馮 豪, 張建國

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093)

利用深黃傘形霉生產(chǎn)油脂的研究進展

馮 豪, 張建國

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093)

總結(jié)了深黃傘型霉的不飽和脂肪酸含量高、品種多、易培養(yǎng)的優(yōu)點.介紹了運用化學(xué)誘變和基因工程技術(shù)對深黃傘形霉菌種的選育和改造,以及深黃傘形霉產(chǎn)油脂的培養(yǎng)工藝和提取工藝的研究成果.研究表明,深黃傘型霉是產(chǎn)生油脂的優(yōu)良菌種,為深黃傘形霉生產(chǎn)油脂和不飽和脂肪酸提供基礎(chǔ).

深黃傘形霉; 不飽和脂肪酸; 油脂; 菌種選育; 培養(yǎng); 提取

油脂是人類生活和生產(chǎn)活動中不可缺少的物質(zhì),油脂中的不飽和脂肪酸對人體健康有重要作用[1].研究表明,不飽和脂肪酸能預(yù)防心血管疾病、高血壓、II型糖尿病、骨質(zhì)疏松、癌癥、炎癥、免疫缺陷癥等[2].但是,我國油脂供應(yīng)處于短缺的現(xiàn)狀,據(jù)統(tǒng)計,2014年我國食用油消費量達3 167.4萬t,人均食用油消費量為23.2 kg,但自給率不足40 %[3].為了解決油脂匱乏的問題,微生物油脂已經(jīng)作為油脂供應(yīng)的新來源引起了人們的重視.微生物油脂是指利用富油微生物積累的油脂.通常,微生物細(xì)胞體內(nèi)合成和貯存油脂超過細(xì)胞干重20 %的微生物被稱為富油微生物.人們利用富油微生物以生物質(zhì)為原料積累油脂,進行生物質(zhì)材料的循環(huán)利用.微生物油脂也被當(dāng)作一種重要的可再生能源被廣泛重視.微生物積累油脂的主要優(yōu)點有:a.微生物可以常年培養(yǎng),不受季節(jié)限制,代增周期為20 min到2 d.而植物的生長受到氣候的影響,一年內(nèi)的生長周期受到嚴(yán)格限制[4];b.微生物可以進行液體的深層培養(yǎng),不受場地的限制,大大節(jié)約了土地的使用;c.微生物可以多種糖為原料,甚至可以直接利用生物質(zhì)原料,促進了生物質(zhì)廢物的循環(huán)利用,變廢為寶[5];d.微生物油脂的含量和組成可以根據(jù)條件進行控制,有利于滿足對油脂品質(zhì)的要求[6];e.微生物的種類多,細(xì)菌、酵母、霉菌和藻類中都有產(chǎn)油菌株,但霉菌類真核產(chǎn)油微生物積累的油脂成分與常規(guī)植物油更接近[7].微生物油脂也有亟待改進的方面:a.目前富油微生物的品種繁多,富油微生物存在于原核生物、真核生物中,研究也比較分散;b.市場上對微生物油脂的認(rèn)可度還有待于提高.

深黃傘形霉(Umbelopsisisabellina),曾被命名為深黃被孢霉(Mortierelaisabellina)屬于毛霉目,是一種絲狀真菌,菌絲形態(tài)可以根據(jù)培養(yǎng)條件而改變,是一種著名的富油微生物種類.2003年Meyers等利用限制性片段長度差異性(RFLP)和 轉(zhuǎn)錄空間序列分析技術(shù)(ITS1)鑒定深黃傘形霉不屬于被孢霉[8].這個結(jié)果也在2014年深黃傘形霉基因組測序之后被證實.曾經(jīng)命名為深黃被孢霉的著名富油菌株NBRC7884的基因組中76.1%蛋白質(zhì)和拉曼傘形霉(Umbelopsisramanniana)同源[9].深黃傘形霉的含油量可高達86%[10].深黃傘形霉的積累油脂工藝和機制已被很多學(xué)者關(guān)注、優(yōu)化、解釋.深黃傘形霉作為一種富油微生物,菌絲油脂含量較高,能在5～35 ℃的溫度范圍內(nèi)生長.低溫能引起深黃傘形霉中合成多不飽和脂肪酸相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化,并且增強Δ6-脂肪酸脫氫以及碳鏈延長的作用,促進不飽和脂肪酸的合成[11].毒力研究表明,深黃傘形霉發(fā)酵生產(chǎn)油脂是安全的.日本、歐洲已有利用深黃傘形霉生產(chǎn)脂肪酸產(chǎn)品上市.迄今,國內(nèi)外已有大量深黃傘形霉的研究,采用壓榨和化學(xué)提取的方法生產(chǎn)油脂,存在污染環(huán)境、有害雜質(zhì)含量多、易變質(zhì)等問題.綠色提取技術(shù)也是現(xiàn)代生物技術(shù)的必要組成部分.本文總結(jié)了深黃傘形霉積累油脂的研究進展,分析了深黃傘形霉作為食用油脂來源的壁壘,展望了深黃傘形霉生產(chǎn)食用油脂的前景.

