黃 耘 王思力 蘇 蕊 韓明哲

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，福建 廈門 361003)

核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)因子1蛋白與非霍奇金淋巴瘤臨床特征及預(yù)后的關(guān)系

黃 耘 王思力 蘇 蕊 韓明哲

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，福建 廈門 361003)

目的探討核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)因子(ERCC)1蛋白在非霍奇金淋巴瘤(NHL)組織中的表達(dá)與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。方法選擇該院首診的76例NHL患者，取其組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，另選擇同期腫瘤周圍組織清掃的非腫瘤侵襲的淋巴結(jié)增生的12例患者，取其炎癥組織標(biāo)本作為對照組，運(yùn)用免疫組化SP法對ERCC1蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)并分析其與NHL臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果兩組ERCC1蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ERCC1蛋白陽性表達(dá)與性別、年齡、病理亞型、臨床分期、有無B癥狀、乳酸脫氫酶(LDH)水平無關(guān)(P>0.05)，與有無巨大腫塊有關(guān)(P<0.05)；ERCC1蛋白陽性表達(dá)組5年生存率高于陰性表達(dá)組(P<0.05) 。結(jié)論ERCC1蛋白表達(dá)陽性者具有較好的預(yù)后效果。

核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)因子1蛋白；非霍奇金淋巴瘤；免疫組化

淋巴瘤根據(jù)免疫表型及形態(tài)學(xué)特征可分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL)〔1〕。NHL是發(fā)生在B細(xì)胞和T細(xì)胞/自然殺傷細(xì)胞(NK)中的腫瘤，在淋巴瘤中占比約89.10%。細(xì)菌感染、環(huán)境致癌物、免疫缺陷、電離輻射及遺傳均有可能造成DNA的損傷，從而誘發(fā)癌癥〔2〕，而核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)因子(ERCC)1是一種DNA修復(fù)因子，可以修復(fù)DNA損傷，維持并保證基因組的穩(wěn)定和完整，及時(shí)糾正基因突變導(dǎo)致的錯(cuò)誤復(fù)制。本研究運(yùn)用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶鏈接(SP)法，對ERCC1蛋白在NHL組織的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并與腫瘤周圍組織清掃的非腫瘤侵襲的淋巴結(jié)增生的炎癥組織比較，分析其與NHL臨床特征相關(guān)因素及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2006年10月至2011年6月來廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院首診的76例NHL患者，取其NHL組織作為實(shí)驗(yàn)組。NHL組織均經(jīng)病理檢查確診，病例均完成臨床隨訪，且資料完整保存，隨訪時(shí)間截止到2016年6月。生存時(shí)間的起始日期是手術(shù)日期，截止日期是最終隨訪截止日期或因癌癥二次復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及其他原因死亡日期。其中男56例，女20例，年齡40～80〔平均(56.21±15.27)〕歲，其中≤60歲48例，>60歲28例。根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)分類標(biāo)準(zhǔn)〔3〕分為：B細(xì)胞NHL 49例，其中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤29例、濾泡性淋巴瘤6例、套細(xì)胞性淋巴瘤5例、間變性大B細(xì)胞瘤1例，其他分類B細(xì)胞淋巴瘤8例；T細(xì)胞NHL 21例；其他細(xì)胞NHL 6例。根據(jù)Ann Arbor分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期13例，Ⅱ期12例，Ⅲ期19例，Ⅳ期32例。有B癥狀28例，無48例。有巨大腫塊9例，無67例；根據(jù)國際預(yù)后指數(shù)(IPI)分為低危15例，中低危18例，中高危24例，高危19例。根據(jù)乳酸脫氫酶(LDH)情況分為正常36例，升高40例。病例術(shù)前均接受放療治療。另選擇同期腫瘤周圍組織清掃的非腫瘤侵襲的炎癥增生淋巴結(jié)組織標(biāo)本12例作為對照組。男9例，女3例，年齡40～79〔平均(55.35±14.39)〕歲。兩組性別、年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2試劑與儀器 ERCC1單克隆抗體(3A7)(購自Amyjet Scientific Inc)，即用快捷免疫組化MaxvisionTM鼠/兔-辣根過氧化物酶(HRP)光譜檢測試劑盒(購自福建邁新公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(購自福建邁新公司)?？鞠?購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，移液槍(Eppendorf，USA)，輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(購自LEICA公司)，倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71，Japan)，Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(購自北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本制作 將手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的NHL組織標(biāo)本或腫瘤周圍組織清掃的非腫瘤侵襲的炎癥增生淋巴結(jié)組織標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋后由本院病理科存檔。

1.3.2免疫組化SP法 68℃烤片20 min。經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后將切片完全浸泡于水中待用。在37℃下用3%H2O2對切片孵育10 min，以抑制內(nèi)源性過氧化酶活性。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，反復(fù)3次后，轉(zhuǎn)移至0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中煮沸15～20 min，自然冷卻20 min后，采用物理降溫法加快冷卻至室溫，以修復(fù)抗原。PBS沖洗3次，37℃下用羊血清工作液封閉10 min，滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次，滴加二抗，室溫下孵育30 min。PBS沖洗3次，用新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，用自來水沖洗，反藍(lán)。用自來水沖洗后，用蘇木素復(fù)染30 s，常規(guī)脫水、透明及干燥后封片。

