朱小語，陳曉文，許 丹，律 穎，許雅君，2

(1 北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191；2食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

聯(lián)合補(bǔ)充維生素D、膠原肽和鈣對(duì)成骨細(xì)胞發(fā)育的影響

朱小語1，陳曉文1，許 丹1，律 穎1，許雅君1，2

(1北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191；2食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

目的：觀察聯(lián)合補(bǔ)充維生素D、膠原肽和鈣對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖及對(duì)骨保護(hù)素細(xì)胞內(nèi)核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)、骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)基因表達(dá)的影響。方法：α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞。檢測(cè)Ca2+(20 μg/mL)、維生素D(0、10-12、10-11mol/L)、膠原肽(0、50、100μg/mL)三者交互作用劑量對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的作用及RANKL、OPG mRNA表達(dá)。結(jié)果：維生素D、膠原肽和鈣交互劑量作用下細(xì)胞增殖水平無明顯差異。維生素D聯(lián)合鈣能夠明顯降低RANKL mRNA表達(dá)水平，提高OPG mRNA表達(dá)水平，降低RANKL/OPG比值。而膠原肽聯(lián)合鈣對(duì)RANKL以及 OPG mRNA表達(dá)無明顯影響。結(jié)論：維生素D聯(lián)合鈣可通過抑制小鼠成骨細(xì)胞RANKL mRNA表達(dá)、促進(jìn)OPG mRNA表達(dá)，從而促進(jìn)骨的形成，抑制骨的吸收。維生素D和鈣聯(lián)合補(bǔ)充膠原肽，對(duì)成骨細(xì)胞RANKL，OPG mRNA表達(dá)并無明顯影響。

MC3T3-E1；維生素D；膠原肽；RANKL；OPG

骨質(zhì)疏松癥作為常見慢性非傳染性疾病，已成為全球主要公共衛(wèi)生問題[1]。骨的發(fā)育受骨形成和骨吸收雙向影響，并在多種代謝通路調(diào)節(jié)下維持平衡和穩(wěn)定。維生素D、膠原肽和鈣作為維持機(jī)體健康的重要營養(yǎng)物質(zhì)，在骨骼發(fā)育上起到至關(guān)重要的作用[2]。聯(lián)合補(bǔ)充維生素D和鈣，具有預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用[3-4]。同時(shí)，膠原肽在促進(jìn)鈣磷等礦物質(zhì)吸收和調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要作用[5-6]。體外試驗(yàn)表明，單獨(dú)補(bǔ)充小分子肽類，能夠通過調(diào)節(jié)骨保護(hù)素/核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子配體系統(tǒng)，間接抑制破骨細(xì)胞數(shù)量及功能[7]。聯(lián)合補(bǔ)充小分子多肽和鈣，同樣促進(jìn)成骨細(xì)胞OPG mRNA表達(dá)、抑制RANKL mRNA表達(dá)，抑制骨吸收[8]。

然而，目前并未有關(guān)于維生素D、膠原肽和鈣三者聯(lián)合作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)道。為此，本研究采用體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討?lián)合補(bǔ)充維生素D、膠原肽和鈣三者對(duì)成骨細(xì)胞增殖以及RANKL、OPG基因表達(dá)的影響，為骨質(zhì)疏松臨床干預(yù)研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 受試物

維生素D3：總脫鈣化固醇，購自Sigma公司，批號(hào)47763；膠原肽：Peptan水解膠原肽，平均分子量2 000D；鈣：氯化鈣，Sigma公司購得，批號(hào)C7902-500G。

1.2 儀器與試劑

Real time PCR儀(CFX9600，Bio-Rad，美國)、酶標(biāo)儀(DNM-9602G，北京普朗技術(shù)有限公司)、MC3T3-E1細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)、Maxima SYBR Green/Rox qPCR Master Mix(Fermentas，K0222)、TRIzol(Invitrogen，15596018)、α-MEM(Hyclone，SH3026501B)、FBS(Sciencell，0510-500ML)、青霉素-鏈霉素溶液(Beyotime，C0222)、DMSO(Applichem，A3672.0100)、MTT(beyotime，C0009)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠MC3T3-E1細(xì)胞在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37°C、5%CO2的體積分?jǐn)?shù)的孵育箱中孵育。每2天更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞基本融合后傳代。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖分化能力，以7×103細(xì)胞/孔密度接種至96孔板中，每孔200μL，孵育16h后，吸棄培養(yǎng)液，各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入受試物200μL，終質(zhì)量濃度如表1。孵育箱培養(yǎng)24h，每孔加入MTT液20μL，繼續(xù)孵育4h后輕輕吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO，水平搖勻，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm波長處測(cè)定各孔吸光度值，結(jié)果以O(shè)D490表示。

