吉文玉 蔡寧 楊思培

微小核糖核酸592對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞凋亡影響的機(jī)制

吉文玉 蔡寧 楊思培

目的 探討微小核糖核酸592(miR-592)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251凋亡的影響。方法 首先通過定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析miR-592在28份神經(jīng)膠質(zhì)瘤與其臨近癌旁組織中的表達(dá)水平；隨后向U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-592的擬合物，并通過流式細(xì)胞技術(shù)分析miR-592過表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響；通過生物信息學(xué)分析找到miR-592的潛在靶分子，并通過熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)以及蛋白免疫印跡法等進(jìn)行驗(yàn)證；進(jìn)一步轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞Runx2的下調(diào)siRNA，繪制細(xì)胞的生長曲線，檢測(cè)U251細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果 對(duì)28份神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常組織的定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，miR-592在腫瘤組織中明顯低表達(dá)； miR-592過表達(dá)能明顯抑制U251細(xì)胞的生長；流式細(xì)胞分析顯示，miR-592顯著促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡：對(duì)照組晚期凋亡率為(7.2±0.68)%，而轉(zhuǎn)染miR-592組晚期凋亡率為(17.47±1.45)%；熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)以及蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-592直接靶向Runx2的3’-UTR來抑制Runx2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論 miR-592通過直接靶向Runx2來誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤 U251 miR-592 凋亡 Runx2

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最為常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。50%～60%的腦部惡性腫瘤都是膠質(zhì)瘤[1]。對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤現(xiàn)有的治療策略主要是手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療或其他方式的輔助性治療[2-4]。然而，高轉(zhuǎn)移率和對(duì)放化療的耐受性使得膠質(zhì)瘤的預(yù)后效果都很差[5-7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸592(miR-592)在膠質(zhì)瘤組織中相對(duì)于癌旁組織明顯表達(dá)降低。為了進(jìn)一步探究miR-592在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中作用機(jī)制，本研究應(yīng)用miR-592 mimics上調(diào)miR-592在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中U251中的表達(dá)水平，探討其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和凋亡的影響，并進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)尋找miR-592的靶分子。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞為蘇州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室自有，28份神經(jīng)膠質(zhì)瘤和癌旁組織為蘇州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院自2012年4月～2015年7月所收集神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本，均經(jīng)病理檢查證實(shí)，且已經(jīng)過患者或家屬知情同意。RPMI-1640培養(yǎng)基和FBS為美國Gibco公司產(chǎn)品，噻唑藍(lán)、二甲基亞砜(DMSO)為美國Sigma公司產(chǎn)品，Runx2單克隆抗體購自于Abcam公司，熒光素酶檢測(cè)試劑盒購自于Promega公司，酶標(biāo)檢測(cè)儀為德國MD公司產(chǎn)品，Lipofectamine 2000、Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，miR-592 mimics和siRNA購自于上海吉?jiǎng)P基因公司，miR-592和Runx2定量檢測(cè)試劑盒為德國QIAGEN公司產(chǎn)品。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒為美國ABI產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，PI和Annexin V凋亡染色試劑盒也為美國BD公司產(chǎn)品，其他相關(guān)質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室自有。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251以10%的胎牛血清RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2、相對(duì)濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；用0.25%的胰酶消化，每2 d換液傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(噻唑藍(lán)) 以每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞貼壁后向細(xì)胞轉(zhuǎn)染100 nmol/L的miR-592 mimics或者Runx2的siRNA，以隨機(jī)序列的mimic作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，Runx2的siRNA序列為Runx2 siRNA：5′-GCACGCUAUUAAAUCCAAATT-3′；12 h后進(jìn)行第1次檢測(cè)，每孔加入5 g/L的噻唑藍(lán)液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)到4 h后去掉培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μl，用酶標(biāo)儀在490 nm檢測(cè)吸光值；分別于轉(zhuǎn)染后12、24、36和48 h測(cè)定吸光度(A)值；根據(jù)測(cè)得的A值繪制生長曲線。

1.2.3 RNA提取及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 所有樣本用液氮在研缽中研磨，用TRzol提取總RNA，并通過酶標(biāo)儀測(cè)RNA濃度，A260/A280為1.8～2.0；將RNA樣本稀釋成2 ng/μl,按照說明書配置成15 μl的逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)；取其中2 μl作為模板配置成20 μl體系進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證；反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后得到各個(gè)標(biāo)本和內(nèi)參GAPDH的Ct 值。計(jì)算公式為ΔCt=Ct-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt(T)-ΔCt(N)，相對(duì)表達(dá)計(jì)算公式為2-ΔΔCt。定量引物均購自QIAGEN公司, 序列為Runx2上游引物：5′-GACCAGTCTTACCCCTCCTACC-3′,Runx2下游引物：5′-CTGCCTGGCTCTTCTTACTGAG-3′；GAPDH上游引物：5′-GAGAGACCCCACTTGCTGCCA-3′,GAPDH下游引物：5′-CTCACACTGCCCCTCCCTGGT-3′。

