洲發(fā)病率為1/6 370[2]，可以是顯性或隱性遺傳[3,4]，該病由位于1號(hào)染色體編碼的TNSALP基因突變所致，TNSALP基因定位于 1p36.12，約50 kb大小，包含12個(gè)外顯子，編碼蛋白由507個(gè)氨基酸組成[4]。TNSALP主要的生物學(xué)功能是水解細(xì)胞外底物無(wú)機(jī)焦磷酸鹽、磷酸吡哆醛和磷酸乙醇胺，TNSALP對(duì)骨骼的礦化至關(guān)重要，其活性降低將導(dǎo)致無(wú)機(jī)焦磷酸鹽等多種底物蓄積，而礦化抑制劑無(wú)機(jī)焦磷酸鹽在骨骼蓄積將導(dǎo)致佝僂病或骨軟化[5]。TNSALP基因突變導(dǎo)致骨組織中TNSALP活性下降而造成的骨骼及牙齒發(fā)育缺陷及礦化異常。截止2017年1月7日已報(bào)道323種突變（http://www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php），73.6%為錯(cuò)義突變，其他突變包括小缺失、小插入、剪接異常等，HPP突變主要位于編碼區(qū)，95%的重型病例（圍生型和嬰兒型）經(jīng)全外顯子組測(cè)序可發(fā)現(xiàn)TNSALP基因突變，但約5%的重癥病例利用常規(guī)PCR擴(kuò)增及測(cè)序方法檢測(cè)不到外顯子及附近內(nèi)含子兩側(cè)基因異常[6]，推測(cè)可能是內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了變化，或拷貝數(shù)的變化，或大片段基因缺失等[7，8]。突變類型和突變位點(diǎn)的多樣性是HPP 臨床癥狀復(fù)雜多樣的主要原因，突變后的TNSALP酶活性的高低與低磷酸脂酶血癥癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)[9，10]。

圖2 TNSALP基因測(cè)序圖

HPP是一種異質(zhì)性較強(qiáng)的遺傳性疾病，臨床表現(xiàn)差異很大[11]，根據(jù)患兒最早出現(xiàn)癥狀的年齡和骨骼病變的嚴(yán)重程度分為6 型[12]：圍生期致死型、圍生期良性型、嬰幼兒型、兒童型、成年型及牙型，各型之間的臨床表現(xiàn)相互重疊。HPP的預(yù)后主要取決于骨骼的損害，一般來(lái)說(shuō)癥狀和體征出現(xiàn)越早預(yù)后越差[13]。圍生期致死型HPP是預(yù)后最差的一型，宮內(nèi)即出現(xiàn)廣泛的骨骼礦化障礙，前臂或腿部有皮膚包裹的骨/軟骨刺突出，生后出現(xiàn)驚厥、呼吸暫停，此型可出現(xiàn)死產(chǎn)或生后數(shù)天內(nèi)死亡，主要死于肺發(fā)育不良或佝僂病樣胸廓畸形導(dǎo)致的呼吸衰竭，其次是難治性驚厥[14]。本例患兒為中國(guó)蒙古族男性，其父母表型均正常，非近親結(jié)婚，家族無(wú)類似病史，臨床主要表現(xiàn)為多發(fā)性病理性骨折、肢體活動(dòng)障礙、呼吸困難、放射影像學(xué)顯示骨骼廣泛的礦化不良、佝僂病樣改變伴有病理性骨折，血清堿性磷酸酶明顯降低，經(jīng)全外顯子組測(cè)序和一代測(cè)序驗(yàn)證顯示患兒TNSALP基因存在復(fù)合雜合突變，最終診斷圍生期致死型HPP。目前已報(bào)道的HPP均為純合子點(diǎn)突變或復(fù)合雜合子突變，圍生型HPP和嬰兒型HPP通常為復(fù)合雜合子突變[15]，偶有純合子[16]。本例患兒亦為復(fù)合雜合子突變。本研究發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變c.542C＞T為已報(bào)道的致病突變[10,17]，突變位于第6外顯子內(nèi)，即編碼區(qū)542位出現(xiàn)雜合性改變C＞T，導(dǎo)致其編碼絲氨酸改變?yōu)榱涟彼幔╬.S181L），父親也攜帶相同的雜合突變c.542C＞T，而母親沒(méi)有。c.1016G＞A錯(cuò)義突變位于第10外顯子內(nèi)，即編碼區(qū)1016位點(diǎn)出現(xiàn)雜合性改變G＞A導(dǎo)致甘氨酸改變?yōu)楣劝彼幔╬.G339E），母親也攜帶相同的雜合突變，而父親沒(méi)有，該突變也是已知的致病突變，最早由Simon-Bouy 等[18]報(bào)道；患兒的復(fù)合雜合突變分別源自父母，父母均攜帶一個(gè)雜合突變，但表型均正常，符合常染色體隱性遺傳方式，即僅有1個(gè)等位基因發(fā)生改變的只是攜帶者，而不會(huì)出現(xiàn)疾病表型；當(dāng)患兒出現(xiàn)2個(gè)等位基因改變(一個(gè)純合突變或復(fù)合雜合突變)時(shí)，沒(méi)有正常的編碼蛋白執(zhí)行正常功能，從而出現(xiàn)臨床癥狀[19]。由于該患兒的同胞中1/4個(gè)體有發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，因此母親再次妊娠進(jìn)行遺傳咨詢時(shí)，根據(jù)先證者的突變類型進(jìn)行產(chǎn)前診斷，羊水穿刺基因檢測(cè)顯示本次懷孕胎兒未攜帶這兩種突變，不存在HPP。

