李丹 卞冰陽 吳丹 馬洪濤 張秀梅

一種觀測腦疾病狀態(tài)下膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)的鈣成像技術(shù)

李丹 卞冰陽 吳丹 馬洪濤 張秀梅

目的 探討應(yīng)用廣視野鈣成像技術(shù)觀測神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)。方法 采用對流強(qiáng)化法對麻醉雄性大鼠的新皮層進(jìn)行鈣染料染色，應(yīng)用廣視野鈣成像技術(shù)觀測藥物誘導(dǎo)的急性癲癇模型中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)。結(jié)果 鈣成像的光學(xué)腦電圖顯示癲癇時(shí)的神經(jīng)活動(dòng)為快速傳播的波，其傳播范圍僅限于致癇灶處，而膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)由癲癇起源觸發(fā)，但是表現(xiàn)為慢速傳播的定型波，其傳播范圍超出神經(jīng)活動(dòng)范圍。結(jié)論 廣視野鈣成像技術(shù)更有效地觀測神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)并區(qū)別神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)。

鈣敏感性染料 廣視野鈣成像 膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)元 癲癇

腦組織是由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為腦功能主要由神經(jīng)元行使，而膠質(zhì)細(xì)胞主要行使支持和營養(yǎng)作用。直到近年來，膠質(zhì)細(xì)胞的功能才逐漸被大家認(rèn)識(shí)，其在維持神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境穩(wěn)定，調(diào)節(jié)大腦功能方面起到重要作用[1-6]。很多腦部疾病都是與膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)異常分不開的，但是現(xiàn)有的腦功能記錄方法主要是為記錄神經(jīng)元活動(dòng)設(shè)計(jì)，對于膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)的記錄方法相對缺乏。神經(jīng)元的活動(dòng)主要表現(xiàn)為膜電位的變化，其動(dòng)作電位發(fā)放時(shí)產(chǎn)生的膜電位可以達(dá)到幾十毫伏，而膠質(zhì)細(xì)胞膜電位變化僅有1～7個(gè)毫伏[7]，而且膜電位變化為低頻范圍內(nèi)，因此很難被傳統(tǒng)的電生理學(xué)方法(例如腦電圖)記錄。一些基于神經(jīng)血管偶聯(lián)機(jī)制的腦功能成像方法例如功能核磁成像(fMRI)、正電子斷層掃描技術(shù)(SEMPT)、擴(kuò)散光學(xué)層析成像(DOT)以及基于內(nèi)源信號(hào)的光學(xué)成像通過不同的方式檢測腦組織內(nèi)部的血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化來反映腦組織的神經(jīng)活動(dòng)，但是膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)血管偶聯(lián)過程中的作用還不明晰，因此不能作為膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)的記錄方式。

鈣離子濃度變化是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)的特征標(biāo)志。近年來，鈣染料的發(fā)展為記錄神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)提供了便利。尤其在雙光子顯微鏡的幫助下可以同時(shí)記錄小范圍內(nèi)的每一個(gè)細(xì)胞的鈣活動(dòng)[8-10]，但是對于大面積腦組織中的膠質(zhì)細(xì)胞的同步記錄方式還比較缺乏。為了解決這個(gè)問題，本研究建立了應(yīng)用廣視野鈣成像技術(shù)來同步記錄幾平方厘米內(nèi)的神經(jīng)元或者膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)，并在大鼠癲癇模型中驗(yàn)證該方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物準(zhǔn)備

所有的實(shí)驗(yàn)步驟都是經(jīng)過吉林大學(xué)的動(dòng)物管理協(xié)會(huì)同意；成年雄性大鼠(200～350 g)通過呼吸異氟醚麻醉，異氟醚的混合在70%氮?dú)馀c30%氧氣的混合氣體中，誘導(dǎo)麻醉的濃度為4%，維持麻醉的濃度為1.5%～2%；大鼠體溫用電熱毛毯維持在37 ℃；實(shí)驗(yàn)過程中大鼠心跳、血氧含量和 呼出二氧化碳含量被小動(dòng)物二氧化碳監(jiān)測儀(Surgivent, Waukesha, WI)實(shí)時(shí)監(jiān)測，并且維持在穩(wěn)定的狀態(tài) (心率250～300次/min,血氧含量>90%,呼出二氧化碳含量25～28 mmHg)；麻醉后大鼠的頭被固定在立體定位支架上。