1 深黃傘形霉的特點

1.1 富含不飽和脂肪酸

深黃傘形霉積累的油脂主要的脂肪酸組分為C18和C16脂肪酸，而且不飽和脂肪含量高,主要有油酸、亞油酸、亞麻酸.深黃傘形霉的不飽和脂肪酸組成受到培養(yǎng)條件的影響，不飽和脂肪酸含量可達50%～90%.表1總結(jié)了深黃傘形霉中脂肪酸組成成分.C18∶1是深黃傘形霉不飽和脂肪酸中的一個重要組分.多數(shù)條件下C18∶1的比例為51.64%～56.2%[12].利用預(yù)處理后的花旗松為原料培養(yǎng)深黃傘形霉中C18∶1的比例可高達63.4%[13].固態(tài)培養(yǎng)時C18∶1的比例為20%左右[14].以蔗糖為底物時,比例低至1.24%[15].不同培養(yǎng)方式中不飽和脂肪酸種類的比例也發(fā)生變化，但是,不飽和脂肪酸的總比例依然高達50%～90%.深黃傘形霉也含有花生三烯酸(C20∶3,6)、花生四烯酸(C20∶4,6)、二十二碳六烯酸(C22∶3,3)[16].

1.2 優(yōu)良菌種眾多

目前已經(jīng)報道很多種深黃傘形霉可以積累高含量的油脂.比較突出的是Suzuki報道的NBRC7884菌株積累的油脂占細(xì)胞干重的86%[10].我國很多學(xué)者也從我國的微生物菌種庫中篩選油脂含量高的深黃傘形霉.例如,中國典型微生物保藏中心的CCTCC NO:M2010195可以積累高含量的γ-亞麻酸(10%)[24].CCTCC:M 2012152的油脂包含20%～37.3% α-亞油酸、8.5%～10.3% γ-亞油酸[25].為了提高深黃傘形霉中油脂的含量,采用菌種突變進行優(yōu)良菌種選育是常用而且有效的方法.表2總結(jié)了目前對深黃被孢霉富油菌突變和菌種改造的結(jié)果.紫外線誘變是使用最多的突變方法.而且紫外線與其他化學(xué)試劑聯(lián)合誘變的研究較多[26-28].突變后油脂含量可高達61.47%.硫酸二乙酯和Co60也可以對深黃傘形霉進行誘變[29].文獻[30]以Co60輻射誘變深黃傘形霉,篩選得到的突變菌株經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)后,生物量為51.31 g/L,含油率為39.547%,不飽和脂肪酸含量占85.71%.γ-亞麻酸是人和動物食物中重要的多烯不飽和脂肪酸.大多數(shù)油料作物種子中不含有γ-亞麻酸,因此,高產(chǎn)γ-亞麻酸的深黃傘形霉菌株一直是篩選的目標(biāo).李明春等對深黃傘形霉原生質(zhì)體紫外線誘變.紫外線(UV)照射45 s后獲得高產(chǎn)突變株HM23,比對照組M6-22菌的γ-亞麻酸產(chǎn)量提高了70.7%[31].通過紫外線和氯化鋰聯(lián)合誘變得到γ-亞麻酸含量高達6.39%的SHFU-13菌株[32].紫外線和硫酸二乙酯聯(lián)合突變得到γ-亞麻酸含量高達10.97%的H3.3410-5菌株[33].陳波等采用紫外線誘變,獲得了深黃傘形霉突變株M80,其菌體質(zhì)量濃度達25.10 g/L、γ-亞麻酸產(chǎn)量達771.88 mg/L[34].郝冉等[35]和劉勝男等[36]分別采用突變育種得到的高產(chǎn)深黃傘型霉菌株產(chǎn)量分別能達到889 mg/L和1 236 mg/L.