HPP是一種需要與許多疾病鑒別的罕見(jiàn)病，不同類型的HPP臨床表現(xiàn)差異很大，診斷有時(shí)不易，不能僅依據(jù)生化指標(biāo)，需要結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行判斷，否則易誤診[20]，確診最終有賴于基因檢測(cè)。相對(duì)比較敏感的生化指標(biāo)是血清或骨堿性磷酸酶下降，尿磷酸乙醇胺升高，血清5’-磷酸吡哆醛升高，但這些指標(biāo)均為非特異性指標(biāo)[13]，即使是在HPP的患者，堿性磷酸酶也可在正常范圍[21]。本研究選擇高通量的二代測(cè)序技術(shù)對(duì)患兒樣本進(jìn)行全外顯子組測(cè)序基于以下原因：首先患兒疑似診斷為HPP，但仍需與其他遺傳代謝性骨病鑒別，其次由于HPP已知致病基因TNSALP包含12個(gè)外顯子的編碼序列，已經(jīng)有多個(gè)已知突變位點(diǎn)被鑒定，用Sanger測(cè)序法對(duì)已知突變進(jìn)行逐一篩選將消耗大量的時(shí)間和財(cái)力。

國(guó)內(nèi)迄今尚無(wú)關(guān)于圍生期致死型HPP的報(bào)道，產(chǎn)前診斷的研究也很少，有少數(shù)嬰兒型HPP及基因分析報(bào)道[19,22]。本研究通過(guò)分析患者的臨床特征、常規(guī)生化和特定遺傳生化代謝特點(diǎn)，并結(jié)合基因分析、家系和產(chǎn)前分析，進(jìn)行了初步的研究，基因檢測(cè)顯示TNSALP基因的1個(gè)復(fù)合雜合突變c.542C＞T突變和c.1016G＞A 突變是該家系HPP患兒的致病基因，TNSALP基因分析可應(yīng)用于HPP產(chǎn)前診斷，但由于病例數(shù)量不多，而且目前分析報(bào)道的家系及基因分析比較少，還需積累更多的病例及家系，以便為有家族史的個(gè)體進(jìn)行產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢提供理論依據(jù)。

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(本文編輯：鄒 強(qiáng))

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Clinical and genetic analysis of a family with low alkaline phosphatase

LU Weicheng1, SHI Congcong2, CAI Dong1,ZHENG Xu1, HAO Hu2, XIAO Xin2(1.Department of Neonatology, Hainan People’s Hospital, Haikou 570311, Hainan, China;2.Department of Pediatrics, The Sixth Affiliated Hospital of SunYat-Sen University, Guangzhou 510655, Guangdong, China)

ObjectiveTo investigate the role of TNSALP gene detection in prenatal diagnosis of HPP. Method The clinical data and the results of complete exon sequencing of TNSALP gene in one neonate with low alkaline phosphatase (HPP)were analyzed retrospectively. Peripheral bloods from his family members were collected. The amniotic fluid cell in fetuses at 17 weeks was tested for candidate gene mutations by Sanger sequencing.ResultsMainly manifestations in 6-day-old baby were multiple fractures, limb shortening and bending and dyspnea. He died of respiratory failure 9 days after birth. The serum alkaline phosphatase was decreased and serum calcium was decreased slightly; serum phosphorus, serum 25 hydroxyvitamin-D and parathyroid hormone were normal. X-ray showed that the whole body bone was very poorly mineralized, and the long diaphysis was enlarged with shape of a cup at the end and multiple fractures existed. Gene sequencing revealed a complex heterozygous missense mutation in the TNSALP gene, including the heterozygous missense mutation c.542C＞T in exon sixth causing 181st amino acids changed from serine to leucine (p.S181L), and tenth exon heterozygous missense mutation in c.1016G＞A causing 339th amino acid changed from glycine to glutamic acid (p.G339E). The parental phenotypes were normal. The c.542C＞T mutation is inherited from his father and the c.1016G＞A mutation is inherited from his mother. These two mutations were not detected in the fetus. Conclusion TNSALP gene analysis can be applied to the diagnosis and prenatal diagnosis of HPP.

low alkaline phosphatase; tissue nonspecific alkaline phosphatase gene; mutation; prenatal diagnosis

2017-02-13)

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.09.012

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