1.2 鈣敏感性染料染色

鈣染料(Oregon Green 488 BAPRA-1 AM)(OGB-1, Life Technologies, Grand Island, New York)采用對流強(qiáng)化法注射到大鼠新皮層中[11]，可以連續(xù)地分布到8 mm直徑的腦組織中；對流增強(qiáng)技術(shù)應(yīng)用采用1次長時(shí)間連續(xù)注射染料，與常用的多點(diǎn)微量注射相比[12]，這種染色效果更連續(xù)；染色后在頭骨上打開1個(gè)5 mm×8 mm的骨窗，位于前囟和人字縫之間，暴露出的腦組織用硅油覆蓋以防止水分散失。

1.3 癲癇模型和電生理記錄

急性癲癇模型由局部注射4-Aminopyridine (4-AP, Sigma-Aldrich, 15 mM, 0.5 μL)產(chǎn)生；玻璃電極內(nèi)灌注4-AP溶液，插入皮層300～500 μm，用微量注射裝置注射到皮層內(nèi)；注射后這根電極被用來記錄場電位變化[13]；場電位被放大1000倍，通過1～500 Hz濾波后輸入模數(shù)轉(zhuǎn)換裝置，被計(jì)算機(jī)以1000 Hz的頻率記錄 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK)。

1.4 光學(xué)記錄

對于廣視場光學(xué)記錄，采用CCD照相機(jī)(Dalsa camera in Imager 3001, Optical Imaging, Rehovot, Israel) 和2個(gè)50 mm×50 mm背對背串聯(lián)照相機(jī)鏡頭來進(jìn)行記錄；1個(gè)(470±10)nm的LED作為鈣敏感染料OGB-1的照明源，照明光通過光導(dǎo)纖維束傳導(dǎo)到皮層；鈣敏感染料的熒光通過一塊510 nm長通濾光片過濾后被CCD相機(jī)記錄(圖1)；照相機(jī)的時(shí)間分辨率為110 Hz，而每個(gè)像素的空間分辨率為50 μm×50 μm。

圖1 鈣成像實(shí)驗(yàn)裝置 鈣成像的照明由光電二極管提供，通過470nm濾光片過濾后由兩束光導(dǎo)纖維引導(dǎo)到皮層；熒光由2個(gè)背對背的照相機(jī)鏡頭收集，通過510nm長波長濾光片后由照相機(jī)記錄

1.5 數(shù)據(jù)記錄及分析

采用自行編寫的MATLAB 程序分析數(shù)據(jù)，應(yīng)用1個(gè)3×3像素的空間濾波來進(jìn)一步提高信噪比；光記錄數(shù)據(jù)用1Hz高通和低通濾波來分離神經(jīng)活動(dòng)和膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)；高頻組分的波形與場電位的波形相似，主要反映神經(jīng)纖維(突觸前軸突電位)和細(xì)胞體的動(dòng)作電位活動(dòng)[8]，而低頻成分主要反映膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)[11,14-15]。

2 結(jié) 果

局部注射4-AP幾分鐘后可以在場電位上記錄到癲癇發(fā)放，其特征為1個(gè)高幅的(1 mV)前導(dǎo)波，而后連接低幅高頻波，并逐漸演化為棘慢波；在2次癲癇發(fā)作之間可以記錄到簡短的間期發(fā)放(圖2)。

2.1 癲癇期間的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)

分頻濾波所得到的高頻(神經(jīng)信號(hào))與低頻組分(膠質(zhì)細(xì)胞)的波形差異很大；在癲癇灶中心高頻組分表現(xiàn)為小幅度的間期發(fā)放而后伴隨著癲癇發(fā)放，其波形與LFP的波形相似，而低頻信號(hào)(膠質(zhì)細(xì)胞)表現(xiàn)為緩慢的波形；每次膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)都明顯地伴隨著癲癇發(fā)放；在外周雖然前導(dǎo)波可以傳播到外周，但是后續(xù)的癲癇發(fā)放依舊只是集中在癲癇灶中心區(qū)域；外周的神經(jīng)發(fā)放與癲癇灶中心發(fā)放的時(shí)間不相關(guān)；在外周的膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)明顯比癲癇灶中心的活動(dòng)起源晚(圖2)。