表1 目前報道的深黃傘形霉油脂組分分布Tab.1 Lipid profiles of different Umbelopsis isabellina strains %

表2 深黃傘形酶菌株育種的總結(jié)Tab.2 Summary of the strain breeding of Umbelopsis isabellina

花生四烯酸是人體大腦和視神經(jīng)發(fā)育的重要物質(zhì),對提高智力和增強視敏度具有重要作用.文獻[14]對野生型深黃傘形霉3410孢子進行紫外線誘變,篩選得到高產(chǎn)花生四烯酸MS-1菌株,產(chǎn)量比原菌株提高了2倍多[14].化學(xué)誘變深黃傘形霉后得到突變菌株W35s2-153，Y-69，YZ-124、Δku80.它們的花生四烯酸的產(chǎn)量分別為2.61[37],2.92[38],4.72[39],0.26 mg/g[40].

1.3 易培養(yǎng)且用途多

首先,深黃傘形霉可以利用多種多樣的碳源,所以,深黃傘形霉的底物來源就比較廣泛[42].邢大輝等分別以葡糖糖、木糖、果糖和阿拉伯糖作為唯一糖源時,深黃傘形霉都能夠生長并進行油脂的積累[43].Ruan等還以葡萄糖和木糖混合糖作為碳源,深黃傘形霉也能生長[18].另外,Ruan等以葡萄糖和木糖混合糖為碳源時,不同的混合比例對脂肪酸成分影響不大,糖濃度與油脂的積累呈正相關(guān)[18].而且,Papanikolaou 研究高糖質(zhì)量濃度(100 g/L)時,同樣呈現(xiàn)良好的細(xì)胞生長[44].但是,在氮源限制的條件下,深黃傘形霉在以木糖、甘油和葡萄糖為碳源時的油脂積累過程明顯不同.Ruan等通過C-13追蹤實驗表明,深黃傘形霉能同時利用葡萄糖和乙酸鹽,乙酸鹽主要參與油脂合成和TCA循環(huán)過程.而且,深黃傘形霉對葡萄糖降解能力很強,對木糖利用較弱[23].另外,以丁醇、十六醇和十八醇作為碳源添加到培養(yǎng)基中,證明都能被深黃傘形霉利用然后轉(zhuǎn)化成油脂[45].深黃傘形霉能利用的碳源有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖等.但是,深黃傘形霉不能利用蔗糖[46].深黃傘形霉也可以用生物質(zhì)原料為底物,將粗原料轉(zhuǎn)化為油脂,降低了生產(chǎn)成本,變廢為寶.而且,深黃傘形霉可以利用未脫毒的秸稈酸水解液生長,比相同濃度下的商業(yè)碳源更有利于油脂積累.但是,深黃傘形霉沒有纖維素酶,所以,不能利用纖維素.因此,需要對生物質(zhì)進行預(yù)處理,然后再進行深黃傘形霉的培養(yǎng)并積累油脂是目前共同的策略.Harde等以酸性亞硫酸鹽預(yù)處理道格拉斯冷杉(Douglas Fir),不另外添加營養(yǎng)物質(zhì)的條件下培養(yǎng)深黃傘形霉積累的油脂組分與植物油的組分相似[13].Zhang等利用稀酸水解玉米秸的水解液培養(yǎng)深黃傘形霉,雖然水解液產(chǎn)生了抑制劑(0.3 g/L糠醛、1.2 g/L羥甲基糠醛和1 g/L 4-羥基苯甲酸),但是,深黃傘形霉仍然可以正常生長,將40%的糖轉(zhuǎn)化為油脂.油脂產(chǎn)量達到6.46 g/ L[42].另外,Zhang等還利用酶水解大豆皮培養(yǎng)深黃傘形霉,成功地將大豆皮轉(zhuǎn)化為富含76.82 %不飽和脂肪酸的油脂[47].這些研究都為今后深黃傘形霉利用生物質(zhì)生產(chǎn)油脂提供了支持,所以,深黃傘形霉被當(dāng)作生產(chǎn)生物柴油的潛在菌株.Meeuwse以深黃傘形霉固態(tài)發(fā)酵的方式利用生物質(zhì)積累油脂[48].深黃傘形霉還可以降解生物質(zhì)內(nèi)的環(huán)境污染物.莠去津是廣泛存在于玉米、甘蔗、草皮、闊葉樹的殺蟲劑.它可以影響魚類、兩棲動物、浮游植物、甚至人類的身體健康,是一種環(huán)境污染物.深黃傘形霉降解莠去津,減少生物質(zhì)中污染物的積累[49].壬基苯酚(NP)、4-叔-辛基酚(4-t-OP)、4-肉桂苯酚 (4-CP)也是環(huán)境中的污染物.深黃傘形霉可以在12 h內(nèi)降解90%以上的壬基苯酚和4-叔-辛基酚,6 h內(nèi)降解90%的4-肉桂苯酚[50].這些研究表明,深黃傘形霉具有不受一些環(huán)境污染物的抑制積累油脂的潛力.