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù) 以每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；向細(xì)胞轉(zhuǎn)染100 nmol/L的miR-592 mimics或100 nmol/L的Runx2 siRNA，以隨機(jī)的mimic作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，序列如前所述；48 h后用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌3次；按說明書操作進(jìn)行PI/Annexin V染色細(xì)胞，避光染色20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 加入200 μl RIPA 緩沖液冰上20 min裂解細(xì)胞；加入50 μl 5X SDS-PAGE上洋緩沖液，煮沸10 min后進(jìn)行SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜，10%BSA溶液封閉，加入稀釋好的抗體工作液，4 ℃過夜孵育，TBST洗膜3次；再加入HRP標(biāo)記的抗人IgG二抗，TBST洗膜3次后加上化學(xué)發(fā)光底物，于暗室內(nèi)壓片、曝光、顯影和定影。

1.2.6 熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn) 以每孔2.0×105個(gè)293T細(xì)胞接種于24孔板；培養(yǎng)24 h后用lipofectamine2000將報(bào)告質(zhì)粒和miR-592 過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞，并同步共轉(zhuǎn)入pRL-TK作為對(duì)照質(zhì)粒，用量分別為報(bào)告質(zhì)粒0.4 μg，miR-592過表達(dá)質(zhì)粒0.4 μg，pRL-TK質(zhì)粒0.05 μg；轉(zhuǎn)染后6 h換完全培養(yǎng)基，48 h后去上清，用PBS洗滌而得干凈的上清，隨后用lysis buffer冰上裂解細(xì)胞，收集上清用于熒光素酶活性檢測(cè)(試劑盒購自于Promega)。計(jì)算方法為熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶讀值/海腎熒光讀值。

1.2.7 裸鼠腫瘤模型建立 購買8周齡的BALB/c (nu/nu)裸鼠(上海斯萊克)，隨機(jī)分成3組，每組各5只；分別皮下接種miR-592穩(wěn)定表達(dá)的U251細(xì)胞、Runx2 siRNA穩(wěn)定表達(dá)的U251細(xì)胞(細(xì)胞系均由上海吉?jiǎng)P基因公司制備)，以正常U251細(xì)胞作為對(duì)照，細(xì)胞接種量均為6.0×106/只；于接種后每隔5 d游標(biāo)卡尺測(cè)定腫瘤大小，以1/3×長徑×短徑2計(jì)算腫瘤體積，并于接種后第50 d處死小鼠，繪制腫瘤生長曲線。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-592促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡

定量PCR分析顯示miR-592在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的相對(duì)表達(dá)水平明顯下降(圖1)。過表達(dá)miR-592能明顯抑制U251細(xì)胞生長。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)U251細(xì)胞的凋亡率檢測(cè)顯示miR-592能顯著上調(diào)細(xì)胞凋亡率(圖1，表1)。

2.2 Runx2是miR-592在U251細(xì)胞中的直接靶分子 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-592能直接靶向Runx2的3’-UTR。熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)也顯示miR-592顯著抑制帶有Runx2的3’-UTR的熒光素酶的活性(圖2)。定量PCR分析顯示Runx2的相對(duì)表達(dá)在腫瘤組織中明顯上調(diào)(圖2)。western blot的方法顯示miR-592抑制Runx2的蛋白水平(圖2)。

表1 各組U251細(xì)胞凋亡率，%)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

圖1 miR?592促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡 A為miR?592在腫瘤和癌旁組織中的表達(dá)水平；B為轉(zhuǎn)染mimics后miR?592的表達(dá)水平；C為MTT檢測(cè)U251細(xì)胞生長；D為流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR?592過表達(dá)后U251細(xì)胞周期

圖2 Runx2是miR?592在U251細(xì)胞中的直接靶蛋白 A為熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)；B為定量檢測(cè)Runx2在腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)水平；C為Runx2在轉(zhuǎn)染miR?592和NC后U251細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.3 下調(diào)Runx2表達(dá)水平抑制U251細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡 顯示轉(zhuǎn)染了Runx2 siRNA的細(xì)胞生長明顯較對(duì)照組慢(圖3)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)顯示，Runx2下調(diào)表達(dá)上調(diào)U251細(xì)胞的凋亡率(圖3和表2)。