2.2 癲癇狀態(tài)下神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的空間分布

應(yīng)用廣視野鈣成像技術(shù)可以評估神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)的空間分布。神經(jīng)活動(dòng)包括快速傳播的波，傳播范圍相對穩(wěn)定，局限于癲癇灶中心。與神經(jīng)元不同，膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)是一種慢波，從致致癇灶中心起源，向周圍區(qū)緩慢傳播，遠(yuǎn)超出神經(jīng)活動(dòng)的范圍(圖3)，而且膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)表現(xiàn)出一種全或無的事件；此外，神經(jīng)活動(dòng)的時(shí)程也不同，神經(jīng)元活動(dòng)大約長35 s而膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)大約24 s。

圖2 間期發(fā)放和癲癇發(fā)作的局部場電位(LFP)和鈣信號(hào)記錄 左圖為記錄的視場和4?AP/LFP記錄電極的位置。右圖為間期發(fā)放和癲癇發(fā)作的LFP記錄和鈣信號(hào)的波形。鈣信號(hào)可以分為高頻(HF)和低頻(LF)信號(hào)；致癇灶處(藍(lán)色)的高頻鈣信號(hào)與場電位記錄十分相似，可以作為光學(xué)腦電圖記錄；在致癇灶內(nèi)可以記錄到間期發(fā)放和癲癇發(fā)作；癲癇發(fā)作表現(xiàn)為1個(gè)高幅度波而后跟隨低幅高頻波，而低頻信號(hào)主要反映膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)，表現(xiàn)為1個(gè)慢波。且這個(gè)慢波是伴隨癲癇發(fā)作的；在周圍的正常腦組織中(紅色)間期發(fā)放表現(xiàn)為高幅度的窄波形，而在癲癇發(fā)作期間神經(jīng)活動(dòng)的頻率上升，但是并不是完全的癲癇發(fā)放，低頻的膠質(zhì)細(xì)胞起源明顯滯后于致癇灶區(qū)域

3 討 論

采用對流強(qiáng)化法對大鼠新皮層進(jìn)行鈣染色，并應(yīng)用廣視野光學(xué)記錄技術(shù)來記錄神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)。本研究利用大鼠急性癲癇模型對該方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其靈敏度足以記錄間期發(fā)放和癲癇發(fā)作的起源和傳播過程。在癲癇發(fā)作過程中膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的的活動(dòng)在空間上不匹配。傳統(tǒng)的在體鈣染色中常用多點(diǎn)式小劑量注射[12]，因此容易導(dǎo)致染色不均勻，而對流染色法有效地解決了這個(gè)問題，可以連續(xù)地染色整個(gè)新皮層，對于大范圍腦功能記錄尤其有效[11]。以前的研究應(yīng)用雙光子成像技術(shù)對神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的記錄中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核的鈣信號(hào)的上升和下降的斜率不同，神經(jīng)元的鈣信號(hào)變化快而膠質(zhì)細(xì)胞的鈣信號(hào)變化慢[14-15]。本試驗(yàn)記錄的神經(jīng)活動(dòng)主要是突觸前軸突活動(dòng)和胞體的動(dòng)作電位[8]，可以根據(jù)這些明確定義并公認(rèn)的頻率標(biāo)準(zhǔn)來區(qū)別神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的活動(dòng)。

