□ 徐武俊 呂騰飛 李仕祥 劉偉平 江西出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心

大腸菌群平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果不確定度的評(píng)定

□ 徐武俊 呂騰飛 李仕祥 劉偉平 江西出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心

通過(guò)對(duì)《GB 4789．3-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》第二法平板法中不確定度來(lái)源進(jìn)行分析和計(jì)算，得出檢測(cè)結(jié)果的不確定度為U=0．057 54，k=2．26，主要影響因素是樣品制備、樣品稀釋、加樣和重復(fù)檢測(cè)，其中重復(fù)檢測(cè)對(duì)檢測(cè)結(jié)果不確定度的貢 獻(xiàn)最大。

大腸菌群；平板計(jì)數(shù)法；不確定度

大腸菌群是一組存在于腸道中的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，通常用來(lái)作為評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生狀況的指示菌。食品中大腸菌群數(shù)量的高低與受糞便污染的程度相關(guān)，大腸菌群也可以預(yù)示食品中存在腸道致病菌的可能性。由測(cè)量所得的測(cè)得值只是被測(cè)量的估計(jì)值，測(cè)量過(guò)程中的隨機(jī)效應(yīng)及系統(tǒng)效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致測(cè)量不確定度[1]。對(duì)大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)定，能以充分完整的信息表示檢測(cè)結(jié)果，提高大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的可信度。

1 不確定度評(píng)定方法

采用《GB 4789.3-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》[2]中第二法平板法進(jìn)行檢測(cè)，主要檢測(cè)步驟如下：樣品制備—10倍梯度稀釋—選取2～3個(gè)合適稀釋度的樣品勻液接種—傾注VRBA平板—計(jì)數(shù)典型和可疑菌落數(shù)—接種BGLB肉湯—報(bào)告結(jié)果。本文對(duì)奶粉樣品進(jìn)行大腸菌群人工污染后進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)定，以此結(jié)果為依據(jù)，分析不確定度各分量的來(lái)源和大小，并參照J(rèn)JF1059.1-2012《測(cè)量結(jié)果不確定度的評(píng)定與表示》做不確定度評(píng)定。

2 各不確定度分量的評(píng)定

2.1 樣品制備過(guò)程中引入的不確定度

樣品制備過(guò)程中，可能引入不確定度的因素有樣品稱量、量筒量取稀釋液、均質(zhì)器均質(zhì)等。用均質(zhì)器進(jìn)行拍擊均質(zhì)，拍擊時(shí)間和拍擊速度是固定的，可以忽略由此產(chǎn)生的不確定度。

電子天平精度0.1 g，樣品稱樣量25.0 g，檢定證書(shū)規(guī)定的最大允許誤差為±0.5 g。則天平稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度μ（m樣）為：

用250 mL量出式量筒量取225 mL稀釋液，制成1︰10的樣品勻液。量筒按JJG196-2006常用玻璃量器的容量允差為±2.0 mL[3]，則量筒量取的標(biāo)準(zhǔn)不確定度μ（v樣）為：

因此，電子天平和量筒的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（m樣）和Urel（v樣）分別為：

則樣品制備過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 樣品稀釋過(guò)程中引入的不確定度

用1 mL和10 mL的移液器稀釋樣品。根據(jù)《JJG646-2006移液器檢定規(guī)程》規(guī)定，1 mL可調(diào)移液器吸取1 mL時(shí)，容量允差為±1.0%；10 mL可調(diào)移液器吸取10 mL時(shí)，容量允差為±0.6%[4]。由此計(jì)算它們的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度和分別為：

則稀釋步驟產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（稀釋）為：

樣品進(jìn)行系列梯度稀釋時(shí)，每一步的稀釋方法相同，則：

其中，k為10倍系列稀釋的次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)為稀釋1 000倍的平板計(jì)數(shù)結(jié)果，取k=3，則：

2.3 樣品加樣體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

取適宜稀釋度樣品1 mL接種無(wú)菌平皿中，則加樣過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度Urel（加樣）=Urel（V移液器1 mL），為0.005 774。

2.4 重復(fù)檢測(cè)產(chǎn)生的不確定度

重復(fù)檢測(cè)引起的不確定度，是影響檢測(cè)結(jié)果的重要原因。對(duì)同一樣品重復(fù)檢測(cè)10次，檢測(cè)結(jié)果及分析見(jiàn)表1。由表1可得合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 合成不確定度

合成不確定度是由樣品制備、樣品稀釋、加樣和重復(fù)檢測(cè)所產(chǎn)生的不確定度分量合并計(jì)算得到：

表1 10次重復(fù)測(cè)定大腸菌群的結(jié)果表

2.6 相對(duì)擴(kuò)展不確定度

取包含區(qū)間P=95%，自由度v=9時(shí)，查表知包含因子k=2.26，故相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

U擴(kuò)展=k×U合成=2.26×0.02546=0.05754

此時(shí)，lgX=4.409 9±0.057 54

2.7 不確定度報(bào)告

在報(bào)告大腸菌群檢測(cè)結(jié)果時(shí)，應(yīng)包含檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)展不確定度和包含因子。本文中大腸菌群平板計(jì)數(shù)結(jié)果4.352 36≤lgX≤4.467 44，即22 509≤X≤29 339，本次檢測(cè)大腸菌群的取值為22 500～29 300。

3 結(jié)論

大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果受很多因素的影響，本文主要分析了檢測(cè)結(jié)果影響較大或者可以計(jì)算的因素，如樣品制備、樣品稀釋、加樣和重復(fù)檢測(cè)等。除了這些因素以外，其他的一些因素也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，如樣品的保存狀況、培養(yǎng)基質(zhì)量、傾注平板時(shí)培養(yǎng)基的體積、檢測(cè)操作過(guò)程中環(huán)境的溫度、培養(yǎng)時(shí)間和溫度等[5]。這些因素中有些因素對(duì)總不確定度的貢獻(xiàn)很小，有些因素的影響無(wú)法進(jìn)行定量計(jì)算，可以通過(guò)統(tǒng)一規(guī)范的操作來(lái)盡可能減少由此產(chǎn)生的不確定度。

通過(guò)本文的分析可知，大腸菌群平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果不確定度為U=0.057 54，k=2.26，主要影響因素是樣品制備、樣品稀釋、加樣和重復(fù)檢測(cè)，其中重復(fù)檢測(cè)對(duì)檢測(cè)結(jié)果不確定度的貢獻(xiàn)最大。

[1]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局．JJF 1059．1-2012 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013．

[2]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局．GB 4789．3-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017．

[3]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局．JJG 196-2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程[S]．北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2006．

[4]全國(guó)流量容量計(jì)量技術(shù)委員會(huì)．JJG646-2006中華人民共和國(guó)國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程移液器[S]．北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2007．

[5]胡 ，丁武，李素芳．食品的菌落數(shù)檢測(cè)結(jié)果不確定度之評(píng)定[J]．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008(8)：1494-1497．