圖3 下調(diào)Runx2促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡 A為westernblot驗(yàn)證siRNA下調(diào)效率；B為MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Runx2下調(diào)后細(xì)胞生長情況；C為流式細(xì)胞儀分析Runx2下調(diào)后細(xì)胞凋亡率

表2 轉(zhuǎn)染siRunx2的U251細(xì)胞的凋亡率,%)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4 miR-592通過靶向Runx2調(diào)控U251的腫瘤的生長 通過繪制腫瘤的生長曲線發(fā)現(xiàn)，miR-592過表達(dá)明顯抑制腫瘤的生長(圖4)。Runx2的下調(diào)表達(dá)也明顯抑制腫瘤的生長(圖4)。

圖4 miR?592靶向Runx2抑制U251腫瘤的生長

3 討 論

microRNA是一類長度約為22個(gè)堿基的非編碼RNA。雖然microRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的總體數(shù)量很少，但是它們卻調(diào)節(jié)了大約30%的基因。microRNA通過靶向目的分子的3’-UTR來調(diào)節(jié)mRNA的水平，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)水平[8-9]。諸多文獻(xiàn)報(bào)道指出microRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著各種各樣非常重要的作用[10-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-592在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。合成miR-592的mimics并轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞來過表達(dá)miR-592，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-592顯著抑制細(xì)胞生長。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，過表達(dá)miR-592上調(diào)U251細(xì)胞的凋亡率。這些結(jié)果表明，miR-592在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮著腫瘤抑制基因的功能。

Runx2是Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員[14]，它可以形成核心結(jié)合因子(CBF)復(fù)合物結(jié)合到DNA序列上，從而達(dá)到對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用[15]。越來越多的研究表明Runx2在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤中都有表達(dá)。Runx2的高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和浸潤[16]，而下調(diào)Runx2的表達(dá)又可以抑制腫瘤的生長和發(fā)生發(fā)展[17]。這些結(jié)果表明Runx2發(fā)揮著腫瘤抑制因子的功能。應(yīng)用熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-592能直接和Runx2的UTR結(jié)合。在腫瘤組織中Runx2的表達(dá)也明顯上調(diào)，western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示過表達(dá)miR-592的U251細(xì)胞的Runx2的表達(dá)水平明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明，Runx2是miR-592在U251細(xì)胞中的直接靶分子。

為了進(jìn)一步研究Runx2是否是miR-592在U251細(xì)胞中的功能性靶分子，本研究通過siRNA特異性的沉默Runx2的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)Runx2顯著抑制U251細(xì)胞的生長，其凋亡水平也明顯上調(diào)。這個(gè)結(jié)果表明，Runx2是miR-592在U251細(xì)胞中的功能性靶蛋白。

綜上所述，miR-592通過直接靶向Runx2促進(jìn)凋亡來抑制U251細(xì)胞生長。

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(2016-11-13收稿)

The miR-592 suppresses U251 cell apoptosis by targeting Runx2

JiWenyu,CaiNing,YangSipei.

DeapartmentofFirstPediatricSurgery，TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Wulumuqi830054

Objective To investigate the effect of miR-592 on U251 cell apoptosis in the Glioma.Methods The expression of miR-592 was analyzed by quantitative PCR in Glioma tissues from patients. Next, U251 cells were transfected with miR-592 mimics and then the growth of cells was detected by MTT assay. To extensively explore the direct target of miR-592 in glioma, dual-luciferase reporter assay and western blot assay were performed to confirm that Runx2 is the direct target of miR-592 in U251 cells. In order to test whether Runx2 was the functional target of miR-592, the cell growth curve was determined by down-regulating the level of Runx2. Moreover, the apoptosis of U251 was also detected after Runx2 knocking down.Results The expression of miR-592 was significantly reduced in glioma tissues. Over-expression miR-592 remarkably increased the apoptotic rate of U251 cells. Dual-luciferase reporter assay indicated that Runx2 was the direct target of miR-592 in U251 cells. Suppressed expression of Runx2 by siRNA prominently suppressed U251 cell growth and induced the cell apoptotic rate.Conclusion miR-592 suppressed the growth and promoted the apoptotic rate of U251 cells by targeting Runx2.

Glioma MicroRNA miR-592 U251 Apoptotic rate

830054 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒外一科(吉文玉)；新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)外科(蔡寧)；蘇州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(楊思培)

R739.41

A

1007-0478(2017)04-0319-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.04.010