2 深黃傘形霉基因工程技術(shù)

基因工程技術(shù)是一種非常有潛力的提高深黃傘形霉性能的手段.相對于化學(xué)誘變,基因工程技術(shù)更具有目的性和操控性.Wei等以潮霉素B磷酸酶基因建立了一種高效轉(zhuǎn)化方法,得到了重組深黃傘形霉[51].張學(xué)煒等用潮霉素B抗性的PD4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到深黃傘形霉M6-22-4 原生質(zhì)體中,31.6%轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出不同的潮霉素B抗性.通過PCR和DNA印跡證明PD4質(zhì)粒已經(jīng)整合到深黃傘形霉的基因組中[52].改造深黃傘形霉的多不飽和脂肪酸積累途徑也是研究熱點,Zhang等通過同源重組的方式敲除深黃傘形霉的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因,證明了Δ6-脂肪酸脫氫酶是深黃傘形霉積累亞麻酸的必要基因[53].深黃傘形霉中的脂肪酸代謝基因也被逐漸鑒定和利用.劉莉等將深黃傘形霉的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因重組到釀酒酵母菌株中,利用釀酒酵母成功合成亞麻酸[54].李明春等將深黃傘形霉的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)入到大豆中,在RNA水平上證明了Δ6-脂肪酸脫氫酶基因成功表達,積累了高達27.07% γ-亞麻酸的脂肪酸[55].Li等將深黃傘形霉的Δ12-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌和釀酒酵母中,成功積累了亞麻酸[56].隨著深黃傘形霉在分子水平上研究的深入,對其眾多基因的功能進行了鑒定.這些研究一方面為利用深黃傘形霉積累油脂提供有力的理論依據(jù)；另一方面也能為利用深黃傘形霉積累油脂提供科學(xué)的指導(dǎo).

3 深黃傘形霉的油脂積累過程

深黃傘形霉的生長和油脂合成、積累過程有著自己的規(guī)律.建立深黃傘形霉生長模型能幫助人們預(yù)測它的生長狀態(tài),了解油脂的合成和積累的情況.Meeuwse等建立了深黃傘形霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)油的動力學(xué)模型.氧的限制使菌體呈線性生長[57],Meeuwse等還建立了深黃傘形霉在液態(tài)培養(yǎng)基中生長和油脂積累的模型.模型顯示,深黃傘形霉的生長在碳源和氮源充足時為指數(shù)生長期,當(dāng)?shù)春谋M時促進油脂的合成[48].Papanikolaou等發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基氮源耗盡后,添加Fe3+、酵母提取液或Mg2+更能促進油脂的積累.葡萄糖耗盡時脂肪酸會降解.添加一些營養(yǎng)物和離子能降低油脂的降解.油脂積累期,菌體內(nèi)的異檸檬酸脫氫酶活性較低.碳源過量時,只有在細(xì)胞中沒有異檸檬酸脫氫酶和輔酶時才積累脂肪酸[58].深黃傘形霉所積累油脂成分會隨菌齡不同而發(fā)生變化.Fakas等發(fā)現(xiàn)未成熟的菌絲含有豐富極性脂肪(糖脂加鞘脂類和鞘脂類),極性脂肪中多不飽和脂肪酸占40%.成熟菌絲的中性脂肪中多不飽和脂肪酸含量降低到30%以下[59].另外,Gao等通過加入不同濃度的硅酸鎂顆粒獲得了不同深黃傘形霉的形態(tài)結(jié)構(gòu)(不同粒徑大小的深黃傘形霉顆粒、游離分散的菌絲體、破碎的菌絲片段),發(fā)現(xiàn)在不同的顆粒/菌絲聚集體中油脂也呈現(xiàn)出不同的空間分布,游離分散的菌絲體中有著較高的油脂含量.這些研究結(jié)果為推測其形態(tài)發(fā)育過程中油脂生物合成的分子機制提供了依據(jù)[22].