圖3 癲癇發(fā)作時(shí)的高頻(神經(jīng)活動(dòng))和低頻(膠質(zhì)細(xì)胞)信號(hào)的空間分布 A為光記錄的視場，并且標(biāo)注了4?AP注射和場電位電極的位置；藍(lán)色的方格標(biāo)注鈣信號(hào)記錄的位置。B為癲癇發(fā)放中高頻(HF)和低頻(LF)信號(hào)的空間傳播；每幅圖之間的空間間隔為6s。(Ⅰ)低頻膠質(zhì)細(xì)胞的空間傳播。膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)起源于致癇灶而后傳播到整個(gè)半球，其傳播速度很低，需要18s才能擴(kuò)散到整個(gè)半球；(Ⅱ)高頻神經(jīng)活動(dòng)的空間傳播。神經(jīng)信號(hào)也起源于致癇灶中心，但是并不向外界擴(kuò)散；(Ⅲ)膠質(zhì)細(xì)胞(綠色通道)和神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)(紅色通道)的空間重疊。膠質(zhì)細(xì)胞明顯傳播的比神經(jīng)元的范圍大

3.1 神經(jīng)元活動(dòng)的鈣成像

雖然只對癲癇樣活動(dòng)做了淺顯的研究，但是得到的結(jié)果揭示一些很有趣的現(xiàn)象。從神經(jīng)纖維的活動(dòng)看，間期發(fā)放和癲癇發(fā)作過程中致癇灶和周圍的腦區(qū)之間存在動(dòng)態(tài)的聯(lián)系；間期發(fā)放中鈣記錄顯示神經(jīng)活動(dòng)并不是從致癇灶內(nèi)部起源，而是從周圍正常腦組織區(qū)域起源，而以前的電記錄中由于空間覆蓋率的限制，并沒有觀察到間期發(fā)放起源的具體細(xì)節(jié)，這也是光學(xué)腦電圖優(yōu)于傳統(tǒng)電記錄的方面；在癲癇發(fā)放中鈣記錄顯示神經(jīng)活動(dòng)為快速傳播的波浪活動(dòng)，與之前的電壓敏感性染料的記錄相同[16]。這些波并沒有傳播到整個(gè)新皮層，而只是限制在致癇灶區(qū)域內(nèi)；在周圍的皮層區(qū)域中神經(jīng)活動(dòng)雖有加強(qiáng)，但是并不與癲癇活動(dòng)同步，也許是周圍的活動(dòng)的增強(qiáng)可以抑制致癇灶中心區(qū)域的神經(jīng)活動(dòng)，進(jìn)而終止癲癇。

3.2 膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)的鈣成像

膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)表現(xiàn)為定型的傳播波，由癲癇活動(dòng)出發(fā)，并且源于致癇灶內(nèi)部，但是傳播的很遠(yuǎn)。類似的膠質(zhì)細(xì)胞的鈣活動(dòng)在正常的腦組織中是通過間隙連接傳播的[17]。膠質(zhì)細(xì)胞曾被認(rèn)為是神經(jīng)血管偶聯(lián)中的重要環(huán)節(jié)，但是在本試驗(yàn)記錄中膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)的傳播范圍明顯超出致癇灶的范圍，這種空間的不吻合對膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)血管偶聯(lián)過程中的作用產(chǎn)生懷疑。最近一些離體腦片試驗(yàn)也對膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)血管偶聯(lián)過程中的功能產(chǎn)生質(zhì)疑[18-20]。

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(2016-11-25收稿)

Using calcium imaging to record glia activity in brain diseases

LiDan，BianBingyang,WuDan,etal.

DepartmentofRadiology，TheFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130000

Objective To record the neuronal and glial activity with wide-field calcium imaging.Methods Using convection-enhanced delivery based staining method, the rat neocortex was stained with calcium dyeinvivo. The neuronal and glial activity in an acute pharmacologic model of neocortical seizures was imaged.Results Optical calcium-based ECoG maps revealed that neuronal waves propagated rapidly and remained mostly confined to the seizure focus. Glial waves were triggered by ictal onset but propagated slowly in a stereotypical fashion far beyond the seizure focus.Conclusion Wide-field calcium imaging was more effective in observing the activity of neurons and glias and distinguishing between neurons and glial cells from the network activities.

Calcium sensitive dye Wide-field calcium imaging Glia Neuron Seizure

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)為20160414006GH)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)為20110462)

130000 長春，吉林大學(xué)第一醫(yī)院放射科[李丹 卞冰陽 吳丹 張秀梅(通信作者)]；美國康奈爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科(馬洪濤)

R742

A

1007-0478(2017)04-0286-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.04.003