表1 各組受試物劑量

1.5 RANKL和OPG基因表達(dá)水平檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)72h干預(yù)后將其裂解，受試物終質(zhì)量濃度同表1，Trizol法提取細(xì)胞總mRNA。用Maxima SYBR Green試劑盒將總mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，而后采用real-time PCR法檢測(cè)RANKL、OPG基因表達(dá)水平，GAPDH為參照基因。各組各基因樣本重復(fù)3次，25ul體系進(jìn)行試驗(yàn)，基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。成骨細(xì)胞目的基因引物序列如表2所示。

表2 成骨細(xì)胞中目的基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

如圖1所示，維生素D、膠原肽和鈣三者交互作用干預(yù)下，隨著受試物劑量的增加，成骨細(xì)胞增殖作用數(shù)值有上升趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 維生素D、膠原肽和鈣對(duì)細(xì)胞增殖率的影響

2.2 RANKL和OPG基因表達(dá)水平檢測(cè)

表3為各劑量組RANKL/OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值，圖3分別列出維生素D基因表達(dá)水平[圖2(1)、(3)、(4)]，以及膠原肽基因表達(dá)水平[圖2(2)、(5)、(6)]。圖2(3)可見，與對(duì)照組相比10-12mol/L和10-11mol/L劑量組維生素D，RANKL mRNA表達(dá)水平明顯降低；圖2(4)可見，與空白對(duì)照組相比，維生素D 10-12mol/L和10-11mol/L劑量組OPG mRNA表達(dá)水平明顯增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且在維生素D的干預(yù)下，與對(duì)照組相比各劑量組的RANKL/OPG比值明顯下降。

然而，膠原肽50μg/mL和100μg/mL劑量組在RANKL mRNA表達(dá)水平，OPG mRNA表達(dá)水平以及RANKL/OPG比值上與對(duì)照組均無明顯差別，如圖2(2)、(5)、(6)所示。

表3 維生素D、膠原肽和鈣對(duì)RANKL/OPG mRNA表達(dá)量的影響

MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)基在添加鈣的基礎(chǔ)上，加入不同劑量濃度的維生素D與膠原肽，以觀察二者對(duì)于骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響。維生素D與膠原肽在兩因素兩水平交互作用分析中交互作用有意義，而二者單獨(dú)作用顯示維生素D的單獨(dú)效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，膠原肽的單獨(dú)效應(yīng)差異不顯著。如圖3(1)所示，隨維生素D劑量的增加，RANKL/OPG比值呈降低趨勢(shì)，而3(2)中隨著膠原肽劑量的增加，RANKL/OPG比值并無明顯統(tǒng)一的變化趨勢(shì)。

3 討論

骨代謝在骨形成和骨吸收過程中維持動(dòng)態(tài)平衡，BMP/Smads、Wnt/β-catenin、RANKL/RANK/OPG、TGF-β、FGF、PDGF、Akt2等信號(hào)系統(tǒng)均在骨代謝過程中起到重要的信號(hào)調(diào)節(jié)作用[9-10]。其中，RANKL/RANK/OPG信號(hào)系統(tǒng)作為影響骨吸收的重要通路，參與到骨重建過程當(dāng)中[11]。

圖2 維生素D、膠原肽和鈣對(duì)成骨細(xì)胞骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖3 維生素D、膠原肽和鈣對(duì)RANKL/OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量的交互作用影響