4 深黃傘形霉油脂的提取

提取是油脂生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié),但是,由于工藝和技術(shù)等條件限制,往往存在著出油率不高、污染環(huán)境、溶劑殘留等問題.因此,油脂提取的方法和相關(guān)工藝技術(shù)的優(yōu)化是非常有必要的.Hussain等比較了己烷-異丙醇、二氯甲烷-甲醇、Bligh-Dyer法、己烷法對油脂提取的效果,表明Bligh-Dyer法提取脂質(zhì)效果最好[21].Bligh-Dyer法成為目前常用的油脂提取方法.Wu等通過正交試驗優(yōu)化了反應(yīng)時間、提取溫度、KOH濃度、固液比例，明顯提高了提取效率[60].環(huán)境友好的油脂提取方法是現(xiàn)代工業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分.薛冬樺等以硫酸輔助攪拌和加熱得到脫酸油脂,進而加入氫氧化鉀進行分離,油脂產(chǎn)率達到71.57%～93.20%[61].這種提取方法對環(huán)境友好、簡單易控、反應(yīng)條件溫和、經(jīng)濟性好.其他輔助措施也會增加油脂的提取效果.鮑傳穩(wěn)等利用微波(420 W,2 min)提升了細(xì)胞破碎效果,提高了油脂提取率[62].Zhou等采用超聲輔助進行萃取，明顯提高萃取效果,增加油脂產(chǎn)量[63].隨著油脂提取方法的革新、技術(shù)的優(yōu)化改進,提取工藝向著更加綠色環(huán)保的方向發(fā)展,為油脂提取提供更有效的方法.

5 深黃傘型霉油脂的安全性

深黃傘形霉的油脂安全性較好.陳濤等利用深黃被孢霉AS3.3410菌體,按照每千克體重給20 mg的劑量給小鼠一次性灌胃14 d.結(jié)果表明,雄性小鼠組和雌性小鼠組體重增長值均高于其相應(yīng)的對照組,且未見受試小鼠死亡或有毒性反應(yīng)[64].Nisha對絲狀真菌的花生四烯酸進行急性和亞慢性口服毒性實驗探究.急性毒實驗的結(jié)果表明,LD50大于5 000 mg/kg.在13周的亞慢性研究中發(fā)現(xiàn),喂食組的雌鼠的大腦、卵巢等器官相對重量指標(biāo)變化顯著,血紅蛋白濃度降低,白細(xì)胞數(shù)升高,血清甘油三酯降低,堿性磷酸酶活性增加,沒有伴隨相關(guān)組織病理學(xué)改變,因此,這些油脂是安全的[65].

6 展 望

深黃傘形霉生產(chǎn)油脂工藝流程主要包括菌株篩選、菌體培養(yǎng)、菌體收集、油脂提取、油脂的后加工等.與傳統(tǒng)油脂生產(chǎn)工藝相比,利用深黃傘形霉生產(chǎn)油脂有著明顯的優(yōu)勢,具有重要戰(zhàn)略意義.深黃傘形霉作為一種優(yōu)秀的產(chǎn)油微生物,為生產(chǎn)微生物油脂提供了一定的選擇空間.隨著基因工程在微生物中應(yīng)用的拓展,人們實現(xiàn)了通過基因操作研究深黃傘形霉特定基因功能,定向定量分析其特定基因的功能，幫助人們更加深入地認(rèn)識深黃傘形霉.生物質(zhì)碳源作為深黃傘形霉油脂積累過程中最重要的營養(yǎng)物質(zhì)一定程度上降低了生產(chǎn)成本，所以，深黃傘形霉積累油脂非常具有應(yīng)用潛力.

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(編輯:石 瑛)

Review of Lipid Accumulation Utilizing Filamentous FungiUmbelopsisIsabellina

FENG Hao, ZHANG Jianguo

(SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)

Umbelopsisisabellinais a potential microbe for lipid accumulation.In order to figure out the situation about lipid production utilizingUmbelopsisisabellina,the advantages of high content of polyunsaturated fatty acid (PUFA),varied strains and easy cultivation forUmbelopsisisabellinawere summarized.In addition,the chemical mutation and genetic manipulation promote the strain development for even high lipid production.The optimization of cultivation process and extraction process provide a bright future ofUmbelopsisisabellinain lipid production.

Umbelopsisisabellina;polyunsaturatedfattyacid;lipid;straindevelopment;cultivation;extraction

1007-6735(2017)04-0381-08

10.13255/j.cnki.jusst.2017.04.013

2017-06-12

教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金(2013);國家自然科學(xué)基金資助項目(21306112)

馮 豪(1991-),男,碩士研究生.研究方向:微生物工程.E-mail:1983802443@qq.com

張建國(1978-),男,副教授.研究方向:微生物工程.E-mail:jgzhang@usst.edu.cn

TS 221

A