1.4結(jié)果判定 若細(xì)胞核中存在明顯的棕黃色顆粒，則可認(rèn)定為陽性細(xì)胞。通過二級(jí)計(jì)分法對陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，鏡下放大400倍后，于每個(gè)組織點(diǎn)隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，記錄每100個(gè)腫瘤細(xì)胞中所含有陽性細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)根據(jù)陽性細(xì)胞比例、陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度判定評分：當(dāng)陽性細(xì)胞比例分別為<5%、5%～25%、26%～50%、>50%，依次計(jì)為0、1、2、3分。陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度按無陽性信號(hào)且無著色、陽性信號(hào)較弱且呈淡黃色的細(xì)顆粒狀、陽性信號(hào)中等呈棕黃色的粗顆粒狀和陽性信號(hào)強(qiáng)烈且呈棕褐色的小塊狀，評分依次為0、1、2、3分。

根據(jù)上述兩項(xiàng)評分之積判定結(jié)果，陰性表達(dá)(-)：著色強(qiáng)度為0分時(shí)且陽性細(xì)胞比<5%；著色強(qiáng)度為1分且陽性細(xì)胞任意比例(0%～100%)。陽性表達(dá)(+)：著色強(qiáng)度2分且陽性細(xì)胞比例≥50%；著色強(qiáng)度3分且陽性細(xì)胞比例≥25%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法；采用GraphPad Prism 5軟件對生存資料進(jìn)行處理分析，采用Kaplan-Meier法及l(fā)ogrank法進(jìn)行生存曲線的繪制。

2 結(jié) 果

2.1兩組ERCC1蛋白表達(dá)情況 ERCC1蛋白在淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核與胞質(zhì)中均有表達(dá)，但以細(xì)胞核表達(dá)為主。細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒則認(rèn)定為陽性細(xì)胞。見圖1。實(shí)驗(yàn)組和對照組ERCC1蛋白陽性表達(dá)率分別為51.32%(39/76)和33.33%(4/12)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.656，P=0.184)。

圖1 ERCC1蛋白在NHL組織中的表達(dá)(SP法，×400)

2.2NHL患者ERCC1蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 ERCC1蛋白陽性表達(dá)與性別、年齡、病理亞型、臨床分期、有無B癥狀、LDH水平指標(biāo)無關(guān)(P>0.05)，與有無巨大腫塊有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 NHL患者ERCC1蛋白陽性表達(dá)與臨床特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3ERCC1蛋白表達(dá)與NHL預(yù)后的關(guān)系 陽性組5年生存率為53.84%(21/39)，中位生存期為67個(gè)月；而陰性組的5年生存率為18.92%(7/37)，中位生存期則為38個(gè)月；兩組生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.954，P=0.002)。見圖2。

圖2 ERCC1蛋白表達(dá)陽性組與陰性組患者的生存曲線

3 討 論

NHL是一種原發(fā)于淋巴結(jié)或其他結(jié)外淋巴組織不同分化階段的異質(zhì)性惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國常見惡性腫瘤中占第8位〔4〕。相關(guān)流行病學(xué)研究顯示〔5〕，30年來NHL在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率幾乎增長了一倍，已達(dá)到20/10萬。調(diào)查顯示，男性相比于女性更易患NHL，且白種人最易患NHL，而后依次為黑色人種、黃色人種及棕色人種〔6〕。雖然NHL在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率高于發(fā)展中國家，但是由于環(huán)境、生活方式等誘發(fā)因素，我國NHL發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，因此NHL的治療已成為我國臨床研究重點(diǎn)。

ERCC1是一種通過融合互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)得到的人類修復(fù)酶，在NER途徑中占據(jù)著限速點(diǎn)和調(diào)定點(diǎn)的重要位置〔7〕。作用機(jī)制可能是ERCC1與XPF結(jié)合形成了具有5′端DNA核酸內(nèi)切酶活性異二聚體，可選擇性切除5′端受損的寡核苷酸鏈，從而在DNA轉(zhuǎn)錄過程中糾正基因錯(cuò)誤復(fù)制，在防止癌變方面有重要作用。ERCC1在正常細(xì)胞中主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，并進(jìn)行低水平的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；在腫瘤細(xì)胞中可分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，并進(jìn)行異常的高表達(dá)與轉(zhuǎn)錄〔8〕。本研究結(jié)果說明巨大腫塊癌變的可能性非常大，若查體時(shí)發(fā)現(xiàn)患者巨大的腫塊則應(yīng)高度懷疑淋巴癌。ERCC1蛋白陽性表達(dá)與性別、年齡、病理亞型等臨床特征無關(guān)，有可能是因入組的研究對象較少而造成的假陰性，因此結(jié)論有待進(jìn)一步的證明。由于樣本來源不同和樣本量大小差異，關(guān)于ERCC1蛋白的表達(dá)情況與NHL預(yù)后關(guān)系的報(bào)道尚存在較大爭議。ERCC1蛋白表達(dá)陽性者具有較好的預(yù)后效果，或與ERCC1蛋白可清除因光污染、化學(xué)致癌物、嘧啶二聚體及其他環(huán)境因素所形成的DNA加合物及鏈間交聯(lián)物有關(guān)。預(yù)后結(jié)果與相關(guān)報(bào)道〔9～11〕有出入，可能是因?yàn)镋RCC1蛋白在不同的腫瘤組織中表達(dá)量和致病機(jī)制不盡相同或者在不同器官中DNA修復(fù)機(jī)制不一致所導(dǎo)致的。應(yīng)該進(jìn)一步縮小抽樣誤差和性別偏倚對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，選擇同一部位的癌癥細(xì)胞進(jìn)行研究，重復(fù)試驗(yàn)。

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〔2017-01-05修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

2014年廈門市科技計(jì)劃科技惠民項(xiàng)目(No.3502Z20144009)

韓明哲(1960-)，男，博士，教授，主要從事造血干細(xì)胞移植研究。

黃 耘(1980-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事惡性淋巴瘤、骨髓瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)17-4196-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.012