本研究以不同劑量濃度的膠原肽、維生素D聯(lián)合鈣干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞，測(cè)定RANKL、OPG mRNA表達(dá)水平，RT-PCR結(jié)果表明，維生素D和膠原肽具有交互作用，可以在聯(lián)合鈣的基礎(chǔ)上有效降低RANKL/OPG比值。單獨(dú)效應(yīng)中，維生素D與鈣聯(lián)合，OPG mRNA表達(dá)明顯增加，RANKL mRNA表達(dá)顯著降低。而膠原肽與鈣聯(lián)合，對(duì)RANKL和OPG mRNA表達(dá)均無明顯影響。維生素D作用結(jié)果同李長春等人關(guān)于1，25(OH)2D3誘導(dǎo)體外細(xì)胞成骨分化研究結(jié)果一致，表明維生素D與鈣聯(lián)合作用，可能與調(diào)節(jié)維生素D受體表達(dá)，間接影響RANKL、OPG基因的表達(dá)有關(guān)[12]。此外，Erin Gaffney-Stomberg[13]等人在對(duì)440名志愿者進(jìn)行的隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合補(bǔ)充維生素D和鈣可通過調(diào)節(jié)鈣敏感受體和甲狀旁腺素水平，有效降低RANKL/OPG基因表達(dá)水平，將本細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果在人群實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。然而，膠原肽與鈣的聯(lián)合作用結(jié)果同魏麗[8]等人的研究并不一致，膠原肽對(duì)RANKL、OPG基因表達(dá)的作用并不明顯，可能與聯(lián)合作用劑量有關(guān)，仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

維生素D與鈣聯(lián)合作用，可通過影響RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)平衡，抑制成骨細(xì)胞RANKL mRNA表達(dá)、促進(jìn)OPG mRNA表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞分化，抑制骨吸收。維生素D和鈣聯(lián)合補(bǔ)充膠原肽，對(duì)成骨細(xì)胞RANKL、OPG mRNA表達(dá)并無明顯影響。◇

[1]Golob AL，Laya MB.Osteoporosis：screening，prevention，and management.[J].Med Clin North Am，2015(99)：587-606.

[2]Beto JA.The role of calcium in human aging.[J].Clinical Nutritional Research，2015(4)：1-8.

[3]Boonen S，Lips P，Bouillon R，et al.Need for additional calcium to reduce the risk of hip fracture with vitamin D supplementation：evidence from a comparative meta-analysis of randomized controlled trials[J].Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，2007(92)：1415-1423.

[4]Lips P，Gielen E，van Schoor NM.Vitamin D supplements with or without calcium to prevent fractures.BoneKEy Reports，2014(512)：1-6.

[5]Guillerminet F，Beaupied H，et al.Hydrolyzed collagen improves bone metabolism and biomechanical parameters in ovariectomized mice：An in vitro and in vivo study.[J].Bone，2010(46)：827-834.

[6]Xu Y，Han X，Li Y.Effect of marine collagen peptides on long bone development in growing rats.[J].J Sci Food Agric，2010(90)：1485-91.

[7]吳昆鵬，楊巧珠，等.小分子肽對(duì)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1骨保護(hù)素和核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子配體表達(dá)的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(24)：4375-4378.

[8]魏麗，劉盟，等.蓇密鈣片與馬鹿角多肽對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的研究[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2010，6(8)：563-570.

[9]熊燕琴，周筠，等.骨代謝信號(hào)通路的研究進(jìn)展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2014，20(2)：200-204.

[10]曾羿，沈彬.分子信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松防治中的研究進(jìn)展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2014，20(3)：305-309.

[11]Boyce BF，Xing L.Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling[J].Arch Biochem Biophys，2008(473)：139-46.

[12]李長春，孫蓮蓮，等.1，25(OH)2D3在牙乳頭干細(xì)胞成骨分化中的作用[J].天津醫(yī)藥，2014，42(5)：421-423.

[13]Erin Gaffney-Stomberg，Laura J.Lutz，et al.Calcium and vitamin D supplementation maintains parathyroid hormone and improves bone density during initial military training：A randomized，double-blind，placebo controlled trial[J].Bone，2014(68)：45-56.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

Effects of Combined Supplementation of Vitamin D，Collagen Peptides and Calcium on Development of Osteoblasts

ZHU Xiao-yu1，CHEN Xiao-wen1，XU Dan1，LV Ying1，XU Ya-jun1，2
(1Peking University Health Science Center，Beijing 100191，China；2Beijing Key Laboratory of Toxicological Research and Risk Assessment for Food Safety, Beijing 100191, China)

MC3T3-E1；vitamin D；collagen peptide；RANKL；OPG

北京市科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展專項(xiàng)(項(xiàng)目編號(hào)：Z151100001615035)。

許雅君(1976— )，女，博士，教授，研究方向：營養(yǎng)與疾病。

并列第一作者：朱小語(1990— )，女，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與疾??；陳曉文(1989— )，男，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與疾病。